第四章　发病机制和病理

汉坦病毒感染的致病机制，目前尚不完全清楚。但越来越多的证据支持“汉坦病毒致病是免疫介导的病理反应”这一假设。根据目前的研究，可归纳为：①病毒特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）对感染的血管内皮细胞的攻击；②感染细胞产生的细胞因子/趋化因子（如TNF-α、IL-6、IL-8、RANTES、IP- 10、MCP- 1等）的作用；③病毒感染对血管内皮细胞功能的影响，如血管生成素和血管内皮生长因子（VEGF）的合成分泌、血管屏障及β3整合素的功能；④其他免疫细胞的作用，如血小板、NK细胞、树突状细胞（DC）和单核巨噬细胞等。由此可见，汉坦病毒感染的发病机制可能是一个多因素的复杂过程。

病毒与细胞膜表面受体结合是病毒感染致病的第一步。病毒受体的种类和分布决定了病毒对细胞的嗜性及局限性。研究病毒受体是了解病毒感染性疾病发病机制的重要内容。近年，汉坦病毒受体研究取得了重要进展，对阐明汉坦病毒致病机制具有重要意义。

近年的研究业已表明在汉坦病毒与内皮细胞相互作用研究中，细胞整合素受体起到了关键性作用。整合素是分布于多种动物细胞表面的一类黏附分子，由跨膜糖蛋白α和β亚单位组成的异源二聚体。依据β亚单位的不同可将整合素分为不同的亚群。非致病性汉坦病毒通过细胞膜上β1整合素感染细胞，而致病性汉坦病毒通过细胞膜上β3整合素感染细胞。β3整合素不仅是致病性汉坦病毒感染的主要受体，而且还参与维持血管屏障功能。因此，β3整合素在汉坦病毒感染入胞及发病中的作用受到越来越多的关注。

β3整合素亚群只有两个成员：αvβ3和αⅡbβ3。这类黏附受体能够介导细胞-细胞、细胞-胞外基质之间的黏附，以及细胞与某些病原体之间的作用。对于维持组织的完整性、促进细胞移动、调节基因表达以及细胞黏附、分化和存活均至关重要。同一种整合素可以表达在多种细胞表面，而同一种细胞也可以表达几种不同的整合素。αvβ3整合素广泛表达于人体的内皮细胞、巨噬细胞、血小板、巨核细胞、单核细胞及某些活化的白细胞、平滑肌细胞、破骨细胞表面，在新生血管内皮细胞中高表达，在静息的内皮细胞表面表达水平相对较低。αⅡbβ3整合素主要表达于血小板及巨核细胞表面，在单核细胞、粒细胞、肥大细胞表面也有表达，在血小板聚集及血栓形成中有重要作用。在静息细胞中该受体受到抑制，但受到凝血酶和（或）血小板激活剂等刺激后，发生活化，介导纤维蛋白原与其配体结合。

β3整合素的α和β亚单位分别由胞外结构域、单一的跨膜结构域和短小的胞内结构域组成。整合素晶状体结构的胞外域非常复杂，静息状态下呈致密的“V”形构象，由一个“头”部和两条弯曲的“腿”组成。α亚单位中的β片层结构域和位于β亚单位中的Ⅰ结构域并排分布，组成了能与含有RGD序列的配体结合的“头部”结构域。β3整合素的两条“腿”，一条由α亚单位中的“Thigh”、“Calf1”和“Calf2”3个结构域组成，另一条由β亚单位中的“Hybrid”、plexin/semaphorin/integrin（PSI）、4个“EGF- like”和1个“β3-尾部”结构域组成。α亚单位的“Thigh”和“Calf1”结构域与β3亚单位的“PSI”和“EGF 1、2”结构域组成了灵活的“膝关节”结构。当整合素与配体结合或活化后，“膝关节”的运动使得整合素由弯曲的低亲和力状态而转变为伸展的高亲和力状态。新近研究证实PSI结构域与其特异性抗体N29或8E3结合能够诱使hybrid和PSI/IEGF1结构域产生远离α亚单位中“膝关节”结构域的运动，而诱发整合素构象和结构域的改变（图4-1）。

既往研究证实β3通过RGD（Arg- Gly- Asp- Arg）或RGD样（Arg-Gly- Asp- Leu）的寡肽识别序列与胞外基质相结合。αⅡbβ3最重要的结合基序是RGD样的KGD和KQAGDV。其配体主要有胶原、变性的胶原、血小板反应素、玻连蛋白、纤连蛋白、血管假性血友病因子、纤溶酶原、凝血素、血小板反应素等。αvβ3的配体主要有玻连蛋白（vitronectin，VN）、纤连蛋白（fibronectin，FN）、层粘连蛋白（laminin，LN）、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）、血小板反应素（thrombospondin，TSP）等。αvβ3与VN结合对维持毛细血管完整性起重要作用，并介导血小板黏附到固相化的VN。除了能特异性地结合含有RGD序列的配体，作为以β3整合素为受体的致病性汉坦病毒、登革热病毒和猪出血热病毒等病原体本身并不含有RGD结构，其与β3整合素的连接通过与PSI结构域相互作用而实现。

整合素受体是胞外基质与细胞骨架相互作用的桥梁。整合素与细胞外配基及细胞骨架的连接介导了胞外、胞内信息的传递。整合素与配体相互作用可激活并调节细胞内信号通路，进而控制转录及其与配体的结合功能。整合素活性的调节涉及复杂的分子机制，包括细胞骨架蛋白、蛋白激酶、磷酸化、小G蛋白以及调节蛋白。整合素的胞浆结构域短小且缺乏酶活性，需与其他的分子组成分子复合物参与信号传递。与其他分子的作用通常是短暂的，这增加了研究的复杂性。整合素传递跨膜双向信号，即outside- in和inside- out信号。在outside- in信号传递通路中配体与整合素胞外域相结合，致使整合素的构象发生改变，并传导信号进入细胞内部。inside- out信号传递通路中起源于细胞表面非整合素受体介导的或是细胞内部的分子活化的信号通路，最终导致了整合素的活化或失活。整合素活性的调节是通过构象的改变或聚集的程度实现的。这两种信号通路并不是截然分开的，而是同时发生并且互相影响。

观察发现很多生长因子介导的信号转导通路都能被整合素活化，整合素的参与对于生长因子介导的生理反应是必不可少的。提示在对细胞功能的调控中，两者之间可能存在相互协调的机制。在内皮细胞，αvβ3通常与受体型酪氨酸激酶VEGFR2（血管内皮生长因子受体2）相互关联。VEGF（血管内皮生长因子）可以诱导αvβ3的表达。同时，αvβ3可以增强VEGFR2的磷酸化水平和对VEGF的敏感性以易于下游分子信号FAK和MAPK/P38的活化。所以分析两者在信号转导途径中的串联作用可能有助于理解胞外刺激所引起的生理反应。

尽管整合素的配体或抗体能抑制汉坦病毒感染，甚至一些抗体的抑制率达95%以上，但仍有一些细胞能被HTNV感染。表明除了整合素外，细胞膜上的一些其他蛋白可能也参与到HTNV的侵入过程。HTNV可能还存在其他的细胞受体或协同受体。

新近研究证实汉坦病毒感染极化细胞依赖β3整合素与分布在顶点的糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白（GPI- anchored protein，decay accelerating factor，DAF/CD55）的共同作用。DAF/CD55是补体系统的负调节因子，广泛分布于多种细胞的极化顶端上，例如正常的肾脏，肾小管、肾小球旁器细胞和颈动脉细胞，是病原体作用于内皮组织的一类重要的黏附分子。研究显示分布在极化细胞的细胞膜顶点的DAF/CD55介导了HTNV穿越极化的上皮细胞顶膜。HTNV感染的患者内皮细胞、肾小管细胞以及尿沉淀中的肾小管细胞都可以发现病毒。上皮细胞是HTNV感染所致的HFRS或是HPSDAF的主要靶细胞。而上皮细胞是极化的单层细胞，细胞的蛋白也呈极性分布。对于非极化的细胞，β3整合素已经被证实是致病性汉坦病毒病的主要受体，但是在极化的上皮细胞和内皮细胞，致病性汉坦病毒的感染局限于细胞极化的顶端，而αvβ3整合素受到细胞极化的限制而分布于细胞膜基底外侧面，不能与病毒直接接触。HTNV首先通过与丰富表达于细胞极化顶端的DAF的结合而实现对极化细胞的黏附。研究证实αvβ3整合素的抗体或是DAF的抗体都可以阻断致病性汉坦病毒对极化细胞的感染，但是联合应用抗体的效果并不优于单独使用DAF的抗体，说明DAF和αvβ3整合素都参与了病毒的黏附，然而其具体的机制仍不明了。

研究证实HTNV有效的黏附和感染还有赖于细胞膜表面糖化补体1q片段受体/P32（gC1qR/p32，p33，HABP- 1）的表达。gC1qR/p32可以与完整的C1q蛋白的球状“头部”域结合。gC1qR/p32在内皮细胞、树突状细胞、淋巴细胞等多种细胞及血小板上表达。与血浆及细胞蛋白有广泛的亲和性，包括玻连蛋白、凝血酶素、高分子量激肽原、透明质酸等。研究证实gC1qR/p32蛋白可以与许多病毒蛋白相互作用，例如丙型肝炎病毒核心蛋白，风疹病毒衣壳，HIV- 1的tat、rev等。此外，gC1qR/p32蛋白还能被其他一些病原微生物利用作为黏附和侵入的受体。尽管gC1qR/p32蛋白没有跨膜结构域，其可能是通过与细胞膜上的其他蛋白或是蛋白复合物相结合形成复合体而发挥作用的。例如gC1qR/p32与β1整合素共同作用参与了C1q介导的细胞的黏附和伸展。gC1qR/p32蛋白包含一个中心孔径约20Å的三聚体腔状结构，其N端包含与C1q结合位点并介导其与玻连蛋白的连接。然而用可溶性C1q或某些gC1qR/p32的抗体（例如clone 60. 11，结合gC1qR/p32蛋白76～93位氨基酸或clone 74. 5. 2，结合gC1qR/p32蛋白的203～218位氨基酸）并不能阻断HTNV的感染。说明gC1qR/p32与HTNV蛋白结合的部位不同于与C1q结合的部位。究竟gC1qR/p32蛋白的哪些蛋白结构域提供了HTNV的受体作用仍不明了。病毒与细胞的黏附可以启动被感染细胞的级联信号通路。丙型肝炎病毒的核心蛋白与T细胞表面gC1qR/p32蛋白结合可以活化ERK/MEK信号途径。HTNV与gC1qR/p32蛋白的结合是否也参与到HTNV介导的内皮细胞屏障功能损坏的信号通路中及具体的机制仍需进一步研究证实。

研究表明，植物凝集素和笼形蛋白相关受体也可能参与介导了HTNV的吸附和入胞过程。Ogino等研究发现，能够识别N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）并且结合病毒和细胞膜的特异植物凝集素能够增强HTNV的感染。感染过程中用植物凝集素处理比未处理细胞的感染性增强，而加入GalNAc能够明显抑制植物凝集素介导的感染增强。这些研究表明，植物凝集素与细胞表面分子的亲和力要比病毒与受体的亲和力强，提示与植物凝集素介导的感染有关的细胞表面分子的数目要比病毒受体的数目要多。植物凝集素可能通过它与病毒和细胞表面分子之间的交联作用来诱导汉坦病毒的感染增强，也可能通过聚集缺少某一编码片段的汉坦病毒来弥补其功能缺陷而引起感染增强的现象，但植物凝集素对汉坦病毒感染的具体作用还有待进一步深入研究。Jim等的研究表明汉坦病毒进入细胞也可能由笼形蛋白相关的受体介导。

固有免疫（innate immunity）是机体在长期进化中所形成，与生俱有而并非由特定抗原诱导的抵抗病原体侵袭、清除体内异物的防御能力，由固有免疫细胞和固有免疫分子所执行，是机体抵御病原体感染的第一道防线。固有免疫细胞不表达特异性抗原识别受体，而是以其胞膜表面的模式识别受体（PRR）直接识别表达于多种病原体表面的病原相关分子模式（PAMP）而活化。主要的固有免疫细胞有：吞噬细胞、NK细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞以及树突状细胞（DC）、NK T细胞、γδT细胞、B1细胞等。其免疫应答特点是：①识别抗原不具特异性；②激活后不经克隆扩增即迅速发挥效应；③一般不产生记忆性，也不形成免疫耐受。下面仅介绍研究较多的NK细胞和树突状细胞在汉坦病毒感染中的作用。

自然杀伤细胞（nature killer，NK）主要分布于外周血和脾脏，不表达特异性抗原识别受体。NK细胞无须抗原预先致敏，就可以直接杀伤某些肿瘤和病毒感染的靶细胞。因此，在机体抗肿瘤和早期抗病毒或胞内寄生菌感染的免疫过程中发挥重要作用。在肿瘤或病毒特异性IgG抗体存在的条件下，NK细胞也可以通过表面IgG Fc受体（Fcγ RⅢ）介导，通过ADCC作用识别杀伤与IgG抗体特异性结合的肿瘤或病毒感染的靶细胞。此外，NK细胞活化后，还可以通过分泌IFN-γ、IL- 2和TNF等细胞因子发挥免疫调节作用。

早在二十多年前，国内学者就应用5’-碘脱氧尿嘧啶核苷（ ¹²⁵I UdR）标记的K562细胞作为靶细胞，检测了95例HFRS患者的NK细胞活性，并同时检测了其中50例患者外周血单个核细胞（PBMC）在PHA刺激下IL- 2和IFN-γ系统产生水平。结果发现，患者NK细胞活性自病程早期明显升高，至多尿期恢复正常，重、危重型患者NK细胞活性高于轻、中型患者，但HFRS各期患者PBMC产生IL- 2和IFN-γ水平均在正常范围。提示NK细胞可能与HFRS病理损害有关。汉坦病毒可能具有直接活化NK细胞的作用。Linderholm M等应用纤维支气管镜检查进行支气管肺泡灌洗，对16例HFRS患者不同病期的NK细胞数量检测发现，急性期NK细胞数量明显高于其他病期。表明在HFRS的急性期，NK细胞在下呼吸道局部和外周循环中均被活化，宿主的固有免疫应答开始发挥抗病毒作用。Björkström NK等在汉坦病毒感染患者临床症状出现5天和60天时分别检测其外周血淋巴细胞中的NK细胞，发现NK细胞绝对数增长到3～4倍。同时这些增殖的NK细胞表达活化性受体NKG2C，且能对靶细胞的刺激进行应答反应。表明在汉坦病毒感染人体以后，NK细胞能够发生增殖且能够较长时间维持这种增殖状态。

树突状细胞（dendritic cell，DC）因其表面具有星状多形性或树枝状突起而得名。DC具有其他细胞所没有的形态特点和运动能力，分布十分广泛。DC不但像单核吞噬细胞那样具有吞噬能力，而且是迄今已知的功能最强的抗原提呈细胞，可以有效地刺激T淋巴细胞和B淋巴细胞活化，从而将固有免疫和获得性免疫有机地联系起来。

病毒进入机体后遭遇的第一种免疫细胞就是位于皮肤及黏膜中的不成熟DC，这些不成熟DC也同样分布于汉坦病毒进入机体的门户——肺的上皮组织和间质组织（担当外周免疫系统哨兵的角色）。不成熟DC能够捕获并处理病毒抗原，形成主要组织相容性分子（MHC）和抗原肽段的复合物。来源于受损组织或微生物产物的信号可以触发DC向引流淋巴组织的迁移，迁移过程中，DC逐渐发育成熟并获得一系列特征性的表面标志，由此演化为免疫系统中最强的抗原提呈细胞。成熟DC可有效地活化静息T淋巴细胞，活化T细胞可以进入感染部位，消灭病毒感染的细胞。因此，病毒和DC之间的相互作用对于病毒的致病过程和病毒感染后的免疫应答均十分重要。

目前，已知多种病毒能够感染人DC，通过不同机制干扰其功能。其中人类免疫缺陷病毒、麻疹病毒、Ⅰ型单纯疱疹病毒以及人巨细胞病毒均可以在一定程度上逃避抗病毒免疫，延长其在宿主体内的存活时间。研究发现，汉坦病毒肺综合征（HPS）患者的脾脏和淋巴结的滤泡样DC中存在汉坦病毒抗原，虽然这一现象可以用DC摄取了外源性病毒抗原而未发生产毒性感染来解释，但仍暗示汉坦病毒可以在DC中复制。

