2.2 免疫电镜技术

免疫电镜技术（Immunoelectron Microscopy）又称电子显微镜免疫细胞化学技术，是在细胞及组织中对蛋白质进行定位检测的最好方法之一。该技术是免疫细胞化学与电镜技术相结合的产物，即在保持抗体的抗原识别特性前提下，把抗体用高电子密度的标记物（如铁蛋白、金等）或用经细胞化学方法处理电子密度能增高的标记物（如辣根过氧化物酶等酶类）标记后，在电子显微镜下对细胞内抗原做亚细胞水平的定性或定量研究。包括免疫铁蛋白技术、免疫胶体金技术、免疫酶细胞化学技术等常用技术。

免疫电镜技术的成功应用首先基于待检样品中待测蛋白抗原性的保存、抗体与抗原之间识别的特异性及抗体穿透细胞的能力，在此基础上，免疫电镜技术中最关键的因素包括抗体标记物和样品固定液的选择。理想的免疫电镜标本固定既要保存组织中的抗原，又要具有良好的细胞超微结构。四氧化锇（OsO4）、甲醛和戊二醛是免疫电镜技术中的常规固定液，其中OsO4因其高活性而常常影响抗原性的保存。因此，免疫电镜常用一些特殊的固定液，如过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液（PLP）、4%多聚甲醛固定液、多聚甲醛加低浓度的戊二醛固定液（PG）及苦味酸-多聚甲醛固定液等。

根据待测抗原物质的特性不同，有3种染色步骤可供选择：非包埋法免疫染色（Cryo-Ultramicrotomy）、包埋前免疫染色（Pre-Embedding）和包埋后免疫染色（Post-Embedding）。非包埋法免疫染色指组织经蔗糖浸渍，液氮速冻，不经过包埋直接在冷冻超薄切片机上切片，然后进行免疫染色。包埋前染色是指组织在树脂包埋前进行的免疫染色，该法可很好地保存待测蛋白的抗原性，提高检出率，但易损伤组织结构。包埋后染色是指组织经固定、包埋、超薄切片后，直接在超薄切片上进行免疫染色。该法操作简单，重复性强，可以很好地保存细胞的超微结构，但待测蛋白的抗原性可能会减弱或消失。

下面以包埋后免疫染色方法为例介绍胶体金标记抗体免疫电镜分析法的详细操作步骤。

1．实验仪器、耗材及试剂

①固定液：以0.1mol/L二甲砷酸盐缓冲液溶解4%（m/V）多聚甲醛与1.5%（V/V）戊二醛混合的固定液，pH 7.3。

②1×PBS（pH 7.2～7.4）。

③封闭液：1% BSA溶解于1×PBS中。

④以一定浓度溶解于封闭液中的一抗。

⑤以一定浓度溶解于封闭液中的蛋白A/胶体金（16nm）复合物。

⑥醋酸双氧铀饱和溶液。

⑦梯度乙醇溶液：50%、70%、90%乙醇溶液。

⑧LR White树脂包埋剂。

⑨恒温温箱。

⑩震动切片机。

⑪电子显微镜。

2．实验步骤

①固定：将组织样本浸泡于固定液中，室温固定5～6h。

②清洗：1×PBS洗3次。

③脱水：将组织依次浸泡于50%、70%、90%浓度梯度乙醇溶液中，每个浓度浸泡15min。

④包埋：以LR-White和90%乙醇的混合溶液浸泡脱水后的组织，于摇床上轻柔摇动浸泡2min后，将组织浸泡于100% LR-White包埋剂中，于4 ℃包埋过夜。将组织转移到盛有100% LR-White包埋剂的模具中，55 ℃聚合24h。

⑤切片：用震动切片机切60～90nm超薄切片。

⑥封闭：用封闭液，室温湿盒中封闭30min。

⑦一抗染色：用50μL稀释后的一抗进行免疫染色（稀释浓度需根据预实验结果决定）。于4 ℃湿盒中染色过夜。

⑧清洗：1×PBS洗3次。

⑨胶体金染色：用50μL稀释于封闭中的以一定浓度溶解于封闭液中的进行胶体金染色。于37 ℃湿盒中染色30min。

⑩清洗：1×PBS洗3次。

⑪电子显微镜观察染色结果：在醋酸双氧铀饱和溶液中浸泡5～8min，流水冲洗，柠檬酸铅染2～3min。电镜下观察染色结果，图2-2所示为胶体金标记的外泌体特异蛋白。

知识窗

免疫电镜技术的临床医学应用实例

免疫电镜技术广泛应用于生物医学的各个研究领域当中。史璐等（见参考文献[4]）研究者对不同发育阶段小鼠胚胎下颌第一磨牙牙胚中窖蛋白（Caveolin）的表达情况进行了免疫染色及电镜观察，图2-3中黑色箭头所示为Caveolin-1蛋白。