第二节 活性先导化合物的发现
海洋生物活性物质是指从海洋生物中分离的具有生物活性的天然物质，探索药用活性物质是当前最活跃的研究领域之一。海洋生物活性物质有与陆地天然产物或合成产物不同的特点，如微量、高活性及活性多样性等。因此，海洋生物样品的初筛需要多种筛选模型，在活性确定后的分离纯化研究中也要尽量贯彻活性跟踪的原则，如此才会有满意的结果。
一、有效部位的处理
通常采用海洋生物的提取部位进行活性筛选，而非通常的总提取物。这是因为，海洋生物中含有大量的无机盐（海水中就含有3.0%），这些无机盐会干扰某些分析结果，此外，由无机盐引起的皂化也是一个问题。
海洋生物样品的处理有其特殊性，如常用的动物性样品多需在低温下进行匀浆处理，或进行冷冻干燥粉碎等。但是，总体处理方法与陆地生物样品是相似的，其提取体系也包括水相提取体系和有机相提取体系两种，纯化过程也多用柱色谱体系，近些年来，超临界CO2萃取技术在海洋生物活性物质的提取分离中已得到应用，在分离纯化鱼油和多管藻中不饱和脂肪酸的研究开发方面已获得成功。
超临界CO2萃取法（supercritical CO2 fluid extraction，SFE-CO2）的优点是用无毒、不残留的CO2代替有机溶剂或水作为萃取介质并在接近室温的条件下萃取；超临界CO2溶剂的性质，在很广的范围内可以调控，只要简单地改变温度或压力就可使溶质在CO2中的溶解度发生很大的变化，这为高度选择性提取和分离提供了可能性；其最大的优点是将萃取、分离、纯化和除去溶剂等过程合而为一，从而简化工艺流程、提高效率，不像有机溶剂会污染环境，又不像水的提取物有变质腐烂等问题。
二、活性初筛
海洋生物种类繁多，数量巨大，它们产生的千万种代谢产物亦结构各异、功能不同。如何从中发现我们所需要的活性代谢产物是一个高度技术性、技巧性和工作量甚大的工程。可见，在海洋生物活性物质研究的过程中，活性筛选的作用至关重要。
活性筛选的发展经历了三个不同的阶段。第一阶段：仅是有目的地寻找某类已知的活性化合物及其类似物，通过测定不同生物中感兴趣的化合物的含量就可达到目的，活性测定方法仅作为参考证据。第二阶段：研究目的是寻找具有某种生物活性的物质，但这种物质可能为未知物，这需要采用某一筛选模型对大量样品进行广泛筛选，在确定样品具有活性后再开展深入研究。当前多数研究尚处于此阶段。但这种筛选模式仅采用某一特定的药理模型（如抗癌活性模型），会造成很多不具有该药理作用的活性成分被漏筛。为此，常采用高通量筛选方法（high throughput screening，HTS），即采用多种药理模型，在分子、受体水平上对大量样品进行快速、高效、低成本的活性筛选工作。近年来，人类基因组计划的成功实施，使生物医学领域进入了一个崭新的时代，高内涵筛选（high content screening，HCS）正逐步成为一种全新的新药研究手段（第三阶段）。通过研究基因编码的蛋白质在生理或病理状态下的功能变化、与其他生物大分子（如RNA、DNA等）的相互作用以及对信号转导途径的影响，有助于深入认识各种疾病发生发展的分子机制，发现新的药物作用靶点。
（一）常用的筛选模型
根据所选用的材料、药物作用对象以及操作特点的不同，又可将活性筛选模型分为三大类：整体动物水平模型、组织器官水平模型、细胞及分子水平模型。