德国柏林大学病毒研究所Raftery MJ等研究发现，汉滩病毒（HTNV）可以在体外产毒性地感染不同来源的DC（包括单核细胞来源的不成熟和成熟DC、外周血中的DC、CD34 ⁺祖细胞来源的DC），这些不同来源的DC对HTNV均易感，并且HTNV感染DC的产毒动力学与HTNV感染的人脐静脉内皮细胞的产毒动力学相似，病毒感染的前4天，被感染细胞所释放的病毒数量逐日增加，但随后病毒产量却急剧下降，第4天达到病毒滴度的峰值。但HTNV感染既未使DC出现任何细胞病变，也未因病毒复制而诱导细胞坏死或凋亡，HTNV感染也没有影响对成熟DC的稳态控制起重要作用的凋亡诱导信号，这种现象在登革病毒感染的DC中也有发现。但是，与其他免疫抑制性病毒不同，HTNV却能向不成熟DC传递强烈的成熟刺激信号，使其表型和功能发生变化，上调MHCⅠ类和Ⅱ类分子、共刺激分子、黏附分子的表达，HTNV感染还能下调与DC内摄取抗原作用相关的DC- SIGN分子，使DC摄取抗原的能力下降，使之与成熟的DC具有相似的特征。研究发现，病毒复制过程中产生的双链RNA中间体，可以触发DC的成熟。这种双链RNA分子可以活化丝氨酸-苏氨酸激酶（一种依赖双链RNA的蛋白激酶，PKR），磷酸化I-κB分子，从而活化NF-κB，后者可以活化促进DC成熟的基因。此外，双链RNA中间体分子还能结合TLRs，识别微生物感染的相关分子，启动固有免疫应答。HTNV感染的DC还与成熟DC一样，能够有效地刺激T细胞增殖，与之相似的是，流感病毒感染的DC也能增强其刺激T细胞的能力，但被流感病毒感染的DC会发生严重的细胞病变，未感染的DC摄取感染细胞凋亡后的细胞碎片，通过这种外源性病毒抗原的提呈作用刺激抗病毒T细胞的增殖，而汉坦病毒感染DC并未引发细胞病变，因此，DC的直接感染可能是诱导初始T细胞对汉坦病毒应答过程中最为重要的抗原提呈途径。HTNV感染的DC还能诱导促炎因子（包括TNF-α、IFN-α等）的释放，而IL- 12的水平并未见升高。HTNV感染的DC诱导TNF-α的分泌增多或许是导致HFRS患者此种细胞因子增多的原因之一，而TNF-α在黄热病毒和登革病毒导致的出血热中起着重要的作用。因此一些学者推测，汉坦病毒感染的DC可能通过以下几条途径发挥致病作用：①感染不成熟DC对于病毒向全身多个组织器官播散起了重要作用；②在二级淋巴组织，汉坦病毒感染所诱导成熟的DC可以有效地刺激T细胞，这些被激活的T细胞可以经由血流到达被感染的器官。在迁移过程中，CD8 ⁺效应性T淋巴细胞可以牢固地结合并杀伤由于汉坦病毒感染而上调表达了ICAM- 1和MHCⅠ类分子的内皮细胞；③HTNV感染的DC所释放的促炎因子TNF-α、IFN-α等可增强汉坦病毒诱导的血管内皮细胞渗漏，破坏内皮细胞屏障，导致血浆渗漏综合征的发生。

固有免疫分子是执行固有免疫的重要介质。主要有补体系统、模式识别受体（如Toll样受体，TLR）、防御素、细胞因子等，它们在抗感染免疫中发挥重要作用。下面仅介绍Toll样受体和细胞因子在汉坦病毒感染中的作用。

Toll样受体（Toll like receptors，TLRs）是一类重要的免疫分子，属于Ⅰ型跨膜蛋白，由胞外区、跨膜区和胞内区3部分组成，TLRs仅识别表达在病原微生物上的高度保守的结构基序，宿主通过TLRs感受入侵的外来分子，产生固有免疫应答。TLRs能监视与识别病原体结构成分，启动细胞内信号转导通路，诱导特异性基因表达，分泌细胞因子或趋化因子，这是TLRs活化最重要的效应。TLRs信号还能募集活化NK细胞、DC，促进DC向T细胞提呈抗原，启动T细胞应答。活化T细胞产生的细胞因子（如IFN-γ）又进一步活化单核巨噬细胞，借助TLR的桥梁作用，固有免疫和适应性免疫被紧密联系起来。

TLRs主要表达在具有免疫功能的组织和细胞中，不同的TLRs识别的配基各不相同，TLR2能识别许多种病原体相关分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP），包括细菌脂多糖（LPS）、肽聚糖和胞壁酸；TLR3识别病毒双链RNA；TLR4可识别细菌的LPS；TLR5识别细菌鞭毛蛋白；TLR9识别细菌CpG DNA；最近发现TLR7和TLR8能识别一些人工合成的抗病毒小分子。姜泓等检测了HTNV感染的EVC- 304细胞中5种TLRs（TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR9）的表达变化，结果显示HTNV感染后TLR2、TLR7、TLR9的表达没有明显变化，TLR3的表达下降，TLR4的表达升高。TLR4主要表达于细胞表面，是炎症信号传递的“门户”蛋白。以往的研究大多集中在TLR4对细菌感染的作用，但近年研究发现呼吸道合胞病毒（RSV）的F蛋白、鼠乳腺瘤病毒（MMTV）胞膜蛋白等均是TLR4所识别的配体。HTNV属有包膜的负链RNA病毒，血管内皮细胞是其感染的主要靶细胞，其表面可高水平表达TLR4。在HTNV感染的EVC- 304细胞中细胞因子TNF-α、IL-6、IFN-β的分泌增多，在被感染的细胞中TLR4通过MyD88非依赖通路介导了转录因子NF-κB和IRF- 3的细胞核移位，并参与调控上述细胞因子的分泌。但是在HTNV感染前后，未见趋化因子IL-8的表达变化。上述研究结果提示了在汉坦病毒与血管内皮细胞的相互作用过程中，病毒的结构成分活化了细胞膜上的TLRs，通过TLRs信号转导通路，导致细胞因子或趋化因子基因的转录、表达和表达产物的分泌，引起抗病毒免疫应答，表明固有免疫参与了汉坦病毒的致病过程。

病原体感染机体后，可刺激免疫细胞和感染的组织细胞产生多种细胞因子，参与多种免疫功能。在病毒感染中，这些因子主要包括：诱导产生抗病毒作用的细胞因子和诱导和促进炎症反应的细胞因子/趋化因子。

干扰素刺激基因（IFN- stimulated gene，ISG）的活化是许多病毒感染后的基本特征。RNA病毒常常通过病毒核酸与细胞模式识别受体（pattern- recognition receptor，PRR）的相互作用刺激固有免疫应答，配体结合PRR活化调控抗病毒基因表达的转录因子。目前认为干扰素调节因子- 3（IFN regulatory factor- 3，IRF- 3）是诱导ISG表达的必需中间体。Prescott J等用辛诺柏病毒（Sin Nombre virus，SNV）与紫外线（UV）灭活的SNV接种或处理人原代脐静脉内皮细胞（HUVEC）后应用基因芯片和反转录PCR分析宿主ISG的表达情况，发现处理后4～24小时之间活病毒和灭活病毒均可诱导各种ISG的表达，而且在处理后早期（24小时内）对灭活病毒的诱导能力强于活毒，随着UV辐照剂量的增加，虽然病毒RNA的完整性受到破坏，但其诱导ISG的能力仍强于活病毒，但是在晚期（24小时后）则对活毒感染的诱导能力强于灭活病毒，活病毒处理后3天，由于有SNV的复制，细胞中仍然能够发现ISG的过量表达。以上结果表明病毒颗粒本身早期即可诱导抗病毒应答，而随着活毒感染后复制数量的增加病理过程将逐渐显现。Prescott J等的新近研究又发现SNV感染后还可通过一种IRF3非依赖的方式活化固有免疫反应。IRF- 3非依赖的ISG转录在人肝癌细胞系接种SNV病毒颗粒的早期即被启动活化，应用基因敲除技术还发现这种活化作用也不依赖于病毒RNA和蛋白质的相互作用。说明SNV病毒颗粒不识别PRR，而是通过一种新的IRF- 3非依赖的途径活化固有免疫应答。Spiropoulou CF等研究了致病的汉坦病毒安第斯型（Andes virus，ANDV）和非致病的希望山型（Prospect Hill virus，PHV）感染体外原代人肺微血管内皮细胞（HMVEC- L）后干扰素应答的异同，发现PHV感染后早期可诱导强烈的β干扰素应答，且相关的IRF- 3活化、IRF- 3的二聚化及核易位均可检出，但ADV均难以检出；此外，Stat- 1/2的磷酸化程度在PHV感染后也明显高于ADV感染。因此，作者认为两型病毒与IRF- 3活化相关的干扰素应答存在明显的差别，可能是ADV致病的重要原因。

瑞典学者Stoltz M等测定了18例普马拉病毒（Puumala hantavirus，PUUV）感染的患者，发现两种Ⅰ型干扰素（α和β干扰素）的水平相似，而Ⅲ型干扰素（λ干扰素）在急性期明显低于恢复期。体外试验表明加入λ干扰素可抑制A549细胞中汉坦病毒的增殖，加用Ⅱ型干扰素（γ干扰素）有叠加的抗病毒效果。体外研究还发现，已建立的汉坦病毒感染细胞培养系统对上述三型干扰素的抗病毒作用均不敏感，证明汉坦病毒能够影响患者抗病毒固有免疫应答，抑制干扰素的抗病毒效应。德国学者Oelschlegel R等应用体外试验表明Ⅰ型干扰素与Ⅱ型干扰素均可抑制Vero或A549细胞中汉坦病毒的复制，此种抗病毒作用与MxA的表达密切相关；进一步研究用siRNA抑制MxA的表达并不影响Ⅰ型干扰素对病毒复制的抑制，表明MxA的表达在两型干扰素的抗病毒过程中并非必需因素，可能还存在着除此之外的多种抗病毒机制。还有学者用致病的汉坦病毒毒株76- 118和非致病的图拉汉坦病毒（Tula hantavirus，TULV）感染体外培养的HUVEC，比较血管内皮细胞感染后抗病毒应答的异同，发现两种病毒感染后与抗原提呈相关的分子表达均上调，但是76- 118感染后易检测到β干扰素的产生而TULV感染后则很难检出；具有抗病毒作用的MxA蛋白在TULV感染后16小时即可测到，而76～118感染后48小时方能检出；TULV感染HUVEC后病毒增殖的滴度很低，而后者很高。作者认为抗病毒的MxA产生迟缓可能是致病的汉滩型病毒易于播散且致病的重要因素。

人肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）有157个氨基酸残基，约17kD，没有糖基化。分子内有一个二硫键（Cys69- Cys101），对维持其空间结构有重要意义。TNF-α主要由单核/巨噬细胞产生，具有多种生物活性：包括抗感染、增强CTL对感染细胞的杀伤作用、引起炎症反应、作为内源性致热原引起发热。大剂量的TNF-α引起严重的全身及局部炎症反应，增加血管通透性，引起多器官功能衰竭。有研究表明，TNF-α是某些病毒性免疫病理损伤及促进感染的主要因素。TNF-α的生物活性没有种属特异性。TNF-α是一种重要的细胞因子，在HFRS中可引起与寒战、发热、头痛、肌痛、血压下降等临床表现。HFRS的基本病理改变是全身微血管的损伤和通透性增加，TNF-α为导致血管损伤的重要因素。HFRS患者血清TNF-α在发热期已开始升高，低血压和少尿期达高峰，多尿期明显下降，至恢复期维持于较低水平，表明TNF-α水平与HFRS的病期有密切关系。临床上，随病情加重，TNF-α的水平亦相应增高，特别是在危重型患者中TNF-α呈持续高水平，可能在严重的低血压休克和肾衰竭等重要临床综合征方面起重要作用。HFRS患者血清TNF-α水平与尿蛋白水平呈正相关，且各尿蛋白梯度之间TNF-α水平差异有显著性，提示TNF-α水平与肾脏损害的严重程度有关。

IL-6由淋巴细胞、单核细胞、内皮细胞、肾小球系膜细胞产生，具有促进B细胞分化、抗体产生以及活化T细胞和胸腺细胞等多种免疫调节作用。Niikura等研究发现，HTNV感染的HUVEC培养上清中IL-6的水平显著高于未感染的细胞。王平忠等通过检测不同病期和病型HFRS患者的血清发现，IL-6在发热期已开始升高，低血压和少尿期达高峰，多尿期明显下降，至恢复期维持于较低水平。说明IL-6含量的改变与HFRS的病期有密切关系，并且与病毒在患者血液、感染细胞内增殖时间一致。从临床病型看，随病情加重，IL-6的含量亦相应升高，尤其在重型和危重型患者持续高水平存在。说明IL-6含量与HFRS的病型亦有密切关系。

白细胞介素-8（IL-8）属于C- X- C类趋化因子，是由单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、内皮细胞等产生的一种小分子量的活性多肽，系一种重要的白细胞趋化因子和炎症反应的重要介质，能够引起小血管内皮细胞损伤，使血管通透性增加，液体外渗，参与低血压的形成。研究发现，不同病期HFRS患者血清IL-8水平显著高于正常对照组（恢复期除外）（ P＜0. 05），且以少尿期最高。同时，重型和危重型患者有较高水平的IL-8，其含量也显著高于健康对照组（ P＜0. 05）。提示IL-8的含量与病情进展和轻重有关。HFRS患者高水平的IL-8会加重病理损伤，引起病情的重症化。

干扰素诱导蛋白- 10（IP- 10）是由γ-干扰素刺激单核细胞、内皮细胞等产生的一类趋化T细胞的分泌性糖蛋白。IP- 10在抗病毒感染的Th1免疫应答中具有重要作用。研究发现，HFRS患者的免疫平衡偏向Th1类反应。经检测，HFRS患者各病期和各病型IP-10含量均显著高于正常对照（ P＜0. 05），且以发热期、低血压期以及重型和危重型患者含量较高。可能是由于患者体内高水平IFN-γ刺激作用的结果。HFRS患者血清高水平的IP- 10有助于趋化Th1类细胞到达病毒感染部位，以增强效应细胞的免疫应答。但是过度的Th1反应又可导致血管内皮损伤，引起通透性增加。因此，高水平的IP- 10可能参与了HFRS患者血管渗漏的形成。

调节活化正常T细胞表达与分泌的趋化因子（RANTES）为CC类趋化蛋白。它不仅对多种细胞有趋化作用，而且还可以强烈地激活淋巴细胞，参与炎症反应。病毒活化的特异性CD8 ⁺T细胞不仅可产生穿孔素和颗粒酶A，而且还产生RANTES，协同发挥抗病毒作用。研究表明，HFRS患者各病期（恢复期除外）和各病型RANTES含量均显著高于健康对照（ P＜0. 05），其中以低血压和少尿期及危重型患者含量最高，提示其含量与病情进展和轻重有一定的关系。Sundstrom等用汉坦病毒单独感染HMVEC- Ls，发现RANTES和IP-10的表达明显增加，而汉坦病毒和IFN-γ联合应用，则可诱导更高水平的RANTES和IP- 10表达。HFRS患者血中高水平的IFN-γ有助于RANTES和IP- 10的产生，发挥协同抗病毒作用。在疾病的潜伏期，汉坦病毒感染的血管内皮细胞表达中等水平的RANTES和IP- 10，吸引归巢至毛细血管静脉的活化T细胞。在微环境内，抗原活化的浸润T细胞表达IFN-γ，增强汉坦病毒感染的内皮细胞表达RANTES，并选择性地募集更多的T细胞，产生CTL反应，在抗病毒的同时参与血管损伤。因此，HFRS患者RANTES水平不仅与病情进展和轻重有一定关系，而且与血管渗漏的形成有关。

总之，细胞因子/趋化因子的释放是一种应激反应，有利于炎症的发生和病毒的清除，但失控的炎症反应会引起多器官功能障碍综合征。汉坦病毒可感染多种重要的免疫细胞和免疫器官，并诱导产生各类细胞因子和趋化因子。在HFRS中，细胞因子/趋化因子不仅参与了机体的抗感染免疫，同时也可引起发热、血管通透性增加等急性反应和休克。大部分细胞因子/趋化因子在HFRS发热期已开始变化，因此，早期测定这些分子，对判定病情进展和疾病严重程度有一定帮助。探讨细胞因子/趋化因子产生的原因，则对阐明HFRS的发病机制，预防并发症的发生具有重要意义。

适应性免疫应答（adaptive immune response）是因抗原激发而产生的，表现为淋巴细胞对抗原的特异性应答和免疫记忆。也称获得性免疫应答（acquired immune response）或特异性免疫应答（specific immune response）。适应性免疫应答的主要特性如下：①识别“自身”和“非己”的特性，即抗原特异性T淋巴细胞、B淋巴细胞通常对自身正常组织细胞产生天然免疫耐受，对非己抗原性异物产生免疫排斥反应；②特异性：即机体接受某种抗原刺激后，只能产生对该种抗原特异性的免疫应答，相应的免疫应答产物（抗体和效应T细胞）只能对该种抗原和表达此种抗原的靶细胞产生作用，而不能对其他抗原产生反应；③记忆性：即在抗原特异性T/B淋巴细胞增殖分化阶段，有部分T/B淋巴细胞中途停止分化，成为静息状态的免疫记忆细胞。当机体再次接触相同抗原时，这些长寿免疫记忆细胞可迅速增殖分化为免疫效应细胞，产生相应体液和（或）细胞免疫效应。

