基因作为人体的“建筑蓝图”，承载着人体的全部遗传信息，异常的基因可能存在功能缺陷，严重时会导致疾病。基因的化学本质是DNA，但其行使功能需转录为RNA和／或翻译为蛋白质。对这些物质的序列结构、化学修饰、分子数量等定性、定量检测都属于广义的基因检测（genetic testing）范畴。作为生命科学领域的基础技术，基因检测技术广泛应用于医疗卫生、司法鉴定、农业育种、食品安全等诸多领域。本章节将主要围绕基因检测方法及其在医疗领域（肿瘤方向）的应用展开。

样本类型、变异类型、检测通量以及灵敏度要求存在差异，适用的基因检测方法也截然不同，目前主流的实验方法与对应方法可检测的变异类型总结见表2-1。整体而言，基因检测方法可分为对已知变异位点／区域的检测，以及对未知变异位点／区域的筛查两大类。前者包括经典的荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技术、对蛋白进行原位检测的免疫组化（immunohistochemistry，IHC）技术、实时荧光定量反转录PCR（quantitative real time reverse transcription PCR，简称为real time RT-PCR 或 RT-qPCR）、突变扩增阻滞系统（amplification-refractory mutation system，ARMS）技术、多重连接探针扩增（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）技术、单碱基延伸（SNaPshot）技术、固相芯片杂交（microarray hybridization）技术以及近年来兴起的数字PCR（digital PCR）技术等；后者包括传统的低通量Sanger测序（Sanger sequencing），诞生于21世纪初、方兴未艾的高通量的二代测序（next generation sequencing，NGS），以及近年来高速发展的超长读长的三代测序（third generation sequencing）技术与单细胞测序（single cell sequencing，SCS）技术等。

以下简要列举在临床和科研领域广泛使用的6种针对已知位点变异／多态的检测技术，并简要介绍技术原理。而针对未知变异位点／区域的筛查技术，尤其是测序技术作为基因检测的后起之秀，在近十年内得到了广泛重视与高速发展，该部分内容会在本章第二节详细介绍。

FISH技术是一种使用荧光标记的核酸探针直接与处理后的组织切片样本或细胞涂片杂交，并通过显微镜观察杂交信号位置与强度的技术，可实现对目标DNA定性、定量与定位检测（图2-1）。定性、定量的特点可直接应用于基因拷贝数变异（copy number variation，CNV）的检测，如乳腺癌、卵巢癌中 HER2基因扩增；而“定位”的特点使得FISH能够进行基因融合突变（gene fusion mutation）检测：两组探针分别设计在不同基因上，且标记有不同的荧光颜色，探针与样本杂交后镜检，如该基因未发生融合突变，则两色荧光分离；反之，若两色荧光融合在一起，则提示目标基因发生融合。FISH作为经典的检测技术，灵敏度较差，实验操作也有一定难度。但因其无需DNA抽提步骤，可直接使用切片进行实验，能够与临床机构最常见的石蜡切片样本无缝衔接，目前仍是临床基因缺失或扩增、基因融合检测的主要方法。

ARMS技术利用了Taq DNA聚合酶缺少3′→5′外切酶活性，且当引物3′端与模板错配会影响延伸效率的特点，使用两对引物（2条上游引物，3′端分别与正常基因型或突变基因型匹配，2条下游引物与通用区域匹配），对已知单核苷酸变异（single nucleotide variation，SNV）、插入缺失（insertion／deletion，indel）变异进行检测 ^［1］。在检测过程中，分别使用上述两对引物对模板DNA进行PCR扩增，能够扩增出目标条带则表明样本携带有引物所对应的基因型（图2-2）。PCR高灵敏度的特点也赋予了ARMS超高的检测灵敏度，检出限通常可下探至1%，能够胜任胚系突变、高度异质性的体系突变甚至液体活检样本中超低频突变的检测。ARMS技术能够兼容传统的凝胶电泳、荧光毛细管电泳、RT-qPCR等平台，操作简便且结果可靠，是目前临床应用中不可或缺的检测方法。

