2.2.1 高产溶栓酶菌种的筛选

2.2.1.1 菌种的分离

将配制并灭菌处理的营养肉汤琼脂培养基倒入平板中，每个平板约20mL，吸取0.1mL豆豉汁及酱醅汁于9mL无菌水中，十倍梯度稀释，分别吸取10^-2、10^-3、10^-4稀释度各0.1mL于冷却凝固后的用于菌种分离的培养基上，涂布均匀，在37℃培养24h，挑选产生透明圈、有拉丝的单菌落，移至营养肉汤斜面培养基中培养并保藏。

由于纳豆激酶属于丝氨酸蛋白酶，能分解酪氨酸，在酪蛋白平板上产生透明圈，因此在酪蛋白平板上，从6种不同的豆豉和酱醅样品中分离产生水解圈较大的，有拉丝的单菌落共42个。

2.2.1.2 高产溶栓酶菌种的初筛

将42个菌株的斜面保藏菌种1～2环，接种于液体筛选培养基中37℃，120r/min振荡培养24h，4000r/min、离心25～30min后离心得上清粗酶液。

采用纤维蛋白平板法测定粗酶液的纤溶酶活性。取凝血酶100单位溶于1mL磷酸缓冲溶液（pH值7.4）中，将牛血纤维蛋白原溶解于15mL磷酸缓冲溶液（pH值7.4），然后将两者混合摇匀迅速倒入灭菌平皿中。分别取标准尿激酶液（100U/mL的尿激酶标准品）10μL及分离出的菌株的发酵液提取粗酶液的适当稀释液10μL点于同一纤维蛋白平板上，37℃培养18h，取出，测量水解圈的直径，计算面积。

测定各菌株粗酶液的纤溶酶活性，其中有6株菌株的发酵液的酶活力大于1000U/mL，实验结果见表2-1。

表2-1 初筛实验结果

2.2.1.3 高产溶栓酶菌种菌种的复筛

将初筛出的各个菌株斜面保藏菌种1～2环，接种于液体筛选培养基中，每株菌的斜面菌种接种三瓶液体培养基，37℃，120r/min振荡培养24h，然后通过4000r/min、25～30min离心得上清粗酶液。将各株菌粗酶液接种于制备好的牛血纤维蛋白平板上测定纤溶酶活性。

将初筛出的6株溶栓酶活性较高的菌株的斜面菌种，接种于液体筛选培养基中，每株菌接种三瓶，通过发酵、离心后测定发酵粗酶液的纤溶酶活性，其中M64菌株的纤溶酶活性的平均值显著高于其他5株菌株，达到1960U/mL。