17世纪下半叶，荷兰人安东·列文虎克（Antony van Leeuwenhoek）于1676年最先制作了能放大200～300倍的显微镜，观察了齿垢、污水、人和动物的粪便，发现了许多肉眼看不见的微小生物，第一个描述了细菌的主要形态：球形、杆形和螺旋形，开创了微生物学的形态学时期。19世纪初期，法国微生物学家、化学家，路易·巴斯德（Louis Pasteur）发现了发酵与腐败都是由于微生物的作用引起的，为了防止酒类的变质，创造了加温处理的巴斯德消毒法，最早证实了细菌的存在。19世纪后期，德国医师兼微生物学家罗伯特科赫（Robert Koch）发明了固体培养基（土豆、明胶），创造了细菌分离和纯培养技术，至此进入了微生物分离培养的黄金时代，在短期内人类陆续发现了许多传染病的病原体，并且提出了判断疾病病原体的依据——科赫法则，科赫被视为细菌学之父。

与对致病菌的研究一样，涂片染色及细菌纯培养技术对正常菌群的认识和发展，微生态制剂的研制和临床应用起到了决定性的作用。传统对正常菌群的多样性及群落结构的分析大多是将细菌进行分离培养计数，然后通过一般生物化学性状或特定表型来分析，如果选择的选择性培养基的特异性强，可以将肠道菌群定位到种的水平，并可以对其菌落计数。但由于厌氧菌是人体正常菌群的主要组成部分，目前所知肠道正常菌群中99.9%是厌氧菌，口腔和女性阴道中90%以上也是厌氧菌，因此在厌氧菌培养技术出现之前人们对正常菌群的认识存在着很大的局限性。

1950年美国微生物学家亨盖特（Hungate）在进行瘤胃厌氧微生物研究时，首次发展出一种独特的厌氧培养技术，即亨盖特厌氧滚管技术。他利用可密封的试管（hungate tube），把试管以氮气与二氧化碳充填，并把融化的洋菜培养基放入，趁着洋菜还没固化，不停的转动试管，使得培养基平铺于管壁，如此厌氧微生物便能在无氧的环境生长。这项发明拓展了另一个微生物研究领域，即厌氧性细菌。

厌氧性细菌的生长依赖于一个无氧的环境，通过在培养基中加入还原剂，或用物理、化学方法去除环境中的游离氧，以降低氧化还原电势，即可达到这一目的。目前培养厌氧微生物的技术包括：厌氧培养箱技术、厌氧罐培养技术、厌氧袋培养技术及亨盖特厌氧滚管技术。

厌氧手套箱（anaerobie glove box）亦称厌氧工作站，是迄今为止国际上公认的培养厌氧菌最佳仪器之一。它是一个密闭的大型金属箱，箱的前面有一个有机玻璃做的透明面板，板上装有两个手套，可通过手套在箱内进行操作，故命名为厌氧手套箱。厌氧手套箱由真空取样室、恒温厌氧操作室、气路、电路控制系统等部分组成，取样室用于操作室内外物品的传递，操作室用于厌氧分离和培养。其厌氧环境主要是依靠反复抽气和换气，使用氮气和混合气体（N ₂，H ₂，CO ₂）置换空气而实现的，厌氧操作室内还有钯粒除氧剂，可以进一步催化消除残余氧，保持箱内厌氧状态。该箱可调节温度，本身是孵箱或孵箱即附在其内，还可放入解剖显微镜便于观察厌氧菌菌落，这种厌氧箱适于作厌氧细菌的大量培养研究，大量培养基可放入作预还原和厌氧性无菌试验。金属硬壁型厌氧箱的抽气、充气、厌氧环境和温度等均系自动调节。

厌氧手套箱的特点是全部操作过程（接种和培养）均在完全无氧的情况下进行，避免了其他方法在接种时厌氧菌暴露于空气过久，致使部分厌氧菌的死亡。另外厌氧手套箱还具有厌氧环境好、密封性能好、温控精度高，稳定性好、工作安全可靠等优点。