（1）整体动物水平模型与传统筛选程序 用整体动物进行药物筛选，是长期以来备受重视的方法，单纯从新药筛选的角度看，此模型的最大优点是可以从整体水平直观地反映药物的治疗作用、不良反应以及毒性作用。由整体动物模型获得的筛选结果，对预测被筛选样品的临床价值和应用前景具有重要价值。
由于整体动物的特殊性，决定了筛选过程主要依赖于手工操作，且样品量有限，特别是目前在实验动物身上复制出的病理模型太少，因此，此模型具有显著的局限性、低效率和高成本等不足之处。
（2）组织器官水平模型和体外药物筛选方法 通过观察药物对特定组织或器官的作用，可以分析药物的作用原理和可能具有的药理作用。应用组织器官模型筛选药物，是药物筛选技术的一大进步。其缺点主要是规模小、效率低、反映药物作用有限、对样品的需求量仍然较大、不易实现一药多筛等，此外，人工操作技术要求高等也是影响这种方法在药物筛选中应用的主要原因之一。
（3）细胞、分子水平模型和高通量药物筛选 细胞生物学、分子药理学、分子生物学、生物化学、病理学等学科的发展，为观察药物作用提供了新的方法，大量分子细胞水平的药物筛选模型不断出现并应用到药物研究和药物筛选实践中。细胞、分子水平的药物筛选模型具有材料用量少、药物作用机制比较明确、可实现大规模筛选等特点，已成为目前药物筛选的主要方法。此模型的应用为自动化奠定了基础，由传统的手工筛选形式转变为由计算机控制的自动化大规模筛选的新技术体系，形成了高通量药物筛选。
（4）高内涵筛选 所谓高内涵筛选是指在保持细胞结构和功能完整性的前提下，同时检测被筛样品对细胞形态、生长、分化、迁移、凋亡、代谢途径及信号转导等各个环节的影响，在单一实验中获取大量相关信息，确定其生物活性和潜在毒性。从技术层面而言，高内涵筛选是一种应用高分辨率的荧光数码影像系统，在细胞水平上检测多个指标的多元化、功能性筛选技术，并获得被筛样品对细胞产生的多维立体和实时快速的生物效应信息。高内涵筛选技术的检测范围包括靶点激活、细胞凋亡、分裂指数、蛋白转位、细胞活力、细胞迁移、受体内化、细胞毒性、细胞周期和信号转导等。虽然高通量药物筛选的结果较为准确，易于评价，但其检测模型均建立在单个药物作用靶分子的基础上，无法全面反映被筛样品的生物活性特征，如化合物对细胞产生的多种特异效应包括毒性作用。通过同步应用报告基因、荧光标记、酶学反应和细胞可视化等高内涵筛选常规检测技术，研究人员可以在新药研究的早期阶段获得活性化合物对细胞产生的多重效应的详细数据，包括细胞毒性、代谢调节和对其他靶点的非特异性作用等，从而显著提高发现先导化合物的速率。
（二）常用的筛选方法
生物活性的筛选方法各式各样，筛选效率直接与实验的设计有关，靶标越明确，越有可能获得特定活性的产物，因此，如果对病理和药理方面有越深入越具体的了解，就越有利于筛选，以下筛选模型大多已被海洋生物活性物质研究者采用。
1．抗菌活性
抗菌活性筛选是目前应用非常广泛的活性筛选方法之一，特别是在药用微生物和抗生素的筛选上，本方法起着举足轻重的作用。抗菌活性筛选主要包括抗细菌、抗真菌和抗支原体药物的筛选。
（1）抗细菌药物筛选 一般根据WHO规定的标准方法，即Bauer-Kirby纸片法进行药效测定。而厌氧菌是一类对游离氧敏感的衍生物，生长需要一定的厌氧环境，目前对抗厌氧菌药物筛选尚无一种公认的标准方法。筛选中心采用微量液体稀释法筛选抗变形链球菌药物和琼脂稀释法筛选抗幽门螺杆菌药物。