广义的细胞免疫（cellular immunity）是指与免疫应答有关的所有细胞，主要包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）、调节性T细胞、单核吞噬细胞等。狭义的细胞免疫仅指T细胞介导的免疫。下面仅介绍T细胞和调节性T细胞在汉坦病毒感染中的作用。

在抗病毒细胞免疫中，适应性免疫在彻底清除病毒、建立免疫记忆等方面起至关重要的作用。与其他病毒的抗感染适应性免疫应答相似，针对HTNV感染的适应性免疫主要包括中和抗体、CD8 ⁺杀伤性T细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）和CD4 ⁺T细胞免疫应答。

病毒特异性CD4 ⁺和CD8 ⁺T细胞在病毒的清除中起重要作用。细胞毒性T细胞（CTL）是主要的效应细胞，可通过穿孔素途径和死亡受体途径杀伤病毒感染细胞，并引起病毒感染细胞的凋亡，此外还可通过分泌细胞因子调节机体免疫功能。CD4 ⁺T细胞根据分泌细胞因子的不同，可分为Th1和Th2两个亚群。病毒感染时，一般Th1细胞对病毒的清除和疾病的痊愈至关重要，若Th1应答下调，Th2应答占优势，则表现为病毒的持续感染。更重要的是，CD4 ⁺T细胞可分泌细胞因子调节CD8 ⁺T细胞介导的抗病毒免疫应答，尤其是Th1细胞的辅助对CD8 ⁺T细胞的活化和杀伤活性至关重要。

HTNV特异性CD4 ⁺T细胞和CD8 ⁺T细胞在清除病毒和HFRS的发病机制中均发挥重要作用。如过继转移HTNV免疫小鼠的脾细胞可有效保护同基因幼鼠抵抗HTNV的感染，其效应细胞主要是T细胞。对HTNV感染引起的HFRS患者急性期T细胞免疫应答的研究中发现，分泌IFN-у的T细胞频率与HFRS病情的严重程度呈负相关。由此可知，分泌IFN-у 的T细胞在病毒的清除过程中起重要的免疫保护作用。近年来，应用ELISPOT或胞内细胞因子染色等方法，通过测定分泌IFN-у的T细胞应答的强度（T细胞应答的频率）和宽度（T细胞应答所针对的表位数），对T细胞在病毒感染性疾病中的作用进行了大量深入的研究。进一步研究发现，除了分泌细胞因子，特异性T细胞识别表位的数量以及增殖和杀伤水平与病毒感染后的发生、发展也有着密切的关系。在某些病毒持续性感染疾病中，识别多表位且能够分泌IFN-у等细胞因子的T细胞应答与病毒的清除直接相关，而增殖、杀伤、分泌细胞因子等功能低下的T细胞应答状态，则与病毒的持续性存在有关。

在一些病毒感染性疾病中，病毒特异性CD4 ⁺和CD8 ⁺T细胞可能还在病毒性疾病的免疫病理损伤过程中起着重要作用。由此可见，在病毒性疾病的发病机制中，T细胞应答是一把双刃剑。对病毒特异性T细胞的异质性及其功能的研究，将有可能揭示不同功能亚群的T细胞在不同病毒感染性疾病发生、发展和转归中所扮演不同角色的细胞和分子机制。

尽管细胞免疫应答在HFRS发生、发展和疾病的转归中起着重要作用，但迄今为止，对HTNV结构蛋白上的T细胞表位的研究只有零星报道。1999年，VanEpps等首次报道在3 名15年前实验室感染过HTNV的研究人员的外周血中，存在着HTNV特异性的CTL记忆细胞，并且鉴定出受HLA- A1、B51限制的HTNV- NP特异的CTL表位aa421-429和aa12- 20。2002年韩国学者Lee等应用表位预测和合成肽技术，从7名HLA- A2. 1阳性的HFRS患者中鉴定出HTNV- NP特异的CTL表位aa334- 342。同年，Van Epps等报道了13名7～18年前感染过PUUV的芬兰人PBMC中存在着PUUV- NP特异性的记忆性T细胞，证实了感染PUUV多年后体内特异性CTL记忆细胞的存在。并鉴定出受HLA- A2、A28、B7和B8等4种等位基因限制性的PUUV- NP特异的CTL表位。

HTNV主要流行于中国和其他一些亚洲国家，目前国内研究组利用合成的70条覆盖HTNV- NP全长和281条覆盖HTNV- Gn/Gc全长序列的重叠肽，应用ELISPOT方法等对HTNV的核蛋白及糖蛋白T细胞表位进行全面系统鉴定，为新型HTNV基因和多肽疫苗的设计提供重要的理论依据。鉴定出23个HTNV- NP特异的新的T细胞表位，并发现其中8 个CTL 9肽表位分别受HLA- A02、A11、A33、B7和B35等的限制，其中A02和A11是我国汉族人高频率的HLAⅠ类抗原。在HTNV- Gn/Gc T细胞表位的筛选中，54. 8%的Gn/Gc 15肽可产生特异性T细胞应答，且T细胞表位在Gn/Gc的一级结构上分布较为广泛。

调节性T细胞（regulatory T cells，Treg或Tr）是由多种独特的T细胞亚型所组成，根据其来源、效应机制将其分为两类：天然调节性T细胞（CD4 ⁺CD25 ⁺T）及诱导调节性T细胞。Tr1主要分泌IL- 10，Th1或Th2细胞在用IL- 2和TGF-β刺激后也可被诱导成Tr2，Th3主要分泌TGF-β。除上述调节性T细胞，近年来还发现了另外一些调节性T细胞，如：CD8 ⁺Tr、CD4 ^-CD8 ^-Tr及NKT等。目前研究最广泛的是CD4 ⁺CD25 ⁺调节性T细胞。

机体内自然产生的CD4 ⁺CD25 ⁺调节性T细胞来源于CD4 ⁺CD8 ^-胸腺细胞，在CD4 ⁺T细胞的自然选择过程中分化和成熟，它们约占小鼠和人体外周CD4 ⁺T细胞的2%～10%。胸腺产生的CD4 ⁺CD25 ⁺调节性T细胞进入外周后需要外周自身抗原刺激等多种因素的影响才能成为功能性的调节T细胞。胸腺上皮细胞对CD4 ⁺CD25 ⁺调节T细胞的分化可能起着主要作用，抗原提呈细胞特别是树突状细胞的成熟和活化对CD4 ⁺CD25 ⁺调节T细胞的功能发挥重要的调节作用，转录因子Foxp3是其特征性标记，CD28及其信号通路是其必需的信号分子。

CD4 ⁺CD25 ⁺调节性T细胞表达多种表面分子，主要包括抑制性共刺激分子CTLA-4、PD-1，肿瘤坏死因子受体超家族成员GITR、OX40，趋化因子受体CCR4，Toll样受体4（TLR4），淋巴细胞抗原复合体6，Neuropilin- 1及归巢受体CD103等。这些分子相对表达水平对界定CD4 ⁺CD25 ⁺调节性T细胞有一定帮助，但并不是其特异性标志。Foxp3是目前公认的CD4 ⁺ CD25 ⁺调节性T细胞的特异性标志，其他的淋巴细胞如CD4 ⁺CD25 ^-T细胞、B细胞和CD8 ⁺T细胞仅表达少量的Foxp3。

目前，一般认为CD4 ⁺CD25 ⁺调节性T细胞的作用机制有以下3种：①细胞接触依赖性机制：体外观察证实，人Treg细胞可以用细胞接触依赖的方式抑制CD4 ⁺和CD8 ⁺T细胞IL- 2基因转录和表达及T细胞的活化增殖。但国内外在Treg细胞对效应性T细胞的接触抑制机制方面，就其作用是否通过抗原递呈细胞介导仍存在争议。一种观点认为细胞间的直接接触是结合在同一抗原递呈细胞上的Treg和效应性T细胞的连接抑制。细胞因子中和抗体的应用似乎也不能消除这一抑制反应。另一种观点认为Treg细胞经TCR活化后，可以对效应性T细胞形成直接抑制，不需要通过APC所介导。体外实验表明，Treg也可通过作用于树突状细胞，下调其共刺激分子、主要组织相容性复合体（MHC）Ⅱ和IL- 12的表达，从而间接抑制效应T细胞的活化。②细胞因子依赖性机制：Treg细胞可通过分泌细胞因子发挥调节功能。近年有报道指出，随着T细胞的活化，在CD4 ⁺CD25 ⁺Treg表面可以检测到转化生长因子-β（TGF-β）及其前体，给予抗TGF-β单克隆抗体封闭能够消除Treg的抑制效应。另有资料证实，IL- 10可促进天然CD4 ⁺CD25 ⁺Treg成熟，然后通过产生其他细胞因子来发挥其调节功能。上述体外研究结果说明TGF-β和IL- 10可以介导Treg的免疫调节活性。③CD4 ⁺CD25 ⁺调节性T细胞还可通过与抗原提呈细胞的作用来调节机体免疫。近年来的一些研究表明：活化后的CD4 ⁺CD25 ⁺调节性T细胞可表达颗粒酶A，在细胞直接接触基础上，通过穿孔素依赖的细胞毒作用杀伤多种自体靶细胞。

调节性T细胞通过抑制促炎症反应和CD8 ⁺T细胞反应来参与维持宿主内部的稳态，但它对病毒的持续感染也有一定的影响，该机制主要通过抑制清除病毒的相关反应。已发现多种病原体感染，如疟原虫、利什曼原虫、HIV都可诱导宿主上调CD4 ⁺CD25 ⁺调节性T细胞，抑制CD4 ⁺T细胞，下调Th1的功能。调节性T细胞减少了TNF-α的表达，参与了汉坦病毒在雄性大鼠肺中的持续感染，但该机制尚不清楚。

汉坦病毒可以在储存宿主中形成持续感染，但是形成持续感染的机制目前尚未明了。调节性T细胞可以通过抑制促炎症因子和效应T细胞的活性形成持续感染，该机制可能参与了汉坦病毒的感染。Easterbrook等用汉城病毒（SEOV）感染雄性挪威鼠，并检测感染过程中的调节性T细胞。发现鼠肺中的CD4 ⁺CD25 ⁺FoxP3 ⁺T细胞、FoxP3和TGF-β的表达均增高。为进一步明确调节性T细胞是否参与了汉城病毒的持续感染，该作者用抗大鼠CD25单克隆抗体（NDS-63）使调节性T细胞失活。结果发现调节性T细胞失去活性后减少了鼠肺和唾液中汉城病毒RNA的表达量。该作者又进一步评价了感染过程中肺部的病理改变。表明病变肺中出现了亚临床的急性多灶性出血和水肿区域，而调节性T细胞失活后，肺部的病变区域有所减少。感染时TNF-α的表达也受到抑制，而调节性T细胞失活后消除了对TNF-α表达的抑制。

调节性T细胞的活性主要通过细胞与细胞之间的接触或局部分泌抗炎症因子如IL- 10 和TGF-β进行调节。过度的炎症反应和CD8 ⁺T细胞反应介导了人汉坦病毒疾病，通过注射糖皮质激素可以减轻这种炎症反应。但在SEOV的储存宿主体内，促炎症反应降低，而调节性T细胞反应增强。为确定糖皮质激素对汉城病毒感染的影响，Easterbrook等对雄性和雌性挪威大鼠进行了肾上腺切除术，并分组进行不同量的激素替代。在感染后不同时间点对血清皮质激素水平、SEOV RNA含量、基因表达和蛋白表达量进行了评估。发现SEOV感染抑制皮质激素的水平在模拟切除肾上腺的雄性大鼠和完全切除肾上腺的雄性大鼠中相当。此外，低皮质激素水平的雄性大鼠肺部的病毒RNA含量比雌性大鼠高，而且也比高皮质激素水平的雄性大鼠含量高。尽管高水平的皮质激素抑制了初始的抗病毒因子及促炎症因子的表达，并且这种情况在雌性大鼠比雄性大鼠更为明显，但是此类免疫调节效果与SEOV病毒载量并不相关。低皮质激素水平且高病毒载量的雄性大鼠体内的调节性T细胞反应是增高的，并且表达有基质金属蛋白酶- 9（matrix metalloprotease，MMP- 9）。MMP- 9是一种糖原酶，它可以破坏细胞间基质，促进受SEOV感染的细胞从循环中进入肺组织。因此，相对于雌性大鼠，抑制糖皮质激素后会导致SEOV在雄性大鼠更广的播散。

在对HFRS患者的研究中发现，急性期患者与健康对照相比，外周Treg的数量显著减少。同时，发现Treg的频率与血小板数呈正相关，与血液尿素氮、血清肌酸酐、血清天门冬氨酸转氨酶呈负相关。此外，健康个体和HFRS患者的Treg具有同样的FoxP3 mRNA表达水平，在HFRS患者，抑制CD4 ⁺效应T细胞的能力未被削弱。

总之，调节性T细胞是一个具有免疫调节作用的T淋巴细胞亚群，对它的研究正步入一个新阶段，在感染、自身免疫、肿瘤等方面的研究仍将继续深化。

汉坦病毒感染，除诱导细胞免疫外，还存在错综复杂的体液免疫应答。B淋巴细胞受抗原刺激后，可产生不同的抗原特异性抗体，发挥体液免疫效应，对疾病的预防、诊断治疗和发病机制研究具有重要意义。

汉坦病毒感染人后通常诱导高水平的病毒特异性IgM，在临床症状开始时即可检测到，第7～11病日后达到高峰。IgM抗体是抗汉坦病毒3个结构蛋白的（NP，G1，G2）。尽管患者血清早期病毒特异性IgM的增加已在大多数汉坦病毒感染者得到证明，但PUUV感染偶尔诱导延迟的IgM血清应答。因此，在NE患者阴性IgM结果只有在第6病日或第6病日后方可排除病毒感染。临床症状开始后（3～5周），IgM水平下降，与HFRS患者血液总的病毒特异性IgG增加协调一致。

PUUV和SNV感染者的IgG亚类应答类似。两种病毒均诱导早期IgG1应答，并随疾病的进展而增加。尽管病毒特异性IgG1抗体是抗结构蛋白的，但所有抗胞膜糖蛋白G1和G2抗体的平均滴度比抗NP的高。PUUV和SNV不诱导血清IgG2水平的明显变化。相比，在HFRS和HPS患者，已观察到了IgG3的显著增加。在住院患者血中可检测到抗NP和G1蛋白的病毒特异性IgG3，恢复期达到高峰，然后在感染后10年逐渐下降。住院期间未发现HPS患者形成IgG4应答，仅有极少数HFRS患者形成IgG4应答。然而，在感染后2年，HFRS患者IgG亚类的研究表明，抗G2病毒蛋白的IgG4增加。未发现疾病的严重性与IgG亚类水平之间的关系。

IgG抗体独特型变化与CD4 ⁺Th细胞亚群的活化和特异性淋巴因子谱的产生有关。因此病原体诱导的IgG抗体独特型方式的确定可能为预测免疫识别效率、病原体清除和疾病预后提供信息。病程早期可诱导IgG1和IgG3亚类应答而IgG2水平无显著变化，提示在汉坦病毒感染者Th2免疫应答激活，因为IgG1和IgG2亚类主要是由汉坦病毒G1和G2诱导产生的，因此推断这些蛋白是体液免疫应答的主要诱导物，随后可能刺激IgA和IgE抗体产生。

一些研究者认为，IgG水平上升可能与重复抗原刺激有关。在自然啮齿类宿主，汉坦病毒感染持续终身，其可能的机制是病毒通过遗传上的改变而逃避宿主免疫系统或抑制宿主免疫系统。几个研究小组已研究了病毒遗传变化，并假定在自然感染的啮齿类宿主存在准种（quasispecies）或汉坦病毒细胞培养改变了病毒基因组。Araki等研究认为，在啮齿类宿主，持续汉坦病毒感染与缺乏病毒特异性CD8 ⁺T细胞有密切的关系。在实验性感染的猕猴体内已发现PUUV NP和G2蛋白以及病毒RNA感染后至少持续30周。然而，仅有少数患者且只在疾病开始后的前几天，通过RT- PCR才能检测到汉坦病毒RNA。到目前为止，除人类急性感染期外，还没有病毒抗原持续存在的证据。长期抗体合成的解释为：①病毒抗原可能在脾树突状细胞表面以抗原-抗体复合物的形式长期存在；②连续的抗体合成是独特型抗独特型相互作用的结果；③即使交叉反应性刺激，仍可维持B细胞和（或）T细胞记忆。