SNaPshot又称为小测序技术，该技术由美国应用生物公司（ABI）开发，其主要的工作原理是：在一个含有测序酶、四种荧光标记的ddNTP、紧邻多态位点5′端的不同长度的延伸引物和PCR模板的反应体系中，引物延伸一个碱基即终止，经ABI测序仪毛细管电泳后，根据峰的颜色可知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型，根据峰图上峰移动的位置确定该延伸产物对应的SNP位点（图2-3）。多重SNaPshot技术具备高准确性，较高通量（1个反应可同时检测>30个位点）以及较高灵敏度（对5%以上含量的突变能准确检测）的特点，广泛应用于已知SNP或突变的检测，尤其适用于建立包含多个位点的小检测体系，对胚系突变进行高效的多重检测。

MLPA是MRC-Holland公司在2002年开发的一种分子技术，可快速有效地对待检DNA序列进行定性和半定量分析，主要用于CNV的检测 ^［2］。MLPA依赖于探针和靶序列DNA的杂交，以及后续的连接与PCR步骤。成对的MLPA上下游探针设计成相互紧邻的结构，探针与基因组模板退火后形成切口（nick）结构，该结构在后续的连接反应中由连接酶补齐，上下游探针连接为一条完整的核酸单链，这一过程特异且高效。最终，经与上下游探针5′端或3′端通用序列相匹配的、标记有荧光的通用引物PCR扩增后，该核酸单链被富集并经毛细管电泳分离，收集荧光信号（图2-4）。通过待测区域与预设的内参区域（拷贝数无变异区域）荧光信号强度的比值计算待测区域的拷贝数。MLPA单体系可容纳数十个区域同时检测，而基于MLPA原理的升级版CNVplex高通量连接探针扩增技术可将单反应检测区域提升到300个以上。CNVplex技术可实现CNV高效、精确检测，检出灵敏度可低至5%，广泛应用于肿瘤组织及液体活检等多种类型样本的拷贝数变异检测 ^［3-5］。

RT-qPCR可用于检测mRNA分子，能够高效且精准地检测目标基因的表达量变化，更重要的应用在于特异且灵敏地对已知位点的融合基因进行定性、定量检测（图2-5）。由于能够检测到融合基因的表达量，该方法可以排除虽发生了基因融合，但未能成功表达而不具有功能的融合突变，因而更符合临床检测的实际目的。检测时，上下游定量引物分别设计在发生融合的两个基因上，通常为发生融合后紧邻的两个外显子上的序列。样本经RNA抽提、反转录为cDNA和实时荧光定量PCR实验，最终得到Ct值计算待测融合基因相对于内参基因的表达量，据此判断是否发生有功能的基因融合。

数字PCR（digital PCR）概念由Vogelstein于1999年提出 ^［6］，类似一个集成的定量PCR反应。反应体系通过微孔芯片或油水混合物被分割为成千上万个微反应体系，每个微反应体系中进行只有一个模板DNA分子的检测实验，最终通过识别阳性微反应数来实现目标基因片段的超高灵敏度绝对定量（图2-6）。该技术对已知点突变、融合基因、拷贝数变异的检测具备极高的灵敏度，在原始DNA分子数量足够的情况下，其灵敏度可达0．01%。数字PCR近年来迅速崛起，但受限于发展时间较短，更多的应用仍停留在科研领域，目前在临床上仅获批应用于白血病的 BCR- ABL基因融合检测。但凭借其特有的超高灵敏度优势，以及循环肿瘤DNA突变检测（液体活检）的兴起，相信在可预见的未来，必将拥有极大的应用潜力。

基因组的不稳定性和突变（genome instability and mutation）是癌症最重要的特征之一 ^［7］。基因检测技术归根到底都是直接或间接的对基因组不稳定性或突变的检测，因此被广泛应用于肿瘤发病机制探寻、肿瘤易感性筛查、肿瘤用药指导以及肿瘤早期筛查等方向。