（2）抗真菌药物筛选 真菌是高级进化的微生物，种类多，生长发育过程复杂，菌体可分化成菌丝型和酵母型，对药物的敏感性不同。在新药筛选时，除用纸片法或稀释法测定药效、测量抑菌丝外，还要仔细观察被测物质是否阻止分生孢子萌发，抑制菌丝生长扩散，或造成菌丝畸形等。筛选中心采用琼脂稀释法进行药物筛选和活性测定。
（3）抗支原体药物筛选 支原体是介于病毒和细菌之间没有细胞壁的微生物，广泛分布于自然界，能引起人类和动植物的感染以及各种组织细胞培养的污染。支原体能在特殊的培养条件下生长繁殖，引起pH变化，故采用颜色改变单位测定其生长状况。当被测物质发挥生长抑制效应或杀灭支原体时，含有指示剂的培养基不再变色，据此判断药效。
2．观察对动物的影响
（l）对动物幼体的定殖或变态的抑制 环节动物、鲍鱼以及咸水虾的幼体可用于检测样品对动物的毒性或其他影响。通常把多个幼体置于样品液中，然后观察对致死性或对变态过程、定殖效果、虫室形成等方面的影响。
（2）对无脊椎动物运动的影响 在加有样品的溶液中，如果一个饲养着的水螅或其他动物总是保持收缩状态，则认为是遇到了有毒性的代谢物。
（3）金鱼毒性试验 样品对小金鱼的影响，可表现为致死或失去平衡等。
（4）通过器官和生理系统检测 检测对心脏、血压、肌肉等的作用活性。
3．细胞水平筛选
利用多种来源清楚、病理分析明确且对药物敏感的人恶性肿瘤细胞株，在细胞培养板上观察被测物质在体外对肿瘤细胞的生长抑制或杀伤作用；采用四氮唑盐酶还原法或磺酰罗丹明B法测定化合物对肿瘤细胞的生物效应。
4．酶抑制剂筛选法
已知多种病症是因为特定酶的活性增强或减弱而引起的，以该酶为靶标筛选抑制剂或激动剂，将大大增加获得适用的活性代谢物的可能性。这是一种针对具体靶标分子的筛选方法，比起应用整个动物或整个细胞作为试验靶标有其优越之处。
应用酶抑制剂（激动剂）筛选法，可以获得具有抗肿瘤、抗血栓、抗糖尿病、抗病毒、抗炎以及降血脂、降血压等活性的代谢物；抗肿瘤活性筛选的靶酶有DNA拓扑异构酶、芳香酶、法尼基转移酶、蛋白激酶等；抗血栓形成活性筛选的靶酶有凝血酶、血小板活化因子酰基转移酶等；抗病毒活性筛选的靶酶有蛋白酶、与复制有关的酶等；抗糖尿病活性筛选的靶酶有醛糖还原酶等；抗炎活性筛选的靶酶有溶磷脂酶、磷脂酶A2、脂氨酶等；抗神经退化活性筛选的靶酶有乙酰胆碱酯酶（需要同时筛选对丁酰胆碱酯酶不抑制的活性）；降血脂活性筛选的靶酶有鲨烯合成酶、脂酰辅酶A、胆固醇酰基转移酶（A-CAT）、p-羟基-p-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）等；降血压活性筛选的靶酶有肾上腺素合成酶、内皮素转换酶等。
5．免疫调节活性代谢物的筛选法
免疫调节分为免疫活性增强和免疫活性抑制，在医学上分别有极其重要的作用，可通过皮肤注射反应来观察样品对抗原免疫反应的增强或抑制作用，也可在体外应用淋巴细胞进行免疫试验。
6．受体拮抗活性筛选
每一生化反应系统都有严密的机制进行调控，信号分子往往需要与受体分子结合而启动生理、生化过程。如样品能与受体亲和结合，则会与正常信号分子产生竞争，从而抑制该生化过程。用于抗肿瘤活性筛选的受体包括非甾类雌激素受体或雄激素受体等；用于抗血栓活性筛选的受体包括纤维蛋白原受体；用于降血压活性筛选的受体包括内皮素受体、血管紧张素受体。