IgA在黏膜免疫形成中是最重要的免疫球蛋白。因为汉坦病毒主要通过气溶胶传播，最初感染呼吸道细胞，因此中和IgA对从急性感染期的康复以及长期免疫和恢复可能是很重要的。在急性期及恢复早期的血清可检测高水平的抗- PUUV IgA抗体，然后随疾病进展而逐渐下降。因此，像IgM抗体一样，IgA抗体也是感染早期的标志。在主要感染黏膜表面的其他病毒如麻疹病毒、轮状病毒及肠道病毒观察到类似的结果。在NE患者恢复期的2～10年血清中仍可检测到抗NP和G2蛋白的病毒特异性IgA1，提示IgA1抗体可能用于防止再感染。据报道，单克隆IgA1抗体通过被动输入能保护小鼠抗流感病毒的感染。研究表明，母体抗汉坦病毒中和抗体IgA和IgG通过胎盘或乳汁喂养后，可保护幼鼠防止致死剂量的SEOV感染。母体免疫可能提供幼小动物抗汉坦病毒感染约3～3. 5个月，但与IgA抗病毒保护有关的机制仍不清楚。有证据显示，中和IgA在感染细胞内通过结合至新合成的病毒蛋白上而干扰病毒的复制及中和细胞内的病原体。

与其他病毒性疾病，如流感病毒、巨细胞病毒和EB病毒相比，汉坦病毒感染可显著增加血清IgE的水平。总IgE及汉坦病毒特异性IgE水平在疾病的急性期是最高的，并在前6个月期间显著下降。由于IgE水平在疾病开始后的早期是最高的，因此认为IgE应答可能始于临床症状出现前，可能与PUUV感染的发病机制有关。尽管病毒特异性IgE水平在许多病毒感染（如麻疹病毒、HIV及呼吸道合胞病毒）中与疾病的严重性呈正相关，但在PUUV感染者未发现与任何临床参数相互作用的关系。

通常在汉坦病毒感染的早期可检测到中和抗体。汉坦病毒诱导一短暂的持续的病毒血症，但仅限于疾病的开始阶段和急性期的早期。在急性期，低水平的汉坦病毒特异性IgG存在于患者血清。然而，在血清中可检测到高浓度的抗汉坦病毒特异性IgM，提示IgM在抗体介导的病毒中和作用中起主要作用。中和抗体连续增加约2年以及感染后10～20年仍存在高滴度的中和抗体，提示在人类PUUV长期持续的可能性。汉坦病毒感染期间，G1和G2被认为是诱导中和抗体的主要成分，因为：①抗G1、G2而非NP的单抗，在体外具有中和活性；②抗汉坦病毒胞膜糖蛋白的单抗可保护给予致死剂量病毒的乳鼠；③用痘苗病毒或杆状病毒表达的HTNV或SEOV胞膜糖蛋白免疫动物可诱发中和抗体并保护啮齿动物免受HTNV和SEOV的感染。在南美，关于汉坦病毒感染的最近报道表明，在HPS患者NP不刺激中和抗体应答。同样地，用携带PUUV NP特定片段的HBV核心颗粒免疫田鼠与中和抗体的增加无关。虽然，抗NP抗体不具中和活性，但动物实验表明，对预防田鼠免受PUUV感染具有部分保护作用，更重要的是，用致死剂量的HTNV刺激后，可延长动物的寿命。因此认为抗NP抗体保护作用机制可能与抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用或补体介导的溶细胞作用有关。

汉坦病毒与其宿主共进化，根据汉坦病毒基因序列的种系发生关系和其宿主的种系关系将汉坦病毒分为3大类：即由鼠亚科（ Murinae）啮齿动物携带的HTNV，SEOV，DOBV；由田鼠亚科（ Arvicolinae）啮齿动物携带的PUUV，PHV；由棉鼠亚科（ Sigmadon-tae）啮齿动物携带的SNV，ANDV。对不同汉坦病毒抗原关系的研究表明，抗原具有高度的交叉反应，尤其是同类宿主携带的同一群病毒内。如用大鼠抗血清进行的空斑减少中和实验表明，在大鼠中有抗原相似性，但明显不同于田鼠。另外，所有大鼠病毒抗血清都具有抗PHV的中和活性，而PHV抗血清对异种病毒几乎无中和活性。尽管在几个汉坦病毒血清型中发现了明显的免疫学交叉反应，但在亲缘关系较远的汉坦病毒间的交叉保护似乎是不可能的。Chu等研究表明，痘苗载体表达的HTNV NP及两个糖蛋白可保护动物免受HTNV和SEOV的感染，但不能防止PUUV感染。这些现象可解释为在HTNV和SEOV具有遗传相似性，两者基因序列同源性约71%，M和S基因产物氨基酸的序列同源性分别为75%和82%。与此相反，HTNV和PUUV的M和S片段核苷酸序列同源性分别为58%和56%，对应的氨基酸序列同源性为53%和61%。在人类的研究也提供了不同汉坦病毒间血清交叉反应的证据，类似于动物实验结果。在相似的汉坦病毒血清型中，人血清表现出明显的交叉反应而在亲缘关系较远的型之间很少有交叉反应。应注意的是，主要交叉反应抗原是NP，而G1和G2很少有交叉反应，Ruo等认为这种现象是由于在不同汉坦病毒NP上存在保守抗原位点。

B细胞表位（B cell epitope）是抗原经过抗原提呈细胞（APC）加工后，由位于细胞表面或分泌至间质中的B细胞表面抗原受体（BCR）识别的短肽。由于NP是一种极好的靶抗原，在感染早期可启动快速而强烈的免疫应答，NP线性表位的确定可能为汉坦病毒发病机制和诊断研究提供一种全新的手段。汉坦病毒NP的C端和N端在B细胞识别抗原表位的分布上具有明显的差异。尽管两端都有高度的亲水性，并因此认为含有抗原表位，但研究发现，NP C端不含汉坦病毒主要的B细胞抗原表位。与此相反，在N端已发现了几个抗原决定簇。例如，在aa1- 79和1-61分别发现了PUUV和TULV NP表位。另外还发现，PUUV NP N端aa1-45能被特异性单抗识别。经免疫印记发现，HTNV NP N端1- 103可与实验感染的小鼠血清反应并被交叉反应的单克隆抗体识别。Wang等在汉坦病毒NP上还发现了另一抗原位点，定位于aa233- 304。就SNV而言，诱导体液免疫应答的主要区域则位于NP的N-端（大肠杆菌表达的）。国内白雪帆等（1999年）应用12株国产抗HTNV单抗对表达HTNV NP多肽片段的噬菌体文库进行3～4轮淘筛，在NP N端发现了一个B细胞线性抗原表位（aa1-86），其核心序列由aa15-66组成。Elgh等对来自不同汉坦病毒株截短的NP之间交叉反应研究表明，在NP1- 117至少有3个不同的交叉反应表位。但在SNV 和PUUV NP N端发现的交叉反应表位与HTNV，SEOV和DOBV很少有交叉反应。其原因是这两群汉坦病毒内氨基酸存在高度的同源性，汉坦病毒N端氨基酸序列比较发现，HTNV、SEOV和DOBV同源性为83. 7%～90. 7%，而SNV和PUUV为74. 4%。但在这两群病毒间总的氨基酸同源性为44. 2%～46. 5%。两群病毒内和两群病毒间的遗传差异可能是血清学反应的基础。

总之，B淋巴细胞应答研究为进一步了解抗原结构与功能之间的关系提供了新的资料，为汉坦病毒的分子生物学及抗病毒免疫研究奠定了基础，同时也为阐明HFRS和HPS的发病机制、改进诊断治疗及疫苗研制提供了新思路。我们相信随着对汉坦病毒感染免疫应答规律的不断认识，有可能从免疫应答的分子水平揭示其致病机制，为诊断、治疗和预防带来新希望。

内皮细胞不仅是机体重要的屏障和半透膜，而且具有重要的代谢和内分泌功能。血管内皮对环境及促炎症活化信号的反应可影响和指导免疫应答，导致细胞因子、趋化因子和细胞黏附分子（CAM）的局部表达，有助于循环的免疫细胞募集至损伤、炎症或病毒感染的部位。病毒感染能以多种方式导致血管内皮细胞的变化，例如，间接通过感染的或活化的淋巴细胞，触发促炎症淋巴因子的合成和局部释放，或者在免疫介质缺乏时直接诱导细胞因子、趋化因子和CAM在内皮细胞中的表达变化，来诱导内皮细胞活化。

汉坦病毒主要感染人血管内皮细胞，引起小血管和毛细血管广泛损伤，通透性增加。但体外实验发现，汉坦病毒虽可感染血管内皮细胞，却不引起明显的细胞病变，也不增加内皮细胞的通透性。提示汉坦病毒直接的细胞毒作用不是致病的主要原因，而可能作为“始动因素”，激发宿主强烈的体液和细胞免疫反应，同时产生大量的促炎症细胞因子/趋化因子，进一步活化和增强免疫功能，在清除病毒的同时，导致免疫损伤。

血管内皮是由被覆在血管腔内表面的血管单层细胞及其深层的细胞外基质（ECM）构成。血管内皮具有许多重要的功能，包括调节血管平滑肌的张力、宿主防御反应、血管生成和组织液体的稳态平衡。血管内皮的半通透屏障作用对于保证和调控各类溶质包括生物大分子和液体在血管与组织间隙间的流动非常重要，内皮屏障还控制着各类白细胞包括淋巴细胞向组织的迁移（transmigration），后者是炎症应答和免疫应答的基础。研究表明，溶质在血管内外的流动通常经由两种路径，一是跨细胞路径（transcellular pathway/route），另一是细胞旁路（paracellular pathway/route）即内皮间连接（interendothelial junctions）路径。虽然在病理或生理情况下，上述两条路径可以协同或同时起作用，但定量分析表明，在细胞和溶质向血管外的迁移/渗出中，细胞旁路是优先使用的路径。

内皮细胞之间的连接复合物（junctional complexes）主要分为：紧密连接（tight junctions）、黏附连接（adherence junctions）和间隙连接（gap junctions）（图4-2）。

紧密连接（tight junctions，TJ）多存在于内皮细胞的近腔面，是由特异的连接蛋白使邻近的两个内皮细胞之间的间隙完全闭锁。在光镜下相邻细胞的两层质膜紧靠在一起，中间没有空隙；参与紧密连接的蛋白主要包括闭合蛋白（claudin）、咬合蛋白（occludin）等。基因敲除occludin的研究显示，在丢失occludin的表达后，胚胎干细胞中紧密连接的表达并没有停止。在相邻的内皮细胞间，仍表达紧密连接。同型的claudin相互结合，形成最主要的紧密连接闭锁。因此，claudins被认为是形成紧密连接的重要结构，而occludin仅起一个辅助作用。claudin蛋白家族包括24个序列同源性相近的分子，分别命名为claudin- 1～24，相对分子质量在20～27kD，包括胞浆内的氨基端和羧基端、四个跨膜区域和两个胞外区的外环（第一个外环较长，大约由50个氨基酸组成；第二个外环较短，大约由25个氨基酸组成），这两个外环是相邻细胞膜claudins蛋白之间相互作用的位点，同时也是某些抗体或药物作用的靶位（图4-3）。

黏附连接也称附着连接（adherence junction，AJ），是指两个邻近内皮细胞之间有20～35nm的间隔，以跨膜分子钙黏蛋白（cadherins）为中心，cadherins与胞浆中的连环蛋白（catenin）连接。钙黏蛋白是一类依赖钙离子的细胞-细胞间黏附分子的家族，血管内皮细胞表达特异的内皮钙黏蛋白VE- cadherin（vascular endothelial cadherin，又称cadherin5或CD144），是内皮间黏附连接最重要的黏附成分，其位于上皮的同源分子为上皮钙黏蛋白（epithelial cadherin，E- cadherin，也称为cadherin 1）。内皮钙黏蛋白单克隆抗体可以破坏内皮黏附连接部位聚集的钙黏蛋白，引起血管通透性增加。其他引起钙黏蛋白结构和功能变化并影响血管通透性的因素还包括：①细胞内、外钙离子缺乏：钙离子有保护钙黏蛋白免受蛋白水解酶分解的作用，钙离子缺乏引起钙黏蛋白降解，促使细胞间裂隙形成。②细胞骨架收缩活动：在肌动-肌球蛋白收缩时，产生的向心力通过连环蛋白传达到细胞间的钙黏蛋白，影响黏附连接的结构和功能，带来通透性增加。③钙黏蛋白的磷酸化：组胺、凝血酶等炎性因子可引起钙黏蛋白和连环蛋白的磷酸化，从而使钙黏蛋白、连环蛋白和骨架蛋白结合数目减少，降低了细胞间黏附的强度，促进了细胞收缩和细胞间裂隙的形成。钙黏蛋白结构和功能变化是影响血管通透性的重要因素之一。其模型图如图4-4所示。

间隙连接又称缝隙连接（gap junction，GJ），在动物细胞中除了少数终末分化细胞如骨骼肌细胞和血细胞外，都存在间隙连接，体外培养细胞中也存在这种连接。在透射电镜下观察细胞超薄切片时，可以看到连接部位相邻细胞间有2～4nm的间隙，故名间隙连接。间隙连接具有传导快、低阻抗、延搁时间短的特点，主要的生理功能有以下几个方面：①协调细胞间活动的一致性。②参与信息的传递及神经冲动的传导。③参与细胞的分化生长与发育。

在上述各连接中，黏附连接是维持内皮细胞屏障功能的主要因素，由内皮细胞特殊的蛋白和血管内皮钙黏蛋白（VE- cadherin）组成。一些细胞因子如VEGF可以调控其表达，从而调节内皮的通透性。VEGFR2活化能诱导血管内皮钙黏蛋白的磷酸化，通过解离作用和细胞对VE- cadherin的内吞作用而破坏黏附连接结构的完整性，使内皮的通透性升高。新近的研究显示，HTNV和ANDV感染可以明显促进内皮细胞对VEGF诱导的VE- cadherin的内吞作用（升高达2～7倍），而Ang1或是S1P几乎可以完全阻断上述效应。相反，非致病性的TULV感染内皮细胞后无论在有否VEGF刺激的作用下VE- cadherin的内吞作用都不发生改变。这些研究结果显示致病性汉坦病毒可以提高内皮细胞对VEGF的敏感性而促进VE-cadherin的内吞作用而破坏了黏附连接的完整性，以此来调节内皮细胞的通透性。

综上所述，导致HFRS血管渗漏的机制较多，内皮细胞间的多种连接蛋白在调控血管内皮通透功能以及损伤的过程中发挥着至关重要的作用。当汉坦病毒感染血管内皮，可促使炎性介质表达上调，内皮细胞的F-肌动蛋白骨架发生重排，细胞间连接受损，内皮屏障被破坏，血管通透性增高。同时，汉坦病毒感染可诱导一些蛋白的表达，从而介导内皮细胞与基质膜之间的黏附，参与内皮屏障功能的调节。

细胞骨架（cytoskeleton）由微管、微丝和中间丝三种主要的蛋白微丝组成，参与维持细胞形态、完成细胞运动、信息传递、能量转换等多种功能。处于血管内表面的内皮细胞借助于整合素与细胞骨架结构的连接使得静止期血管的单层内皮细胞结构保持完整，并且能够瓦解已经形成的细胞屏障以适应各种显效剂的刺激。血管通透性的变化与调节涉及细胞骨架重组、黏附连接、紧密连接结构与功能改变等不同的机制，而内皮细胞收缩性改变是不同原因引起通透性增加的共同通路。内皮细胞收缩性改变主要受骨架蛋白中肌球蛋白和肌动蛋白的影响，依赖于肌球蛋白轻链（myosin light chain，MLC）的磷酸化。磷酸化的MLC活化肌球蛋白头部的ATP酶，产生的能量使细胞骨架肌动蛋白微丝（F- actin）滑动，使得细胞发生收缩。

研究认为指向细胞的向心力和确保细胞伸展以及防止细胞膜塌陷的远心力的平衡精细调控着细胞的形态。向心力是细胞骨架肌动球蛋白收缩和张力丝形成的结果，远心力主要来自细胞与细胞以及细胞与胞外基质之间的连接结构（精密连接、黏附连接、黏着斑等）。在胞内，连接结构的蛋白在辅助蛋白的作用下与肌动蛋白细胞骨架相连接，并且受到细胞骨架等很多因素的调节。向心力与远心力的平衡对内皮屏障功能的维持必不可少。

微丝与血管内皮细胞通透性调节密切相关。正常肌动蛋白微丝分布在细胞的周边部位，形成质膜下的丝束。受到组胺、TNF-α、凝血酶等炎症介质刺激时，肌动蛋白微丝可发生重组，细胞周边的纤维丝束消失，肌动蛋白在细胞内形成非极性排列成捆的纤维束即应力纤维（stress fiber）。在培养内皮细胞应力纤维的中心部位，细胞膜与底部的基质常结合紧密，形成坚实的黏附斑（focal contaet或focal adhesion plaques）。黏附斑部位细胞的质膜含有成簇的整合蛋白（integrin），整合蛋白的胞外区与特异的细胞外基质蛋白结合，而整合蛋白的胞内区与细胞骨架肌动蛋白丝连接。这样，整合蛋白与基底膜蛋白结合产生的信号，由外向内传入细胞，介导细胞骨架重排和细胞形态改变，而黏附斑的形成为细胞收缩提供了锚点。内皮细胞中应力纤维和黏附斑的形成，引起细胞的等长收缩（isometriecontraetion），细胞形态及细胞与基质之间张力变化，促进细胞间裂隙和穿细胞孔道的形成，引起通透性增加。血管内皮细胞间的连接控制内皮细胞间裂隙（gap）的形成，决定血液细胞成分及大分子物质进出血管。内皮细胞之间连接的损伤是血管内皮通透性增高和大分子透出的重要原因。