厌氧罐的厌氧原理与厌氧手套箱类似。使用时将欲培养的平皿或试管放入厌氧罐内，放入钯粒催化剂和厌氧指示剂，进行3次抽气和换气，将整个厌氧罐放37℃孵育箱培养。

厌氧罐操作简便、占用空间小、成本低，但不能提供操作全过程的厌氧环境，并且因容量的限制而无法实现灵活的厌氧培养操作，故其应用有一定的限制。

厌氧袋（Bio-bag）即在塑料袋内造成厌氧环境来培养厌氧菌。塑料袋透明而不透气，内装气体发生管（碳酸氢钠，硼氢化钠以及5%柠檬酸溶液）、亚甲蓝指示剂管、钯催化剂管、干燥剂。其厌氧原理是化学除氧，硼氢化钠和水反应生成氢气，在钯粒的作用下氢气和氧气反应生成水，从而除去氧气，此外柠檬酸和碳酸氢钠反应生成枸橼酸钠、二氧化碳和水，提供厌氧环境。使用时放入已接种好的平板后，尽量挤出袋内空气，然后密封袋口。按说明书依次操作，达到厌氧状态以后，放入37℃孵育箱培养。

厌氧袋无需连接气瓶，加厌氧产气袋即可，具有操作方便，节约空间，成本较低的优点，但可处理样品量较小。

滚管技术是Hungate教授于1950年首创的，经历了几十年的不断改进，该技术日趋完善，已经发展成为研究厌氧微生物的一套完整技术，经过多年来的实践证明，它是研究专性厌氧菌的一种极为有效的技术。包括培养基预还原和在无氧环境中进行的菌株分离和培养操作技术。将盛有无氧无菌琼脂培养基的试管加热至100℃，使琼脂熔化，并保温在50℃左右的水浴中，备用。

滚管技术的主要原理是利用除氧铜柱来制备高纯氮，并用高纯氮驱除小环境中的空气，使培养基的配制、分装、灭菌和贮存，以及菌种的接种、培养、观察、分离、移种和保藏等过程始终处于高度无氧条件下，从而保证了严格厌氧菌的存活。用这种方法制备成的培养基称为预还原无氧灭菌培养基（PRAS培养基，pre-reduced anaerobically sterilized medium）。在进行严格厌氧菌的分离时，可用Hungate的“无氧操作”把菌液稀释，并接种到融化后的PRAS琼脂培养基中，然后将此试管用丁基橡胶塞严密塞住后平放，置冰浴中均匀滚动，使含菌培养基布满在试管的内表面上，凝固成一薄层。适温培养后，在琼脂层内或表面形成菌落。滚管技术的优点是：①试管口与空气接触面积小；②经滚动后，试管的内表面上有大面积的固体培养基可供长出单菌落。

滚管技术是现代研究厌氧菌最有效技术，但其操作繁杂。

涂片法是采取新鲜粪便厚涂片，革兰（G）染色后在显微镜下计数细菌总数，计算G ⁺杆菌：G ^­杆菌：G ⁺球菌：G ^­球菌的比例，并且观察各种细菌的形态学特征，来估计肠道菌群是否正常的方法。正常粪便中G ⁺杆菌（绝大多数为厌氧菌，主要为双歧杆菌、拟杆菌、优杆菌等）占绝对优势、其次是G ^­杆菌或球菌、有少量酵母样真菌。涂片法的参考值为：G ⁺杆菌＞90%为正常型，G ⁺杆菌10%～90%为中间型，G ⁺杆菌＜10%为异常型。在重度菌群失调时，涂片法可以见到大量的酵母菌、葡萄球菌、梭菌等。

粪便标本涂片法具有直接、简便、快速的优点，是目前临床广泛应用的方法，但该方法比较粗糙，结果判断需要一定的经验，常用于筛查。认真规范的细菌涂片报告会给临床带来有价值的信息。细菌涂片是观察菌群平衡的窗口。