7．抗病毒的活性筛选
通过体外抗病毒实验和体内抗病毒药效得出样品的细胞毒性、细胞抗病毒作用（如以细胞致病效应及感染细胞保护率为指标）和体内抗病毒药效。
8．其他活性筛选
其他如神经系统、抗炎、心血管疾病药物、抗氧化等筛选均是采取离体实验（离体的细胞、组织和器官等病理模型）和在体实验（病理动物模型）进行多方法、多指标结合的筛选。根据筛选内容的不同在不同筛选方法上各有侧重。
三、活性化合物的分离纯化
按照上述提取法得到的海洋生物粗提物通常是一种混合物，需要进一步分离、纯化才能获得单一的化合物。具体做法随着海洋生物物种及其活性物质性质的不同而异。
（一）溶剂分离法
通常总提取物是一种浸膏（溶于水、乙醇或CO2），这些浸膏常常是胶状物，难以均匀地分散在低极性溶剂中而影响分离效果。此时可拌入适量硅藻土或纤维粉等惰性填料。然后低温或自然干燥，经粉碎后，选用3～4种不同极性的溶剂，由低极性到高极性分别进行分离。此种溶剂分离法（solvent isolation）可使其活性物质在不同极性的溶剂中由于溶解度的差异而得到分离。
如果是水浓缩液，可以一次选择几种与水不相混溶的有机溶剂，分成若干部位，或者析出某杂质，从而达到分离纯化的目的。目前，海藻多糖和甲壳质多糖等的提取分离，多数是采用水溶解、浓缩、加入乙醇或丙酮析出的办法。此外，也可以利用某些成分能在酸或碱中溶解，又通过加碱或加酸改变溶液的pH，成为不溶物而析出，从而达到分离纯化的目的。
常用有机溶剂的极性大小顺序为：甲醇>乙醇>丙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>氯仿>苯>环己烷>石油醚。
（二）沉淀法
在海洋生物的水提取物中加入某些无机盐（铅盐、氯化钠、硫酸钠、硫酸铵、氯化钙等）或某些试剂（氢氧化钡、氢氧化铝、明矾、乙醇），可以使有机酸、氨基酸、蛋白质、酸性苷类和部分黄酮或生物碱产生沉淀，这种沉淀法（deposition）可得到有效成分或除去杂质。乙醇是使用最广泛的沉淀剂，乙醇沉淀法既可以定量回收多糖，又是一种简单的分级分离方法。如果使用铅盐要注意彻底脱除铅。脱铅的试剂有硫化氢、硫酸、磷酸、硫酸钠、磷酸钠等，硫化氢脱铅比较彻底，但要设法除去溶液中过量的硫化氢。如从海人草中获得海人草酸就是使用铅盐沉淀法。
（三）透析法
透析法（dialysis）是利用无机盐、单糖、二糖等小分子物质在溶液中可通过膜（透析、超滤、反渗透等），而大分子物质不能通过膜的性质，从而达到分离纯化的目的。膜分离过程具有在常温、无相变的条件下实现物质分离和可利用低品位原料以及不产生环境污染等特点，是一项高效、节能的新技术，常使用此方法分离纯化海洋生物中的多糖、多肽、苷类和蛋白质等。膜的分离效率与透析膜、超滤膜、反渗透膜的类型和质量有关。
透析膜有天然的蛋白质胶膜、动物膜、火棉胶膜和高分子合成材料的超滤膜和反渗透膜（纤维素膜、硅橡胶膜）。在透析过程中要经常更换试剂，使膜内外溶液的浓度差大，必要时可通过加热或搅拌来提高透过率。有时还可以采用点透析法，即在渗透膜等两边的溶剂上放置两个电极，接通电路，膜内带正电荷的无机阳离子、生物碱等向阴极移动，而带负电荷的无机阴离子、有机酸等向阳极移动，中性化合物及高分子化合物仍留在渗透膜内。透析法已广泛应用于制备多糖时的脱盐、浓缩工作，已成功地从海洋动物中提取分离出具有抗肿瘤作用的黏多糖和从海带中制取甘露醇等。