在内皮细胞肌动蛋白的形成是动态的，这使得肌动蛋白的结构得以快速重组，由以皮质肌动蛋白富集而张力丝缺乏的静止期快速转变成以较少或是皮质肌动蛋白缺如而张力丝大量表达的细胞活化状态的表型。很多分子事件触发这一重组过程，并导致了细胞的活化和收缩。

在这些分子事件中，肌球蛋白轻链（MLC）的磷酸化有赖于受钙离子-钙调蛋白调控的肌球蛋白轻链激酶（MLCK）。肌球蛋白轻链的脱磷酸作用依赖于肌球蛋白轻链的磷酸酶（MLCP），包括催化CS1β亚单位、以肌球蛋白为目标的调节亚单位（MYTP1）以及功能尚不明确的M20亚单位。MYTP1是磷酸化的，在Rho/ Rho激酶途径中受到抑制。此外，Rho激酶还能够通过直接结合与MLCK相同结合位点的残基增加MLC的磷酸化。所以说MLC磷酸化的水平主要受到细胞内相互作用的两个因素的调节，即是钙离子的浓度和小G蛋白Rho的活性。

此外，其他一些激酶也可能参与到调节MLC的磷酸化水平。蛋白激酶C（PKC）有可能参与了牛肺的内皮细胞的MLC的磷酸化。MLC磷酸化发生的场所并不同于MLCK所在的位置，而是与肌动蛋白网络的形成相一致，这不同于传统的张力丝模式。尽管不能形成收缩反应，但是肌动蛋白网络所传递的信息能够增强内皮细胞的跨细胞途径的通透性。一些观察显示蛋白激酶A（PKA）能够抑制MLCP，并且拮抗激动剂诱导的高通透性。因为PKA依赖的磷酸化能够抑制MLCK的活性。然而新近的研究表明PKA同样可以有利于MLCP对于肌球蛋白以及MLC的脱磷酸作用。所以活化cAMP /PKA途径可以考虑用来中和对于内皮细胞屏障功能的破坏作用。

对于张力丝形成的另外一个重要的调节者是肌动蛋白结合的热休克蛋白HSP27。HSP27以调节微丝蛋白的动力著称。很多研究表明在p38/MAPKAP- 2途径中HSP27的磷酸化对于调节内皮细胞的通透性和内皮细胞的收缩是非常重要的。在ATP衰竭的细胞中HSP27磷酸化的水平决定于热休克预处理所增加的丝状肌动蛋白F-actin的稳定性。张力丝诱导剂处理后的细胞其HSP27磷酸化水平也有所提高。H202处理的细胞，HSP27磷酸化似乎是细胞收缩反应的必要条件。这一反应依赖于HSP27的表达和P38的活性。然而，P- HSP27导致的细胞的收缩的反应机制还存在争议。作者推测HSP27与张力丝的分离对于细胞收缩是必要的。非磷酸化的HSP27与肌动蛋白的相互作用抑制其聚合。无论P- HSP27是否通过许多肌动蛋白结合蛋白在肌动蛋白及其诱导张力丝的效应中起作用，p38依赖的HSP27的磷酸化在张力丝形成和细胞收缩反应中起到作用。

钙调素结合蛋白是影响张力丝聚合和肌球蛋白与肌动蛋白相互作用的另外一种调节蛋白。钙调节蛋白能同时结合肌动蛋白和肌球蛋白，因此认为其在稳定肌动球蛋白中有重要作用。在静止细胞，钙调素结合蛋白能够抑制肌动球蛋白的收缩。但是在诸如钙离子-钙调节蛋白以及钙调素结合蛋白在某些蛋白激酶的作用下能够逆转钙调素结合蛋白的功能。p38和ERK都能在活化的内皮细胞中磷酸化钙调素结合蛋白。用凝血酶处理的内皮细胞该调解素蛋白与肌球蛋白分离，导致可能性的收缩，而抑制p38后，钙调素结合蛋白复合物形成并阻断了细胞的收缩。因此，钙调节素结合蛋白的磷酸化提供了p38介导的内皮细胞通透性的增加又一机制。阻断p38可能有助于阻止由于p38诱导的细胞骨架改变所致的细胞屏障功能损坏。

微管是在细胞质中延伸的动态结构，稳定细胞的形态，调节胞内的物质的运输和定位，很多信号蛋白的转位和活化有赖于微管。尤其Rho家族的GTPase和相关的蛋白，显示出对微管聚合很高的关联性。细胞骨架肌动蛋白的状态受到Rho的调节并不难理解，因为Rho决定了微管蛋白聚合和解聚的状态。所以在诱导微管蛋白解聚的诱导剂刺激后，Rho的活化以及Rho依赖的屏障功能就发生了破裂。并且凝血酶和TGFβ所介导的内皮细胞的高通透性也与微管网络末端的解聚和Rho的活化有关。微管依赖的Rho的活化有可能涉及GTP转化因子（GEF- H1）对微管的降解。GEF- H1能够减缓Rho活性的衰减，并且增强其在致通透性中的作用。

最近，另外一个小GTP酶GEF也被认为与微管的状态调节有关。Rap1 GEF Epac是cAMP敏感蛋白，可以通过PKA非依赖途径调节细胞骨架。Epac集中在微管蛋白上，对于cAMP类似物o- Me- cAMP有特殊的激活作用，导致了微管的延长，最重要的是逆转了由TNF-α和TGF-β介导的血管内皮通透性的增加。令人意外的是Epac的作用并不依赖于Rap1。有策略地阻断微管结构相关的信号途径，可以减少微管的解聚，维持微管的完整。

β3整合素不单是致病性汉坦病毒感染的主要受体，并且可能参与了血管屏障功能的维持。因此，β3整合素在汉坦病毒感染入胞及发病中的作用受到越来越多的关注。

致病性汉坦病毒NY-1、SNV、HTN、SEO和PUU能够阻断由β3整合素与配体结合所介导的内皮细胞迁移，而用抗β3抗体也可阻断β3整合素与玻连蛋白的结合而导致内皮细胞的迁移能力下降，两者的作用极其相似，但对β1所介导的迁移能力均无影响，表明只有以β3为受体的致病性汉坦病毒的感染才能抑制内皮细胞的迁移，而细胞的迁移是β3与胞外基质连接后导致黏着斑复合物活化和细胞骨架运动的结果。致病性病毒感染后对β3迁移能力下降的原因存在两种可能：①感染后ανβ3处于抑制状态，不能与胞外基质发生高亲和力结合；②致病性病毒与ανβ3 PSI结构域结合后使得ανβ3伸展并处于与胞外基质的高亲和力状态。然而，由于病毒的感染使ανβ3的功能受到影响，细胞骨架结构破坏和黏着斑复合物的形成受到抑制，进而抑制了细胞的迁移能力。

VEGF最早被称为血管通透因子，其介导液体穿过血管屏障的效应要比组胺强5000倍，能有效地介导局部组织水肿。β3整合素的胞内域与VEGF的受体VEGFR2形成功能复合体，ανβ3通常是通过调节VEGFR2的作用而影响内皮细胞的通透性。β3整合素敲除鼠和细胞受到VEGF刺激后表现出很高的通透性，表明β3整合素在调节血管对VEGF的反应中发挥作用。与β3敲除的情况相似，致病性汉坦病毒在感染后数天可以提高内皮细胞对VEGF的敏感性，使其通透性增高18～23倍。这与β3整合素功能的失活以及汉坦病毒在细胞表面形成覆盖层相关。上述研究表明致病性汉坦病毒与非活化状态的β3整合素的相互作用破坏了VEGFR2-β3整合素的功能复合体，并导致内皮细胞出现类似于β3整合素被敲除后的变化，这一重要发现为致病性汉坦病毒感染通过改变内皮细胞的功能而增加内皮细胞的通透性提供了一种合理的解释。

VEGF介导的内皮细胞通透性的改变受到内源性和外源性细胞因子的影响。例如血管生成素（angiopoietin- 1，Ang1）和神经鞘胺醇（sphingosine- 1- phosphate，S1P）都可以调节细胞对于VEGF的反应性。S1P通过与内皮细胞上Ang1受体结合而抑制内皮细胞的渗透性。S1P能够增强血管内皮细胞黏附连接中钙黏蛋白（VE- cadherin）的稳定性而增强内皮细胞的屏障作用。黏附连接是维持内皮细胞屏障功能的主要因素，由内皮细胞特殊的蛋白和血管内皮钙黏蛋白（VE- cadherin）组成。VEGFR2活化能诱导VE- cadherin的磷酸化，通过解离作用和细胞对VE- cadherin的内吞作用而破坏黏附连接结构的完整性，使内皮的通透性升高。新近的研究显示HTNV和ANDV感染可以明显促进内皮细胞对VEGF诱导的VE- cadherin的内吞作用（升高达2～7倍），而增加Ang1或是S1P几乎可以完全阻断上述效应。相反，非致病性的TULV感染内皮细胞后无论在有否VEGF刺激的作用下VE- cadherin的内吞作用都不发生改变。这些研究结果显示致病性汉坦病毒可以提高内皮细胞对VEGF的敏感性而促进VE- cadherin的内吞作用，继而破坏了黏附连接的完整性，以此来调节内皮细胞的通透性（图4-5）。

血小板数量减少和功能缺陷是HPS和HFRS最常见的病理表现之一。αⅡbβ3整合素是血小板上分布最丰富的受体（80 000拷贝/血小板）。与ανβ3类似，αⅡbβ3整合素通过其β3亚单位与病毒相互作用介导汉坦病毒的感染。致病性汉坦病毒对于β3整合素功能的调节不仅影响血管内皮细胞的功能，也可以影响血小板的功能，导致血小板的减少和血管通透性增高。静止的血小板能够黏附于感染的内皮细胞，用抗β3整合素的中和抗体或其Fab片段阻断汉坦病毒对内皮细胞的感染可以阻止这种黏附作用，表明血小板的黏附有赖于内皮细胞表面汉坦病毒的存在，并且可能与汉坦病毒感染后病毒在细胞表面所形成的覆盖层相关。静止期的血小板通过其表面的β3整合素与内皮细胞表面覆盖的病毒相连，在内皮细胞表面形成了覆盖层并且改变了与内皮细胞黏附的性质。在HPS患者肺部的毛细血管，血小板覆盖在内皮细胞上可能影响氧气交换，加重缺氧和低氧诱导因子（hypoxiainduciblefactor- 1α，HIF- 1α）诱导的VEGF的生成导致肺部的渗出和水肿。以上表明，HPS患者严重的缺氧和血浆渗出可能均与汉坦病毒感染导致的β3类整合素的功能失衡有关，血小板的损伤不仅影响患者的凝血功能，而且与血管内皮通透性的增强密切相关（图4-6）。

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一种糖蛋白，分子量为34 000～46 000Da。人VEGF基因定位于染色体6p21. 3，编码区全长14kb，包含8个外显子和7个内含子，由于外显子选择性剪切方式的差异可产生同源异构体，如VEGF- 121、VEGF- 145、VEGF- 165、VEGF- 189、VEGF- 206等，它们具有不同的生物学特性。大多数产生VEGF的细胞，优先表达VEGF165、VEGF121和VEGF189。其中VEGF165是主要的效应分子。VEGF可导致微血管通透性增高，血浆蛋白渗漏。因此，也被称为血管通透因子（vascular permeability factor，VPF）。

VEGF的生物学特性主要表现在两方面，增加微血管的通透性和特异性地与血管内皮细胞受体结合，促进血管内皮细胞的分裂和增殖，进而导致新生血管的生成。体外细胞培养研究发现，VEGF与内皮细胞受体结合后，可立即引起钙离子内流，数秒钟细胞内钙离子浓度升高4倍以上，并且刺激三磷酸肌醇的累积。增强血管的通透性是VEGF的重要作用之一，单次注射可引起一过性的、可逆性的通透性增高，这种作用十分强烈，由于它通过与受体结合发挥作用的，所以，这种作用不被组胺或其他炎症因子抑制剂所阻断。超微结构研究显示，VEGF处理后的血管内皮细胞出现内皮间的大量裂隙及血管基底膜的退行性病变。对登革出血热（dengue hemorrhagic fever，DHF）的研究表明，急性期患者外周血的可溶性VEGF受体2（sVEGFR2）分子及其与VEGF的复合物明显减少，而血管内皮细胞表面的VEGF- R2增多导致VEGF相应增多和作用增强，且与临床血管渗漏的轻重密切相关。

许多细胞因子和生长因子可以上调VEGF mRNA的转录或者诱导VEGF的分泌。包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、转化生长因子-α（TGF-α）、转化生长因子-β（TGF-β）、成纤维细胞生长因子-4（FGF-4）、角蛋白细胞生长因子- 7（KGF/FGF- 7）、表皮生长因子（EGF）、白介素-1α（IL- 1α）、白介素- 1β（IL- 1β）、白介素-6（IL-6）和胰岛素样生长因子- 1（IGF- 1）等。此外，组织因子的细胞质尾区，即跨膜蛋白的胞内小区，是凝血因子Ⅶ/Ⅶa的受体，可调节VEGF的表达，与一些特定部位的创伤密切相关。缺氧可以导致VEGF mRNA快速大量的转录和表达。有趣的是，其他VEGF家族的成员和bFGF不能被缺氧所诱导。其原因可能是缺氧细胞释放的腺嘌呤核苷酸与腺嘌呤核苷酸A2受体结合，通过cAMP依赖蛋白激酶（PKA）路径上调VEGF表达。HFRS患者病程中出现的低氧饱和度可能有助于VEGF的产生，并参与血管渗漏的形成。缺氧反应原件（hypoxia response element，HRE）作为一个增强子可以激活VEGF上游基因。HRE包含了一个一致性结合位点，是缺氧诱导因子1（hypoxia- inducible factor- 1，HIF- 1）和芳烃受体核转运蛋白ARNT的异源二聚体。HIF- 1α是目前发现的唯一特异性缺氧状态下发挥活性的转录因子，而HIF- 1α是唯一的氧调节亚单位。通过改变细胞信号转导途径（PKC途径和cAMP /PKA途径）可以调控VEGF的表达。促进VEGF释放的因子包括Sp1、AP- 1和AP- 2，它们与VEGF有着潜在的结合位点，并且受PKC和PKA的调控，从而影响VEGF的表达。

VEGF的生物效应是依靠与血管内皮细胞表面特异受体的结合而实现的。目前发现的VEGF受体有3种：VEGFR1（Flt- 1）、VEGFR2（KDR）和VEGFR3 （Flt-4），均属于酪氨酸激酶受体家族。此外，还有两种复合受体NP1和NP2为非酪氨酸蛋白激酶跨膜受体。VEGFR1和VEGFR2主要在血管内皮细胞上表达，且与VEGF具有高度的亲和力。但研究发现其功能却存在差异。缺乏Flt- 1受体的小鼠主要表现为大小血管内皮细胞的损害，但内皮细胞的分化却未见异常；而Flk- 1受体缺乏小鼠存在内皮细胞成熟障碍和造血祖细胞的严重减少。

VEGF2又称为激酶插入区受体，大小为200～230kD，是VEGF的高亲和力受体，在调节血管内皮细胞通透性增加以及细胞存活、增殖、迁移中起主导作用。丙氨酸扫描诱变（alanine- scanning mutagenesis）显示Arg82、Lys84和His86是VEGF结合到VEGFR2的关键位点，这些氨基酸所在的区域位于VEGF单体结构的一端，通过二硫键连接形成二聚体，其两端为受体结合的区域。Gille等的研究显示单独激活VEGFR2即可引起微血管通透性增加，表明了VEGFR2是介导血管通透性增加的主要受体。

近年，VEGF- VEGFR在汉坦病毒感染引起血管通透性增加中的作用已见报道。Gavrilovskaya等研究表明，致病汉坦病毒（如汉滩型、安第斯型和纽约型汉坦病毒）感染可以明显增强体外培养的血管内皮细胞对VEGF的敏感性，导致内皮通透性增高，而非致病的希望山型和图拉型病毒则无此效应。结合目前对于VEGF、VEGFR2与内皮钙黏蛋白相互作用的研究，他们认为汉坦病毒与β3整合素结合后可以通过某种未明的机制导致VEGF与VEGFR2的结合增强和后者的活化，VEGFR2活化后其胞内段磷酸化，引起内皮钙黏蛋白内化和分子间结合的破坏，导致黏附连接结构的变化及内皮通透性增加。李彧等观察了68例HFRS患者不同病期血浆VEGF、sVEGFR2等细胞因子水平的动态变化。结果显示，与健康对照者相比，患者低血压休克期VEGF表达量增高，而sVEGFR2表达量降低。其后对20例HFRS各病期连续动态的血标本进一步检测表明，VEGF在病程5期的变化与前期检测的结果类似，发热期水平较低，进入低血压休克期后急剧增高，至少尿期、多尿期后逐渐下降。由此推测，HFRS患者低血压休克期严重的血管渗漏可能与各种原因导致的VEGF大量释放密不可分。