粪便细菌定量培养法又称为肠道菌群分析，具体过程为：收集新鲜粪便标本，定量稀释后接种于各种细菌的选择性培养基，进行厌氧和需氧细菌培养24～72小时，然后通过菌落形态和涂片革兰染色鉴定（必要时进行生化鉴定），最终计算出每克粪便中含有多少个某种细菌的菌落形成单位（colony forming units，cfu）。通过比较各种细菌的cfu，可以精确的得出粪便中各种细菌的数量和比例。在所检测的细菌中，可以选择厌氧菌中的双歧杆菌、拟杆菌、优杆菌、消化性球菌、乳杆菌及梭菌和需氧菌中的肠杆菌、肠球菌、葡萄球菌和酵母菌等。正常参考值为：双歧杆菌：10 ⁷～10 ¹⁰cfu/g，拟杆菌：10 ⁸～10 ¹¹cfu/g，优杆菌：10 ⁷～10 ¹⁰cfu/g，消化性球菌：10 ⁷～10 ⁹cfu/g，乳杆菌：10 ⁵～10 ⁸cfu/g，梭菌；10 ⁴～10 ⁶cfu/g，肠杆菌：10 ⁵～10 ⁸cfu/g，肠球菌：10 ⁴～10 ⁷cfu/g，葡萄球菌：10 ³～10 ⁷cfu/g，酵母菌：10 ²～10 ⁴cfu/g。在临床上，为了简便，有时仅计算双歧杆菌/肠杆菌（B/E）值，来评估肠道菌群的状况，B/E＞1表示正常，B/E＜1表示菌群失调，B/E值越低，提示菌群失调越严重。

肠道菌群分析是经典的肠道菌群检测方法，但操作复杂、成本较高，所需时间较长，在临床上没有广泛应用。目前多用于研究和作为评价其他检测方法时的标准。另外肠道菌群分析法不能分离培养标本中不可培养的细菌，而目前认为粪便标本中可培养细菌仅占到细菌总数的30%～40%。

鉴于涂片法观察结果不准确，定量培养法操作复杂、成本较高，需要时间长的问题，应用分子生物学技术检测标本中菌群变化是具有广阔前景的方法。目前应用于检测正常菌群的分子生物学技术有细菌16S rDNA基因序列分析、变性梯度凝胶电泳、温度梯度凝胶电泳，生物芯片技术、荧光原位杂交等，但是这些方法存在对技术要求高，费用高的缺点，在一定程度上限制了在临床上应用，而聚合酶链式反应技术（PCR）及定量PCR技术具有敏感、准确、安全、快速的特点，已经广泛用于临床病原学诊断。但特别值得注意的是在建立分子生物学技术检测肠道菌群时，除要求具有高敏感性和特异性以外，还需要满足多重检测和定量检测的特点，这样才能够反映肠道菌群中各种细菌的种类及数量上的改变，这一点与一般的分子诊断技术不同。目前从对技术的要求和临床适用性出发，只有荧光定量PCR可能成为临床常规检测技术。

实时荧光定量PCR（rea1-time fluorescent quantitative-PCR，FQ-PCR）是美国于1996年推出的一种新的核酸定量技术。它可以在PCR反应体系中加入荧光基团，最常用的是SYBR Green荧光染料和Taqman荧光探针两种。利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增产物量的变化，在通过最后得到的ct值和建立的标准曲线，对起始模板进行定量分析。FQPCR具有良好的灵敏性、特异性、精确性和重复性，且降低了标本和产物的污染，无复杂的产物后续处理过程，高效、快速等优点。关于扩增靶基因的设计，目前可以采用细菌16S rRNA或某种细菌的特异性核酸片段，因细菌16S rDNA具有在细胞中相对稳定，分子大小适中，具有保守区和可变区交错排列的独特结构，是目前理想的靶分子。在实时荧光定量PCR实验过程中，反应条件的选择和优化对于反应的成功与否非常关键，对于在反应过程中所需要的各种条件如引物、Mg ²⁺的浓度、Taq酶、SYBR Green及模板等物质的量和浓度都需要不断摸索，找出最佳的条件，尤其是引物二聚体和产物的解链温度（TM）值需要反复的实验，才能在以后的PCR反应过程中消除引物二聚体所产生的荧光信号达到对产物的准确定量。