（四）重结晶法
多数海洋生物活性物质在常温下是固体物质，可以根据溶解度的不同，使用结晶法来达到分离纯化的目的。一般被结晶出来的晶体，大部分是比较纯的化合物，但并不一定是单一化合物，有时结晶体也有混合物，此时可考虑通过多次重结晶的办法得到比较纯的单一化合物。如果结晶后的化合物纯度还不够高，就必须改用其他办法。另外，有些化合物即使达到很纯的程度，还是不能被结晶，只是呈无定形粉末状固体。例如，海洋生物中的苷类、多糖类等物质。
通常来说，将并不是结晶状的物质处理成结晶状物质的过程叫结晶，而将比较不纯的结晶体用结晶法精制得到较纯的结晶体叫重结晶。海洋生物中的活性产物通常用重结晶法（recrystallization）进行纯化。要做好这样两个过程必须选择合适的条件：①一般来说，活性物质在被结晶的混合物中含量越高越容易结晶，所以海洋生物的总提取物需要进行必要的除杂过程才能进行结晶；②要注意选择合适的溶剂和适量的溶剂，合适的溶剂最好是在热时对所需要成分的溶解度大，在冷时溶解度小，溶剂的沸点亦不宜太高；③有些化合物不易结晶，可制备成盐类（有机酸盐）或乙酰衍生物（含羟基化合物等），则变得容易结晶。
方法是使用适量的溶剂，在加热的情况下将混合物溶解，放置至室温，即达到过饱和溶液状态，让其结晶。如果在室温下还不能析出结晶体，可放置在冰箱中。有时结晶体的形成常常需要2～3天，甚至更长时间才能结晶。制备结晶溶液可以选用单一溶剂，也可以选用混合溶剂。通常是先将混合物溶于易溶的溶剂中，再在室温下滴加适量的难溶溶剂，直到溶液呈浑浊状态，并将此溶液微微加热，使溶液完全澄清后放置，让其结晶。
（五）色谱法
1．薄层色谱法（thin layer chromatography，TLC）
薄层色谱法通常是将吸附剂均匀地分布在平面板如玻璃板上，用毛细管把分析的样品（少量溶剂溶解）点加到薄层上，使溶剂挥发，然后在装有合适溶剂的密封器中展开，当展开剂的前沿到达适当的位置后，取出薄层板并使展开剂完全挥发，显色检查薄层板上的斑点，判断某一化合物是否纯或者某些成分的分离效果如何。这是一种快速、微量、简便的色谱方法。如用柱色谱难以将某些混合物分离或样品较少（数十毫克）时，往往采用TCL能获得纯的化合物。
注意：①展开剂与柱色谱的冲洗剂相同；②展开时点在薄层板上的样品，切勿浸入溶剂中，展开剂的展开高度以3/4为宜；③显色的方法有紫外线灯、碘蒸气和喷洒显色剂等；④某一成分的最适分离条件通常是Rf=0.2～0.6。
2．柱色谱法（column chromatography）
通常装有填充剂的柱色谱分离方法是一种广泛用于海洋生物活性物质的实验室分离纯化的方法。由于填充剂的不同，可分为吸附柱色谱、离子交换柱色谱、凝胶柱色谱等。填充剂是决定柱效的重要因素，要根据被分离化合物的类型来决定选用何种类型的柱色谱法。
（1）吸附柱色谱（adsorption chromatography） 吸附柱色谱一般是将分离的物质吸附在色谱柱内的吸附剂（填充剂）上，然后用冲洗剂进行冲洗，收集各种流分，按照被分离的物质的特性进行检测（可用TCL），来判断其分离效果。由于吸附剂对不同化合物的吸附、解脱能力大小不同，从而达到分离纯化的目的。吸附剂有硅胶、氧化铝和活性炭等。洗脱剂与溶剂分离法中常用的溶剂相同，多采用混合溶剂。吸附剂的颗粒直径越小，直径范围越窄，其分离效果越好。如果吸附剂的颗粒太小，冲洗剂的流速太慢，可以采用加压或者减压的方法，提高冲洗剂的流速。