任何刺激均需通过相应的信号转导系统，将刺激信号传入内皮细胞（endothelial cell，EC）中，才能对内皮屏障功能产生影响。G蛋白、磷脂酶C（PLC）、蛋白激酶C（PKC）、酪氨酸激酶（TK）及肌球蛋白轻链（MLC）均参与了内皮屏障功能调节的信号转导。

G蛋白是一类由Gα、Gβ、Gγ亚基构成的异三聚体蛋白，有G _s、G _i、G _q、G ₁₂四类共十几种亚型。G蛋白与膜受体偶联，将刺激信号传至PLC（特别是PLCβ）、磷脂酶A ₂（PLA ₂）、腺苷酸环化酶（AC）、磷酸二酯酶和离子通道。G蛋白激活是从受体将信号传入EC，并触发细胞骨架收缩过程中的关键环节之一。配体与特异受体结合，导致不同G蛋白亚型的激活。例如H ₁组胺受体激活时，胞内三磷酸肌醇（IP ₃）和Ca ²⁺水平升高，提示该反应可能与G _i或G _q蛋白偶联。而H ₂组胺受体受到刺激时，AC被活化，cAMP含量增加，表明H ₂受体与G _s蛋白偶联。G蛋白对刺激信号有放大作用。一个受体可与多个G蛋白偶联，而一个G蛋白可同时激活多条信号通路。

PLC的主要作用底物是三种磷脂肌醇，即4，5-二磷酸磷脂肌醇（PIP ₂），4-磷酸磷脂肌醇（PIP）和磷酸磷脂肌醇（PI）。PIP ₂水解产生IP ₃和二酰基甘油（DAG）。PIP和PI水解只产生DAG，不产生IP ₃。IP ₃与内质网上的受体结合使内贮Ca ²⁺释放入胞浆，导致［Ca ²⁺］ _i升高。实验发现，α-凝血酶刺激培养牛肺动脉内皮细胞（BPAEC）后，10秒内IP ₃水平明显升高，20秒降至基础水平；［Ca ²⁺］ _i约17秒升至峰值，从基础水平（59± 8）nmol/L升至（1014±172）nmol/L，接着缓慢下降，（51±3）秒内降至峰值一半。［Ca ²⁺］ _i升高的第一时相由细胞内贮Ca ²⁺释放引起，第二时相则由Ca ²⁺内流引起。磷脂肌醇水解产生的第二信使DAG和IP ₃是α-凝血酶诱导上皮通透性增高的关键信号。

Ca ²⁺和DAG通过多条效应途径参与内皮屏障功能调节。Ca ²⁺和DNG均可直接激活PKC；［Ca ²⁺］ _i升高也能激活PLC和PLA ₂。PLC和PLA ₂分解膜磷脂产生DAG和花生四烯酸。后两者具有潜在激活PKC的活性，这可能是炎性介质引起内皮通透性增高后纤维较长时间的机制之一。花生四烯酸代谢产生可能也参与了内皮屏障功能的调节。以去甲二氢愈创木酸抑制花生四烯酸的脂氧化酶代谢途径，结果［Ca ²⁺］ _i升高的第二时相消失，也抑制α-凝血酶诱导的血管内皮通透性增高。

组胺、α-凝血酶等炎性介质可引起内皮屏障功能损害。它们通过与膜上的受体结合，激活偶联G蛋白，进一步激活PLC。氧自由基、血流剪切力损伤内皮屏障则不经受体结合，直接激活PLC。上述两类损伤因素激活PLC的途径虽不同，但最终都激活PKC。

PKC是参与细胞信号转导的一组重要蛋白质。目前，在哺乳动物中至少发现10种亚型，均具有不同的底物特异性。根据其对Ca ²⁺、DAG和磷脂酸丝氨酸（PS）三种激活剂的反应分成三类：第一类包括α、β1、β2和γ，均能被三种激动剂激活；第二类包括ε、δ、θ和η，由PS和DAG激活，对Ca ²⁺不敏感；第三类包括ξ和λ，由PS激活，对DAG和Ca ²⁺不敏感。研究发现，α-凝血酶诱导内皮通透性增高时，［Ca ²⁺］ _i升高，PKC激活；阻断Ca ²⁺内流，则PKC激活和内皮通透性增高受到抑制。参与内皮屏障功能调节的PKC亚型尚不完全清楚，但已知由Ca ²⁺激活的PKC主要是PKC-α和PKC-β。凝血酶和过氧化氢诱导的内皮通透性增高由Ca ²⁺激活的PKC介导；缓激肽诱导的内皮通透性增高则由DAG激活的PKC介导。这表明内皮通透性调节的信号转导随激动剂不同而有差异。EC中PKC激活分为两个时相，第一时相快速、短暂，主要由DAG和Ca ²⁺快速增加引起；第二时相出现较晚，持续时间较长（约1小时），可能仅由DAG引起。介导第二时相的DAG来源于PLC和磷脂酶D（PLD）水解磷脂酰胆碱。

内皮屏障功能受损的另一条途径由TK介导。TK的主要作用是使细胞骨架蛋白如纽带蛋白、踝蛋白（talin）、β-连环蛋白（β- catenin）磷酸化，从而使细胞之间、细胞与基膜之间的连接发生改变，EC收缩变圆，内皮通透性增高。炎性介质如α-凝血酶诱导的TK激活可能由跨膜G蛋白介导。PKC激活和［Ca ²⁺］ _i升高也与TK介导的蛋白磷酸化有关。TK参与内皮屏障功能调节的机制尚待进一步研究。

近年来关于磷酸化和去磷酸化的研究备受重视，认为磷酸化和去磷酸化是细胞信号转导的公共通路或最后通路。蛋白磷酸化和去磷酸化几乎调节着生命活动的所有过程。内皮通透性调节即是通过MLC和其他蛋白的磷酸化和去磷酸化实现的。

研究体外培养的人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）和牛肺动脉内皮细胞（BPAEC）单层发现，肌球蛋白轻链激酶（MLCK）激活时，EC间裂隙形成，胞内ATP、Ca ²⁺、钙调蛋白（CaM）含量及MLC磷酸化水平升高。基础状态下EC内即存在MLC磷酸化，F-肌动蛋白骨架也表现出中心张力。当EC受到凝血酶或组胺刺激时，MLC发生快速单磷酸化和双磷酸化，诱导肌动-肌球蛋白间相互作用，中心张力增高，EC间隙形成，内皮通透性增高。凝血酶刺激后15秒即有MLC磷酸化增加，峰值则出现在刺激后1～2分钟，约有60%～80%的MLC发生磷酸化并主要以双磷酸化的形式存在。预先加入MLCK抑制可阻断凝血酶引起的MLC磷酸化和EC单层通透性增高。

有人对MLC磷酸化过程提出如下假设：PLC介导PKC活化和［Ca ²⁺］ _i升高；再由Ca ²⁺与钙调蛋白结合形成Ca- CaM，激活MLCK；最后由MLCK介导MLC磷酸化，Ca- CaM活化MLCK的过程需要PCK参与。cAMP对内皮通透性增高抑制作用，机制尚不清楚。加入外源性的cAMP可减弱炎性介质诱导的MLC磷酸化，表明cAMP保护内皮屏障功能的机制与MLC磷酸化有关。β ₂-肾上腺素受体激动剂formoterol和异丙肾上腺素能促进cAMP合成增加，故对内皮屏障功能有一定的保护作用。

EC受到组胺、凝血酶刺激后，MLC去磷酸化水平迅速升高，5～30分钟内快速下降。MLC去磷酸化可能是MLCK被激活后又迅速失活，或MLC特异性的磷酸酯酶活性增高，也可能与两者均有关。内皮受凝血酶刺激后5分钟内由基础水平的0. 64N/ cm ²增至1. 3N/cm ²，并持续40分钟以上。可见MLC去磷酸化与中心张力变化存在时相上的差异。推测EC收缩存在类似于平滑肌收缩时的“门栓状态”（latch bridge），即中心张力和细胞收缩状态的维持与MIC磷酸化无关。有关EC中MLC特异性磷酸酯酶活性的调节，目前知之不多，有人认为MLC的去磷酸化与L型丝氨酸/苏氨酸磷酸酯酶有关。

多数炎性介质引起的内皮通透性增高是可逆的。Khimenko实验室的工作表明，下列因素可使内皮通透性高发生逆转：①β-受体激活；②腺苷A ₂-受体激活；③腺苷酸环化酶（AC）激活；④加入cAMP类似物；⑤抑制磷酸二酯酶。其机制与EC中cAMP含量增加有关。

内皮通透性增高还可发生自然“关闭”。例如，用α-凝血酶连续灌注肺血管，10分钟后毛细血管滤过系数升至峰值；停止灌注后40分钟，滤过系数恢复正常；EC收缩和细胞间隙增宽也在30分钟内恢复正常。内皮通透性增高“关闭”的机制涉及信号转导过程的多个环节：①介质受体失敏：α-凝血酶引起凝血酶受体失敏是受体蛋白被水解，使EC膜上的功能受体数下降所致。Vu等认为，一旦α-凝血酶引起内皮通透性增高，即不能再激发第二次反应。只有当新的受体合成并转移至胞膜表面时，才能对刺激产生新的反应。受体失敏的另一机制是受体内化，缓激肽刺激可使其位于EC胞膜上的受体数因内化而下降约70%。β-肾上腺素受体则可因磷酸化而失敏。②PKC激活的负反馈通路抑制了与内皮通透性增高有关的信号转导，如PKC可使PLC与G蛋白之间失偶联，从而抑制了内皮通透性的增高。③内源性PKC抑制剂使PKC活性受到特异性调节。④磷酸二酯酶活化和MLCK失活。前者使磷酸化MLC水解增多，后者使磷酸化MLC形成减少。⑤可能与EC中的前列环素产生增加有关；⑥G蛋白下调，原因尚不清楚。可见内皮通透性“关闭”的机制十分复杂，某些环节有待进一步探讨。

目前，对内皮屏障功能调节的机制已有深入的认识，但也存在一些不同的观点。例如多数人认为Ca- CaM激活MLCK是MLC磷酸化和F-肌动蛋白肌架重排发生的机制，PKC的作用是介导Ca- CaM的形成。但有人用药物阻断［Ca ²⁺］ _i升高和PKC的激活并不能抑制MLC磷酸化和F-肌动蛋白骨架重排，推测有另外的机制参与。甚至有人认为，炎性介质引起的内皮通透性增高与F-肌动蛋白骨架重排和EC收缩无关。因此，内皮屏障功能的调节机制亟待进一步研究。

汉坦病毒感染引起以“血管内皮细胞通透性升高”为主的病理生理变化，除与病毒受体、固有免疫和适应性免疫有关外，个体的遗传背景、细胞凋亡和氧化应激等在汉坦病毒的致病机制中也发挥了重要作用。

细胞信号转导系统（signal transduction system or cell signal system）由受体或其他可接受信号的分子以及细胞内的信号转导通路组成。在病毒感染后，机体信号转导系统发生了重要变化，在细胞水平上导致细胞生理活动的异常，在整体水平上则表现为临床症状和体征。炎症（inflammation）作为机体对局部损伤的一种复杂反应，病毒感染后的免疫反应可以诱发炎症的产生。炎症反应包含了一系列的炎症介质（inflammatory mediators）如炎性细胞因子（inflammatory cytokines）的释放和白细胞募集到炎症位点活化并进一步造成炎症介质的释放的过程。急性炎症反应表现为血管舒张，毛细血管通透性增加，炎症细胞如中性粒细胞迁移流入以及炎症介质的广泛作用造成的发热等。慢性炎症反应则是巨噬细胞、淋巴细胞和纤维细胞的渗出导致和持续炎症、纤维细胞增生及瘢痕形成。在汉坦病毒感染机体后，引起机体免疫应答的同时，也活化了各种细胞信号，从而导致炎症因子释放，产生炎症反应。细胞信号转导通路参与了炎症反应过程中和各个阶段，从病毒识别和炎症反应的启动，炎症介质的释放和炎症反应的放大，到炎症细胞的迁移直至最终炎症反应的消除等。

目前，在人类已发现有10种Toll样受体（Toll- like receptors，TLRs）家族成员。每种TLR可以识别不同的细菌或病毒产物。

所有的TLRs都能够激活NF-κB和MAPK通路（包括ERK、JNK和p38），而一个含有TIR域的胞浆接头蛋白MyD88在这个过程中起着关键作用。TLRs与配体的结合导致其构象发生改变，使得MyD88与其结合。MyD88还含有一个死亡域（death domain，DD），通过这个结构域MyD88又与含有DD域的白介素- 1受体结合激酶（IL-1 receptor associated kinases，IRAKs）家族成员结合。IRAKs进一步磷酸化TRAF6（肿瘤坏死因子受体结合因子6，TNF receptor- associated factor 6）。磷酸化的TRAF6可激活一个叫做转化生长因子β激活酶的激酶（transforming growth factor-β- activated kinase，TAK1）的MAPKKK，TAK1又依次激活下游的MKK3或MKK6，最后活化p38和JNK。对ERK的激活则是通过一个称为Tp12的MAPKKK及MKK1或MKK2完成的。

对NF-κB通路的激活也是通过TAK1执行的。NF-κB的激活在炎症反应中起着中心作用，它调控许多与炎症有关的基因表达，包括趋炎性细胞因子、细胞黏附因子、趋化因子、生长因子及一些可诱导的酶如环氧化酶2（cyclooxygenase 2，COX2）和可诱导的NO合酶（inducible NO synthase，iNOS）等。正常情况下，NF-κB与其抑制性蛋白IκBα结合在一起没有活性。TAK1可激活NIK（NF-κB诱导激酶），NIK再进一步激活一个由IKKα、IKKβ、IKKγ构成的IKK（IκBα激酶）复合物，其中具有催化活性的IKKβ可磷酸化IκBα，导致IκBα的泛素化降解，从而释放出NF-κB。此时，NF-κB可转位进入细胞核，启动基因的转录，其中包括了许多参与炎症反应的因子如TNF-α、IL- 1、IL-6、IL-8等。

所有的TLRs都可以通过MyD88诱导一系列的反应，但是TLR还可以通过一些非MyD88通路诱导不同基因的表达。比如，TRIF（TIR domaincontaining adaptor- inducing IFN-β，又称TICAM- 1）是一个含有TIR域的接头蛋白，可与TLR结合而激活两个非典型的IKK成员IKKε和TBK1，导致NF-κB和另一个转录因子IRF3（IFN regulator factor 3，干扰素调节因子3）活化。IRF3可诱导IFN-α、IFN-β和其他一些基因的表达。由此产生的IFN-α、IFN-β等又通过作用于它们自己的受体激活JAK- STAT通路，导致更多基因的表达，其中包括很多与抗病毒感染及炎症反应有关的基因IP- 10（IFN inducing protein 10）和iNOS等。此外，MAPK也可被非MyD88依赖性通路激活。

各种病原体可以通过TLR激活多条信号转导通路，导致转录因子的活化，从而刺激许多与炎症相关基因的表达，如炎症细胞因子、趋化因子等。这些因子又可以与炎细胞受体结合，使得炎细胞进一步活化以及炎症反应放大，造成“炎症级联反应”（inflammatory cascade）。

Syk是非受体型酪氨酸激酶（non- receptor tyrosine kinase，NRTK）Syk家族的成员，也称p72Syk，表达于大部分造血细胞，B细胞表达水平最高。Syk也参与整合素和G蛋白偶联受体信号转导通路的活化，与内皮细胞有密切的联系，在调节内皮细胞功能和维持血管内皮完整性中发挥至关重要的作用。Syk的N端有两个串联的SH2结构域，C端有一个SH1激酶结构域，其中两个SH2结构域可以与多种免疫受体胞质区磷酸化的免疫受体酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine- based activation motif，ITAM）结合，参与免疫受体活化信号的转导。

炎症介质包括IL- 1、TNF-α、IFN-γ、IL-12、IL- 18及粒-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte- macrophage colony- stimulating factor，GM- CSF）等炎性细胞因子和IL-4、IL- 10、IL- 13、IFN-α、TGF-β等抗炎性细胞因子。这些细胞因子激活的细胞内信号转导通路最终都导致一些转录因子的活化，如NF-κB（通过IL- 1、IL- 18或TNF-α的作用），Smad（TGF-β），STAT（IL-6、IL- 10、IL- 12、IFN-γ）等。而这些转录因子又可以激活一些与炎症反应有关的细胞因子的表达从而形成了一个细胞因子级联反应。