首先，肿瘤易感基因的成功定位与克隆离不开群体遗传学的相关研究。如经典的全基因组关联分析（genome-wide association study，GWAS）技术，依赖于DNA芯片或全基因组测序检测SNP位点与相关肿瘤的发病进行关联分析，并基于连锁不平衡原理对后续易感基因进行定位 ^［8］；对遗传性肿瘤，特别是多基因导致的遗传性肿瘤，基于家系的连锁分析必不可少，同样依赖于对家系成员的分子标记，如SNP、微卫星的检测，借助这些分子标记与表型间的连锁值对潜在易感基因进行定位 ^［9］。其次，在肿瘤体细胞突变机制研究的探索发现阶段，基于高通量测序的组学研究已必不可少，借助NGS技术，一次实验通常可以获得上万个基因的序列信息，例如全外显子组测序可以对几乎所有基因的外显子区域的SNV、CNV和indel变异进行检测 ^［10］。肿瘤细胞的表达谱、可变剪切、复杂的基因融合现象，都可通过全转录组测序进行全面探寻 ^［11］。全基因组甲基化测序 ^［12］、450K／850K芯片 ^［13］、microRNA-seq ^［14］、ChIP-seq ^［15］、ATAC-seq ^［16］等检测方法也已能够实现全基因组甲基化水平、microRNA、组蛋白修饰、染色质开放结构等表观遗传变异的检测。多组学的联合分析正缓慢但扎实地推进肿瘤发病机制的探寻。再者，在机制研究的大样本验证阶段或者临床实验中，检测目标通常是确定的位点或区域，可借助上文中提及的各种低成本的检测技术对相应位点进行检测，为肿瘤流行病学、肿瘤遗传学的研究，提供充分的数据支持。

肿瘤作为一种基因疾病，根本上是体细胞突变积累发病，但部分重要原癌或抑癌基因的胚系突变无疑会增加后继突变的形成。胚系突变携带者具有患癌风险增加、发病年龄提前、恶性程度高、高度遗传性及家族聚集性等特点。目前已有多个单基因被公认为与癌症的易感性相关，如 BRCA1/BRCA2之于乳腺癌和卵巢癌 ^［17］。

肿瘤靶向治疗与免疫治疗作为新兴且疗效显著的治疗方案，这些治疗方案的开展深度依赖相应的伴随性诊断检测结果。如注射用曲妥珠单抗治疗 HER2扩增阳性的乳腺癌 ^［18］，PARP抑制剂治疗 BRAC1/BRAC2变异的乳腺癌、卵巢癌等 ^［19］。近年来，仅针对特定变异位点，而非癌种选择使用靶向药物的“异病同治”方案也引起了广泛的讨论 ^［20］。癌症免疫疗法是一类通过激活免疫系统来治疗癌症的方法，同样依赖于基因检测技术。例如备受关注的PD-1抑制剂的临床效果，与患者体内PD-L1阳性表达情况以及肿瘤突变负荷（tumor mutation burden，TMB）高度相关 ^［21］，其用药在治疗进程中需要基因检测助力。一方面，虽尚存争议，但药物基因组学已有多项证据表明，个体因基因型的差异，对常规化疗药物如紫杉醇、铂类药物、6-巯基嘌呤等的敏感性及毒性不尽相同，必要的基因检测可实现对化疗药物的用药指导 ^［22］。另一方面，因高度异质性及药物对细胞的进化选择，肿瘤细胞在长期治疗后通常会产生抗药性，为后期治疗效果带来不利。随着基因检测技术的更新迭代，对释放到循环系统中的微量级别的循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）进行追踪逐渐成为可能，通过对新生耐药克隆释放到血液中的变异信息的检测，可以指导我们及时调整癌症的后续治疗方案 ^［23］。

由于癌症的高发生率和死亡率，以及诊断的不及时，肿瘤早筛愈发重要而且备受重视。现阶段，肿瘤早筛主要针对脱落肿瘤细胞或肿瘤细胞释放到血液的ctDNA进行检测，前者精确度相对较高，但对癌种限制苛刻，如脱落到粪便的结直肠癌细胞 ^［24］、脱落到肺泡灌洗液的肺癌细胞 ^［25］等；后者虽可对泛癌种进行筛查，但结果差强人意，究其原因是早期肿瘤释放到血液中的ctDNA含量极低，不可避免地造成假阴性结果，发展到中后期的肿瘤虽可释放出足够检测的ctDNA，但至此也失去了肿瘤早筛的意义。随着检测灵敏度的逐步提升，以及测序成本的大幅下降，可以大胆预测在不久的未来，会发明出高灵敏度的、在单一体系内同时检测ctDNA多种类型突变（如SNV、CNV、甲基化水平和融合基因）的检测方法，真正实现泛癌种的早期筛查 ^［26］。

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