（2）离子交换柱色谱（ion exchange chromatography） 离子交换柱色谱用离子型的合成树脂作为固定相，用水溶液作为流动相。在洗脱过程中，流动相中的离子性物质与固定相中的交换基进行离子交换反应而被吸附，当遇到新的交换溶液时发生解脱作用，这是一个动态的平衡过程，利用各种物质的洗脱能力的不同，经过多次的吸附、解脱过程，从而达到分离纯化的目的。此方法适合氨基酸、蛋白质、多糖等化合物的分离纯化。
固定相为离子交换树脂，可分为阳离子交换树脂（含—SO3H、—COOH、—PO3H2等基团的树脂）和阴离子交换树脂［含—N(CH3)3X、—NR2、—NHR、—NH2等基团的树脂］。
固定相为大孔吸附树脂（macroporous adsorption resin），这是一种不含离子交换基团的、具有大孔结构的高分子吸附材料。大孔树脂分为低极性吸附树脂和高极性吸附树脂两种，这种树脂是一种吸附、洗脱能力较强的树脂，适用于水溶性的低极性和非极性化合物的分离纯化，其脱盐效果比其他树脂都好。
流动相多数是使用水，有时也使用水-甲醇混合溶剂，甚至有时还在溶液中加入乙酸、氨水等缓冲剂。
（3）凝胶柱色谱（gel filtration chromatography）
① 葡聚糖凝胶G 通常是以葡聚糖凝胶G和聚丙烯酰胺凝胶作为固定相。凝胶是一种具有一定交联度的多羟基多孔三维空间网状结构的聚合物。这种凝胶柱色谱均在水溶液中进行，凝胶颗粒在适当的水溶液中浸泡，待充分膨胀后装入色谱柱，加样后用相同的溶液进行冲洗。在冲洗过程中，样品较小的分子进入凝胶的网孔中，较大的分子不能进入网孔而随着流动相流动，这是一个动态平衡过程。由于被分离物质的分子量不同，所以流出液的各种组分是按照分子量的大小顺序排列的，从而达到分离纯化的目的。
② 葡聚糖凝胶LH2 固定相是在葡聚糖凝胶G的分子中引入羟丙基基团的凝胶，它既具有亲水性，又具有亲脂性，可以在多种有机溶剂中膨胀，适用于一些难溶于水、亲脂性的有机物的分离纯化。流动相使用的是甲醇、氯仿等有机溶剂。
（4）高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC） 现代高效液相色谱法采用的色谱柱是内径为1～3 mm、长为10~30 cm的内壁抛光的不锈钢管，内装有2～10 μm微粒的固定相，用输液泵在高压（30～60 MPa）下将洗脱剂输入柱内，流动相快速（1～10 mL/min）流出。同时，配有高灵敏度的检测器和自动扫描仪及馏分收集仪。从进样品到检测过程都在一个封闭体系中进行，实现了仪器化、连续化操作。
现代高效液相色谱法与气相色谱法和经典液相色谱法相比，具有分析速度快、分离效率高、检测灵敏度高和应用范围广泛等优点，特别适合于大分子、高沸点、极性大和稳定性较差的海洋生物活性物质的分析和制备工作。通常是在室温下操作，只要样品在流动相中有一定的溶解度便可以进行工作，有时为了提高柱效或改善分离效果可以升高柱温，但不应超过65℃。
四、活性化合物的结构鉴定