随着对信号转导系统研究的深入，人们逐渐认识到通过对信号转导系统进行调控可以减轻甚至逆转疾病的发生、发展。针对不同信号系统及其致病机制，可应用不同分子包括信号分子、信号分子的抗体、受体拮抗剂、受体的抗体或蛋白激酶抑制剂等进行调控。

一氧化氮（NO）是具有多种生理功能的细胞内和细胞间信号传递分子。其主要生理功能包括：①是体内信号传递的生物学介质；②可以调节血管张力；③是宿主免疫系统的防御因子。作为一种氧自由基（a free oxygen radical），NO也是一种病理过程中的细胞毒性因子（cytotoxic agent）。

NO是由一氧化氮合成酶（nitric oxid synthases，NOSs）产生，后者分为内皮细胞源性NOS （eNOS，NOSⅠ），中性粒细胞源性NOS（nNOS，NOSⅢ）和诱导型NOS（iNOS，NOSⅡ）三类，前两类NOS为组成型表达，后者由免疫刺激细胞因子（IFN-γ、TNF-α和IL- 1B）、细菌产物或感染诱生。iNOS催化合成的NO产量可以超过另外两种NOS的10～100倍。NO可由氨基酸代谢产生：L- arginine→NO + L- citrulline（胍氨酸）。

NO与病毒感染的关系表现在：NO对某些病毒具有确定的抗病毒效应；NO在病毒感染过程中也参与某些病理过程。因此，NO的功效具有双重性，对于某些病原体是控制（如感染鼠的Coxsackie virus），同时也参与某些病毒感染的致病过程（如鼠流感病毒感染），对于对某些病毒感染（如鼠肝炎病毒感染）无病理学意义。

NO在HFRS/HPS感染发病中的主要意义在于：①在HFRS/HPS感染动物或患者体内可以检测到NO水平升高；②用野生型PUUV感染猴后可以观察到NO水平升高。然而NO在汉坦病毒感染中的潜在作用目前仍不明确。瑞典的Klingstrom J等初步研究发现：DOBV引起的乳小鼠致死性感染可以诱生高水平的NO；NO可以抑制体外细胞培养中致病汉坦病毒如HTNV、DOBV、PUUV和SNV的复制，并且可以灭活成熟的游离病毒；体外内皮细胞或单个核细胞感染HTNV并不能直接诱生NO；汉坦病毒感染成年小鼠也不能诱生全身性的NO增多；因为即使在NO合成酶遗传缺陷小鼠仍可产生正常的Th1型细胞免疫应答和中和抗体，因此NO的产生及其有无似与鼠体内汉坦病毒的清除无关。

细胞凋亡是生物体内细胞在特定的内源和外源信号诱导下，其死亡途径被激活，并在有关基因的调控下发生的程序性死亡过程。细胞凋亡是程序性死亡过程的一种主要形式，也是细胞生理性死亡的普遍形式，其过程涉及染色质凝聚和外周化、细胞质减少、核片段化、细胞质致密化、与周围细胞联系中断、内质网与细胞膜融合，最终细胞DNA片段化，细胞皱缩分解形成许多细胞凋亡小体，被邻近细胞或巨噬细胞吞噬，但不发生炎症。越来越多的研究表明，病毒感染与靶细胞凋亡之间存在着密切的联系，从病毒与宿主细胞的相互作用来看，宿主细胞的凋亡，导致被感染细胞的死亡和病毒的清除，被病毒感染的细胞发生凋亡是机体对病毒的一种抗病毒防御机制；相反，病毒为了生存与扩散，其产物也可抑制被感染细胞发生凋亡，这是病毒的一种生存机制。在病毒感染引起细胞凋亡的过程中也有许多基因和蛋白表达，免疫细胞和细胞因子也直接或间接的参与了凋亡过程。由此可见，病毒与其感染的宿主细胞凋亡的相互关系十分复杂。

近年来，已有若干学者报告了汉坦病毒感染体外多种培养细胞均可引起不同程度的细胞凋亡。美国陆军传染病研究所Markotic等研究发现，多种汉坦病毒感染均可引起感染的人胚肾细胞（HEK293）发生明显的细胞病变作用（CPE），同时汉坦病毒感染还诱导HEK293细胞发生凋亡，但是细胞凋亡主要发生于未感染的细胞和感染周边的细胞，而很少发生于被感染的细胞。普马拉病毒（Puumala virus）核衣壳蛋白可与Fas介导凋亡的增强子Daxx相互作用，但是肿瘤坏死因子（TNF）受体超家族成员在凋亡中不发挥作用。芬兰赫尔辛基大学Li等也发现，图拉病毒（Tula virus）感染可启动Vero- E ₆细胞的凋亡程序，图拉病毒的复制也需要caspase 3的活化和多聚（ADP-核糖）聚合酶的水解，而这两种分子均为细胞凋亡的标志性分子。而应用TNF-α处理可使细胞发生凋亡的时间提前。而在感染后4天，caspase 8和caspase 3几乎同时活化，提示图拉病毒感染可启动典型的细胞凋亡程序，而caspase 8的活化在其中也发挥重要作用。进一步的研究还发现，图拉病毒在Vero- E ₆细胞中启动的多种程序性死亡均与内质网应激（ER stress）密切相关，图拉病毒可早期活化内质网原位的caspase 12，诱导Jun氨基末端激酶（JNK）及其下游靶向转录因子c- jun的磷酸化，诱导促凋亡转录因子、生长停滞和诱导DNA损伤基因153（Gadd153）、C/EBP同源蛋白（chop）的表达，内质网膜蛋白BAP31的改变提示其与线粒体凋亡途径具有相互作用。同时，持续的内质网应激也可诱导内质网诱导蛋白Grp78/BiP表达升高。最新的研究还发现，汉滩病毒（Hantaan virus）核衣壳蛋白（HTNV N）可调节感染细胞的凋亡。Ontiveros等研究发现，表达缺失270～330位氨基酸突变的HTNV N蛋白的细胞caspase 7和caspase 8的表达升高，表达HTNV N蛋白的细胞受TNF受体刺激后可抑制核因子kappa B（NF-κB）的核移位，抑制caspase的活化。相反，表达缺失270～330位氨基酸突变的HTNV N蛋白的细胞却不能抑制NF-κB的核移位，同时却可启动caspase的活化。提示核蛋白270～330位氨基酸是汉滩病毒调节凋亡的重要表位。

细胞凋亡的现象在汉坦病毒感染的患者中也发挥重要的作用。瑞典传染病防控所Klingstrom等对普马拉病毒感染患者血清中多种因子进行了检测。由于毛细血管渗漏是汉坦病毒感染的重要特征，研究发现，血清乳酸脱氢酶（LDH）在普马拉病毒感染患者血清中的表达显著升高，提示细胞发生损伤。同时，血清穿孔素、粒酶B、上皮细胞凋亡标记因子——caspase水解细胞角蛋白- 18在普马拉病毒感染患者血清中表达也显著升高，LDH水平与穿孔素水平、caspase水解细胞角蛋白- 18的水平均呈显著正相关。提示组织损伤是由机体免疫应答引发的，而内皮细胞凋亡在组织损伤中发挥重要作用。第四军医大学金伯泉教授课题组对40例肾综合征出血热（HFRS）患者外周血单个核细胞（PBMC）中凋亡诱导受体：TNF-α、FasL和TRAIL及其在血浆中的可溶形式进行了检测，发现膜表达的FasL和TRAIL 在HFRS患者PBMC中表达升高，特别是在CD8 ⁺T淋巴细胞中升高尤为明显。血浆中TNF-α、可溶性FasL和可溶性TRAIL在急性期患者中表达均显著升高，提示细胞凋亡在HFRS发病中发挥重要作用。

由于T细胞识别抗原受HLA限制，因此认为HLA型别可能与发病有一定的关系。近年对一些疾病研究证实，病原体感染后病情轻重和转归与患者的HLA遗传背景有关。Mustouen等在74例流行性肾病（NE）患者中，研究了HLA遗传易感性。结果表明，重症患者有很高的HLA- B8、C4A* Q0和DRB1* 0301（DR3）基因频率。在7例休克患者（100%）、13例透析患者中的9例（69%）和全部患者中的25例（34%）均检测到HLA- B8基因型。而在93例对照组仅检测到14例（15%）。说明HLA单元型与急性病毒性疾病或肾炎的轻重有密切的关系。该作者后来又随机从76位住院NE患者中选取了6位，检测其HLA型别，结果表明他们均为HLA- B27，且临床经过均较轻，没有一位患者有严重的并发症，肾功能损伤也较轻。平均住院时间仅为其他患者的一半（ P=0. 004）。

芬兰赫尔辛基大学的Plyusnin等应用RT- PCR分析了20例1994年10月至1995年1月芬兰住院的NE患者，其中7例患者的血或尿标本PCR阳性，所有阳性患者均为HLADRB1* 0301或HLA B8等位基因型，已知这些基因型多与重型NE患者相关。从3例重型NE患者扩增的M或S基因序列的分析表明其为PUUV，与此前在芬兰分离的毒株序列有所不同。其中M基因与患者居住地附近捕获的棕背 体内病毒的M基因高度同源，同源性为98. 2%，而相应S基因的同源性仅为95. 8%。这种M与S基因同源性的差异度（1. 8%和4. 2%）与既往有关PUUV基因变异的研究结果相悖，推测可能当地某些流行毒株发生了基因重排。

Makela也进行了有关NE发病遗传背景的研究，发现TNF等位基因2的患者同HLA- B8 或HLA- DR3一样，易患重型流行肾病（NE）。已知在北欧地区，TNF等位基因2与HLA- B8、DR3有密切的连锁不平衡（linkage disequilibrium），因此TNF等位基因2对于重型NE患者可能并非独立的危险因素，而仅仅在HLA单元型人群中具有一定的优势。他们调查了116位住院治疗的NE患者的HLA- B和HLA- DRB1等位基因，发现所有患者中28%（33例）为HLA- B8和HLA- DR3阳性，其中59%是TNF 2携带者，而所有患者的42%为TNF 2携带者。116例患者中共发生休克10例（9%），全部为HLA- B8和HLA- DR3阳性，10例中9例同时为TNF 2携带者。进一步比较了TNF 2阳性和阴性患者及HLA- B8和HLA- DR3阳性患者的血压及部分化验数据，发现前者的大部分观察项目阳性与阴性患者均有显著差异，而后者无一项差异显著。因此认为HLA- B8和HLA- DR3与患者的临床轻重关系较为密切，而TNF 2基因型与患者的病情似无明显关系。

1. Gahmberg CG，Fagerholm SC，Nurmi SM，et al.Regulation of integrin activity and signalling.Biochim Biophys Acta，2009，1790：431-444

2. Buranda T，Wu Y，Perez D，et al.Recognition of decay accelerating factor and alpha（v）beta（3）by inactivated hantaviruses：Toward the development of high- throughput screening flow cytometry assays.Anal Biochem，2010，402：151- 160

3. Krautkramer E，Zeier M.Hantavirus causing hemorrhagic fever with renal syndrome enters from the apical surface and requires decay- accelerating factor（DAF/CD55）.J Virol，2008，82：4257-4264

4. Choi Y，Kwon YC，Kim SI，et al.A hantavirus causing hemorrhagic fever with renal syndrome requires gC1qR/ p32 for efficient cell binding and infection.Virology，2008，381：178- 183

5. Ogino M，Yoshimatsu K，Ebihara H，et al.N- acetylgalactosamine（GalNAc）- specific lectins mediate enhancement of Hantaan virus infection.Arch Virol，1999，144：1765- 1777

6. Jin M，Park J，Lee S，et al.Hantaan virus enters cells by clathrin- dependent receptor- mediated endocytosis.Virology，2002，294：60-69

7. Björkström NK，Lindgren T，Stoltz M，et al.Rapid expansion and long- term persistence of elevated NK cell numbers in humans infected with hantavirus.J Exp Med，2011，208（1）：13- 21

8. Peebles RS，Graham BS.Viruses，dendritic cells and the lung.Respir Res，2001，2（4）：245- 249

9. Banchereau J，Steinman RM.Dendritic cells and the control of immunity.Nature，1998，392（6673）：245- 252

10. Klagge IM，Schneider- Schaulies S.Virus interactions with dendritic cells.J Gen Virol，1999，80（4）：823-833

11. Raftery MJ，Kraus AA，Ulrich R，et al. Hantavirus infection of dendritic cells. J Virol，2002，76（21）：10724- 10733

12. Temonen M，Mustonen J，Helin H，et al.Cytokines，adhesion molecules，and cellular infiltration in nephropathia epidemica kidneys：an immunohistochemical study.Clin Immunol Immunopathol，1996，78（1）：47- 55

13. Green S，Vaughn DW，Kalayanarooj S，et al.Early immune activation in acute dengue illness is related to development of plasma leakage and disease severity.J Infect Dis，1999，179（4）：755- 762

14. Prescott J，Ye C，Sen G，et al.Induction of innate immune response genes by Sin Nombre Hantavirus does not require viral replication.J Virol，2005，79：15007- 15015

15. Prescott J，Hall PR，Bondu- Hawkins VS，et al.Early innate immune responses to Sin Nombre Hantavirus occur independently of IFN regulatory factor 3，characterized pattern recognition receptors，and viral entry.J Immunol，2007，179：1976- 1802

16. Spiropoulou CF，Albarino CG，Ksiazek TG，et al.Andes and Prospect Hill Hantaviruses differ in early induction of interferon although both can downregulate interferon signaling.J Virol，2007，81：2769- 2776

17. Stoltz M，Ahlm C，LundkvistÅ，et al.Lambda interferon（IFN-λ）in serum is decreased in Hantavirus- infected patients，and in vitro- established infection is insensitive to treatment with All IFNs and inhibits IFN-γ- induced nitric oxide production.J Virol，2007，81：8686-8691

18. Oelschlegel R，Kruger DH，Rang A.MxA- independent inhibition of Hantaan virus replication induced by typeⅠand typeⅡinterferon in vitro.Virus Res，2007，127：100- 105

19. Jiang H，Wang PZ，Zhang Y，et al.Toll- like receptor 4 expression，leading to enhanced production of beta interferon，interleukin-6 and tumor necrosis factor- alpha.Virology，2008，380：52- 59

20.熊莉娟，罗端德，李淑莉，等.肾综合征出血热急性期外周血细胞因子的检测及其临床意义.临床内科杂志，2002，19（5）：345- 346

21. Klingstöm J，Plyusnin A，Vaheri A，et al.Wild- type Puumala hantavirus infection induces cytokines，C- reactive protein，creatinine，and nitric oxide in cynomolgus macaques.J virol，2002，76（1）：444-449

22. Ruvolo V，Navarro L，Sample CE，et al.The Epstein- Barr virus SM protein induces STAT1 and interferon- stimulated gene expression.J Virol，2003，77（6）：3690- 3701

23. Oelschlegel R，Krüger DH，Rang A.MxA- independent inhibition of Hantaan virus replication induced by typeⅠand typeⅡinterferon in vitro.Virus Res，2007，127（1）：100- 105

24. Niikura M，Maeda A，Ikegami T，et al.Modification of endothelial cell functions by Hantaan virus infection：prolonged hyper- permeability induced by TNF- alpha of hantaan virus- infected endothelial cell monolayers.Arch Virol，2004，149（7）：1279- 1292

25.王平忠，李宜川，陈延平，等.肾综合征出血热患者TNF-α、IL-6、IL-4、IFN-γ水平变化及意义.西南国防医药，2007，17（4）：396- 398

26. Wimer BM.Implications of the analogy between recombinant cytokine toxicities and manifestations of hantavirus infections.Cancer Biother Radiopharm，1998，13（3）：193- 207

27.王平忠，王九平，王雅格，等.肾综合征出血热患者IL-8、IP- 10和RANTES的水平变化及意义.中国现代医学杂志，2008，18（9）：1248- 1250

28. Liu MT，Chen BP，Oertel P，et al.The T cell chemoattractant IFN- inducible protein 10 is essential in host defense against viral- induced neurologic disease.J Immunol，2000，165：2327- 2330

29. Liu MT，Zhu Y，Xu ZW，et al.Dynamic changes of apoptosis- inducing ligands and Th1/Th2 like subpopulations in Hantaan virus- induced hemorrhagic fever with renal syndrome.Clinical Immunology，2006，119（3）：245- 251

30. Sundstrom JB，Mcmullan LK，Spiropoulou CF，et al.Hantavirus infection induces the expression of RANTES and IP- 10 without causing increased permeability in human lung microvascular endothelial cells.J Virol，2001，75 （13）：6070-6085

31. Nakamura T，Yanagihara R，Gibbs CJ Jr，et al.Immune spleen cell- mediated protection against fatal Hantaan virus infection in infant mice.J Infect Dis，1985，151：691-697

32. Wang M，Wang J，Zhu Y，et al.Cellular immune response to hantaan virus nucleocapsid protein in the acute phase of hemorrhagic Fever with renal syndrome：correlation with disease severity. J Infect Dis，2009，199：188- 195

33. Van Epps HL，Schmaljohn CS，Ennis FA.Human memory cytotoxic T- lymphocyte（CTL）responses to Hantaan virus infection：identification of virus- specific and cross- reactive CD8（+）CTL epitopes on nucleocapsid protein. J Virol，1999，73：5301- 5308

34. Lee KY，Chun E，Kim NY，et al.Characterization of HLA- A2.1- restricted epitopes，conserved in both Hantaan and Sin Nombre viruses，in Hantaan virus- infected patients.J Gen Virol，2002，83：1131- 1136

35. Van Epps HL，Terajima M，Mustonen J，et al.Long- lived memory T lymphocyte responses after hantavirus infection.J Exp Med，2002，196：579- 588

36. Nakamura K，Kitani A and Strober W.Cell contact- dependent immunosuppression by CD4（+）CD25（+）regulatory T cells is mediated by cell surface- bound transforming growth factor beta. J Exp Med，2001，194（5）：629-644

37. Belkaid Y.Regulatory T cells and infection：a dangerous necessity.Nat Rev Immunol，2007，7（11）：875-888

38. Bueno LL.Plasmodium vivax：induction of CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells during infection are directly associated with level of circulating parasites.PLoS One，2010，5（3）：e9623

39. Easterbrook JD，Zink MC，Klein SL.Regulatory T cells enhance persistence of the zoonotic pathogen Seoul virus in its reservoir host.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（39）：15502- 15507

40. Schountz T.Regulatory T cell- like responses in deer mice persistently infected with Sin Nombre virus.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（39）：15496- 15501

41. Meyer BJ，Schmaljohn CS.Persistent hantavirus infections：characteristics and mechanisms.Trends Microbiol，2000，8（2）：61-67

42. Mills KH.Regulatory T cells：friend or foe in immunity to infection？Nat Rev Immunol，2004，4（11）：841- 855

43. Belkaid Y，Rouse BT.Natural regulatory T cells in infectious disease.Nat Immunol，2005，6（4）：353- 360

44. Easterbrook JD，Klein SL.Corticosteroids modulate Seoul virus infection，regulatory T- cell responses and matrix metalloprotease 9 expression in male，but not female，Norway rats.J Gen Virol，2008，89（Pt11）：2723- 2730

45. Zhu LY，Chi LJ，Wang X，et al.Reduced circulating CD4+CD25+ cell populations in haemorrhagic fever with renal syndrome.Clin Exp Immunol，2009，156（1）：88- 96

46. Kallio- Kokko H，Vapalahti O，Lundkvist A，et al. Evaluation of Puumala virus IgG and IgM enzyme immunoassays based on recombinant baculovirus- expressed nucleocapsid protein for early nephropathia epidemica diagnosis.Clin Diagn Virol，1998，10（1）：83- 90

47. Bostik P，Winter J，Ksiazek TG，et al.Sin nombre virus（SNV）Ig isotype antibody response during acute and convalescent phases of hantavirus pulmonary syndrome.Emerg Infect Dis，2000，6（2）：184- 187

48. Jenison S，Yamada T，Mortis C，et al.Characterization of human antibody responses to four corners hantavirus infections among patients with hantavirus pulmonary syndrome.J Virol，1994，68（5）：3000- 3006

49. Feuer R，Boone D，Nrtski D，et al.Temporal and spatial analysis of Sin Nombre virus quasispecies in natureally infected rodent.J virol，1999，73：9544- 9554

50. Plyusnin A，Cheng Y，Lehvaslaiho H，et al.Quasispecies in wild- type tula hantavirus populations.J virol，1996，70：9060- 9063

51. Meyer BJ，Schmaljohn C.Accumulation of terminally deleted RNAs may play a role in Seoul virus persistence.J virol，2000，74：1321- 1331

52. Araki K，Yoshimatsu K，Lee BH，et al.Hantavirus- specific CD8+T cell responses in newborn mice persistently infected with hantaan virus.J Virol，2003，77（15）：8408-8417

53. Bernshtein AD，Apekina NS，Mikhailova TV，et al. Dynamics of Puumala hantavirus infection in naturally infected bank voles（Clethrinomys glareolus）.Arch Virol，1999，144（12）：2415- 2428

54. de Carvalho Nicacio C，Bjorling E，Lundkvist A.Immunoglobulin A responses to Puumala hantavirus.J Gen Virol，2000，81（Pt 6）：1453- 1461

55. Mazanec MB，Kaetzel CS，Lamm ME，et al.Intracellular neutralization of virus by immunoglobulin A antibodies. Proc Natl Acad Sci USA，1992，89（15）：6901-6905

56. Alexeyev OA，Ahlm C，Billheden J，et al.Elevated levels of total and Puumala virus- specific immunoglobulin E in the Scandinavian type of hemorrhagic fever with renal syndrome.Clin Diagn Lab Immunol，1994，1（3）：269- 272

57. Bharadwaj M，Nofchissey R，Goade D，et al.Humoral immune responses in the hantavirus cardiopulmonary syndrome.J Infect Dis，2000，182（1）：43-48

58. Ulrich R，Lundkvist A，Meisel H，et al.Chimaeric HBV core particles carrying a defined segment of Puumala hantavirus nucleocapsid protein evoke protective immunity in an animal model. Vaccine，1998，16（2- 3）：272- 280

59. Chu YK，Jennings GB，Schmaljohn CS.A vaccinia virus- vectored Hantaan virus vaccine protects hamsters from challenge with Hantaan and Seoul viruses but not Puumala virus.J Virol，1995，69（10）：6417-6423

60. Chu YK，Jennings G，Schmaljohn A，et al.Cross- neutralization of hantaviruses with immune sera from experimentally infected animals and from hemorrhagic fever with renal syndrome and hantavirus pulmonary syndrome patients.J Infect Dis，1995，172（6）：1581- 1584

61. Ruo SL，Sanchez A，Elliott LH，et al.Monoclonal antibodies to three strains of hantaviruses：Hantaan，R22，and Puumala.Arch Virol，1991，119（1- 2）：1- 11

62. Lundkvist A，Meisel H，Koletzki D，et al.Mapping of B- cell epitopes in the nucleocapsid protein of Puumala hantavirus.Viral Immunol，2002，15（1）：177- 192

63. Elgh F，Lundkvist A，Alexeyev OA，et al.Serological diagnosis of hantavirus infections by an enzyme- linked immunosorbent assay based on detection of immunoglobulin G and M responses to recombinant nucleocapsid proteins of five viral serotypes.J Clin Microbiol，1997，35（5）：1122- 1130

64.赵克森.血管通透性增高的基本机制.中国病理生理杂志，2003，19：549- 553

65. Gavrilovskaya IN，Shepley M，Shaw R，et al.Beta3 Integrins mediate the cellular entry of hantaviruses that cause respiratory failure.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95：7074- 7079

66. Raymond T，Gorbunova E，Gavrilovskaya IN，et al.Pathogenic hantaviruses bind plexin- semaphorin- integrin domains present at the apex of inactive，bent alphavbeta3 integrin conformers.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102：1163- 1168

67. Gavrilovskaya IN，Peresleni T，Geimonen E，et al.Pathogenic hantaviruses selectively inhibit beta3 integrin directed endothelial cell migration.Arch Virol，2002，147：1913- 1931

68.赵克森.休克的细胞和分子基础.第3版.北京：科学出版社，2002：38-81

69. Feng D，Nagy JA，Pyne K，et al.Pathways of macromolecular extravasation across microvascular endothelium in response to VPF/VEGF and other vasoactive mediators.Microcirculation，1999，6：23-44

70. Feng Y，Venema VJ，Venema RC，et al.VEGF- induced permeability increase is mediated by caveolae.Invest Ophthalmol Vis Sci，1999，40：157- 167

71. Turksen K，Troy TC.Permeability barrier dysfunction in transgenic mice overexpressing claudin 6.Development，2002，129：1775- 1784

72. Furuse M，Sasaki H，Tsukita S.Manner of interaction of heterogeneous claudin species within and between tight junction strands.J Cell Biol，1999，147：891- 903

73. Krause G，Winkler L，Mueller SL，et al.Structure and function of claudins.Biochim Biophys Acta，2008，1778：631-645

74. Ruffer C，Strey A，Janning A，et al.Cell- cell junctions of dermal microvascular endothelial cells contain tight and adherens junction proteins in spatial proximity.Biochemistry，2004，43：5360- 5369

75. Vestweber D.VE- cadherin：the major endothelial adhesion molecule controlling cellular junctions and blood vessel formation.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2008，28：223- 232

76. Gonzalez E，Kou R，Michel T.Rac1 modulates sphingosine 1- phosphate- mediated activation of phosphoinositide 3- kinase/Akt signaling pathways in vascular endothelial cells.J Biol Chem，2006，281：3210- 3216

77. Harhaj NS，Barber AJ，Antonetti DA.Platelet- derived growth factor mediates tight junction redistribution and increases permeability in MDCK cells.J Cell Physiol，2002，193：349- 364

78. Marcus BC，Gewertz BL.Measurement of endothelial permeability.Ann Vasc Surg，1998，12：384- 390

79. Bogatcheva NV，Verin AD.The role of cytoskeleton in the regulation of vascular endothelial barrier function.Microvasc Res，2008，76：202- 207

80. Hirano S，Rees RS，Yancy SL，et al.Endothelial barrier dysfunction caused by LPS correlates with phosphorylation of HSP27 in vivo.Cell Biol Toxicol，2004，20：1- 14

81. Borbiev T，Birukova A，Liu F，et al.p38 MAP kinase- dependent regulation of endothelial cell permeability.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2004，287：L911- 918

82. Lee TY，Gotlieb AI.Microfilaments and microtubules maintain endothelial integrity.Microsc Res Tech，2003，60：115- 127

83. Sehrawat S，Cullere X，Patel S，et al.Role of Epac1，an exchange factor for Rap GTPases，in endothelial microtubule dynamics and barrier function.Mol Biol Cell，2008，19：1261- 1270

84. Mackow ER，Gavrilovskaya IN.Hantavirus regulation of endothelial cell functions.Thromb Haemost，2009，102：1030- 1041

85. Robinson CJ，Stringer SE.The splice variants of vascular endothelial growth factor（VEGF）and their receptors.J Cell Sci，2001，114：853-865

86. Srikiatkhachorn A，Ajariyakhajorn C，Endy TP，et al. Virus- induced decline in soluble vascular endothelial growth receptor 2 is associated with plasma leakage in dengue hemorrhagic Fever.J Virol，2007，81：1592- 1600

87. Keyt BA，Nguyen HV，Berleau LT，et al. Identification of vascular endothelial growth factor determinants for binding KDR and FLT- 1 receptors.Generation of receptor- selective VEGF variants by site- directed mutagenesis.J Biol Chem，1996，271：5638- 5646

88. Gille H，Kowalski J，Li B，et al.Analysis of biological effects and signaling properties of Flt- 1（VEGFR- 1）and KDR（VEGFR- 2）.A reassessment using novel receptor- specific vascular endothelial growth factor mutants.J Biol Chem，2001，276：3222- 3230

89. Stacker SA，Vitali A，Caesar C，et al.A mutant form of vascular endothelial growth factor（VEGF）that lacks VEGF receptor- 2 activation retains the ability to induce vascular permeability. J Biol Chem，1999，274：34884- 34892

90. Quinn TP，Peters KG，De Vries C，et al.Fetal liver kinase 1 is a receptor for vascular endothelial growth factor and is selectively expressed in vascular endothelium.Proc Natl Acad Sci USA，1993，90：7533- 7537

91. Waltenberger J，Claesson- Welsh L，Siegbahn A，et al.Different signal transduction properties of KDR and Flt1，two receptors for vascular endothelial growth factor.J Biol Chem，1994，269：26988- 26995

92.李彧.肾综合征出血热外周静脉血细胞因子的变化与病情的关系.中国病毒病杂志，2011，7（1）：248- 251

93. Fleming I，Fisslthaler B，Busse R.Calciun signaling in endothelial cells involeves activation of tyrosion kinases and leads to activation of mitogen- activated protein kinases.Cir Res，1995，76：522- 529

94. Natarajan V，Taher MM，Roehm B，et al.Activation of endothelial cell phospholipase D by hydrogen peroxide and fatty acid hydroperoxide.J Biol Chem，1993，268：930- 937

95. Vaerin AD，Patterson CE，Day MA，et al.Regulation of endothelial cell gap formation and barrier function by myosin- associated phosphatase activities.Am J Physion，1993，265：438-447

96. Garcia JGN，Davis HN，Patterson CE.Regulation of endothelial cell gap formation and barrier dysfunction：role of myosin light chain phosphorylation，J Cell Pysiol，1995，163：510- 522

97. Zink S，Rosen P，Lemoie H.Micro- and macrovascular endothelial cells in β- adrenergic regulation of transendothelial permeability.Am J Physion，1995，269：1209- 1218

98. Khimenko PL，Moore TM，Wilson PS.Role of calmodulin and myosin light- chain kinase in lugn ischemia- reperfusion injury.Am J Physion，1996，271：L121- 125

99. Baldwin AL，Thurston G. Changes in endothelial actin cytoskeleton in venules with time after histamine treatment.Am J Physion，1995，269：1528- 1537

100. Clark EA，Shattil SJ，Ginsberg MH，et al.Regulation of the protein tyrosine kinase pp72syk by platelet agonists and the integrin alphaⅡb beta 3.J Biol Chem，1994，269：28859- 28864

101. Jin BQ.Signal transduction mediated by immune receptor//Jin BQ.Cellular and molecular immunology.2nd ed. Beijing：Kexue Chubanshe（Science Publishing House），2001：582-607

102. Cambier JC.Antigen and Fc receptor signaling.The awesome power of the immunoreceptor tyrosine- based activation motif（ITAM）.J Immunol，1995，155：3281- 3285

103. Inatome R，Yanagi S，Takano T，et al.A critical role for Syk in endothelial cell proliferation and migration.Biochem Biophys Res Commun，2001，286：195- 199

104. Yanagi S，Inatome R，Ding J，et al.Syk expression in endothelial cells and their morphologic defects in embryonic Syk- deficient mice.Blood，2001，98：2869- 2871

105. Klingström J，Hardestam J，Lundkvist A.Dobrava，but not Saaremaa，hantavirus is lethal and induces nitric oxide production in suckling mice.Microbes Infect，2006，8（3）：728- 737

106. Plekhova NG，Somova LM，Slonova RA，et al.Metabolic activity of macrophages infected with hantavirus，an agent of hemorrhagic fever with renal syndrome.Biochemistry（Mosc），2005，70（9）：990- 997

107. Markotic A，Hensley L，Geisbert T，et al.Hantaviruses induce cytopathic effects and apoptosis in continuous human embryonic kidney cells.J Gen Virol，2003，84（8）：2197- 2202

108. Li XD，Kukkonen S，Vapalahti O，et al.Tula hantavirus infection of Vero E6 cells induces apoptosis involving caspase 8 activation.J Gen Virol，2004，85（11）：3261- 3268

109. Li XD，Lankinen H，Putkuri N，et al.Tula hantavirus triggers pro- apoptotic signals of ER stress in Vero E6 cells.Virology，2005，333（1）：180- 189

110. Ontiveros SJ，Li Q，Jonsson CB.Modulation of apoptosis and immune signaling pathways by the Hantaan virus nucleocapsid protein.Virology，2010，401（2）：165- 178

111. Klingstrom J，Hardestam J，Stoltz M，et al.Loss of cell membrane integrity in puumala hantavirus- infected patients correlates with levels of epithelial cell apoptosis and perforin.J Virol，2006，80（16）：8279-8282

112. Liu JM，Zhu Y，Xu ZW，et al.Dynamic changes of apoptosis- inducing ligands and Th1/Th2 like subpopulations in Hantaan virus- induced hemorrhagic fever with renal syndrome.Clin Immunol，2006，119（3）：245- 251

113. Mustonen J，Partanen J，Kanerva M，et al.Genetic susceptibility to severe course of nephropathia epidemica caused by Puumala hantavirus.Kidney Int，1996，49（1）：217- 221

114. Mustonen J，Huttunen NP，Partanen J，et al.Human leukocyte antigens B8- DRB1* 03 in pediatric patients with nephropathia epidemica caused by Puumala hantavirus.Pediatr Infect Dis J，2004，23（10）：959- 561

115. Plyusnin A，Hörling J，Kanerva M，et al.Puumala hantavirus genome in patients with nephropathia epidemica：correlation of PCR positivity with HLA haplotype and link to viral sequences in local rodents.J Clin Microbiol，1997，35（5）：1090- 1096

116. Mäkelä S，Mustonen J，Ala- Houhala I，et al.Human leukocyte antigen- B8- DR3 is a more important risk factor for severe Puumala hantavirus infection than the tumor necrosis factor- alpha（- 308）G/A polymorphism.J Infect Dis，2002，186（6）：843-846