所需要的生物活性物质分离纯化之后要进行结构测定，只有确切地了解活性物质的化学结构，才可能更好地了解其结构与功能之间的关系，从而有可能对分子进行修饰，增强其活性或进行化学合成。
测定结构常用到红外光谱（IR）、紫外光谱（UV）、核磁共振谱（NMR）、质谱（MS）、旋光谱（ORD）、圆二色谱（CD）、蛋白质和核酸序列分析，以及X射线晶体衍射分析等技术。仅靠一种分析方法通常难以确定分子结构，常常需要多种方法相互配合才有可能确定，特别是要确定一种未知化合物的分子结构更是如此。红外光谱是记录有机分子吸收红外光后产生化学键振动而形成的吸收光谱，常用来确定各种羰基、烷基、芳环及炔烃等基团的特征吸收峰；紫外光谱是记录有机分子在吸收紫外光后产生电子振动而形成的吸收光谱，常用来测定分子内的共轭系统；质谱是研究物质粒子的质量谱，使用质谱仪，仅需几微克甚至更少的样品，就能精密地得到化合物的分子量和分子式，同时，因为各类化合物在质谱裂解中有一定的规律，从质谱的碎片及其相互关系可以得到分子结构的线索，质谱在海洋生物活性物质的结构测定中成了不可缺少的工具。近年来，质谱技术发展很快，现在已有很多种离子源的质谱技术，如电子轰击质谱（EI-MS）、场离子质谱（FI-MS）、场解析质谱（FD-MS）、化学离子质谱（CI-MS）、快原子轰击质谱（FAB-MS）、电喷雾电离质谱（ESI-MS）等。质谱除可用来确定分子量外，还可得到大量的结构信息，可用来推导结构，目前新发展的一种激光解吸飞行时间质谱（MAL-TOF-MS）对生物分子分析十分有用。
核磁共振谱也许是有机分子结构测定中最重要也是发展最快的，表现在两个方面：一是采用超导磁铁如500 MHz、600 MHz或1000 MHz等高磁场NMR技术的开发应用；二是采用脉冲傅里叶变换的脉冲技术开发。迄今已开发了数百种脉冲系列及各种二维（2D-NMR）及三维（3D-NMR）技术。有机分子一般由碳、氢组成，氢谱和碳谱及相关谱对有机分子测定至为重要。氢谱（1H NMR）提供了分子中氢原子的数目及其化学环境以及氢与氢之间的一些关系。碳谱（13C NMR）可以提供很多信息，包括碳原子数目、所处的化学环境。碳谱的一些技术，如DEPT技术能指定分子中CH3、CH2、CH以及季碳、双键羰基等功能团。二维磁共振中最常用的有质子-质子相关谱（1H-1H - COSY）、杂原子相关谱（如同碳的碳氢相关HMQC、远程碳-氢相关谱如HMBC等），还有NOESY、ROESY相关谱等，用这些技术可以显示分子中质子与质子、质子与碳原子等的相关系统，从而对推导分子骨架结构与功能团的位置起到重要作用。
三维共振技术是近年发展起来的最新技术。对于分子量很大又非常复杂的化合物，2D-NMR谱上各种峰之间存在严重重叠，以致无法解释和归属，3D-NMR技术的发明，极大地提高了信号的分辨率，它是在2D-NMR上引入第三领域，理想地减少2D-NMR的重叠度。利用3D-NMR技术可测定分子量近15000的蛋白质的一、二级结构。旋光谱和圆二色谱可用来推定化合物的构型；蛋白质和核酸序列自动分析技术用于确定氨基酸和核苷酸分别在蛋白质和核酸分子中的排列顺序；X射线晶体衍射技术则用来测定晶体的空间结构。如岩沙海葵毒素的分子量达到2680，分子式为C129H223O54N3，其结构测定就是先把它分裂为几个碎片，分别测碎片结构后根据现代波谱数据把它们连接起来，其结构测定于1981年年底完成，被誉为当今产物化学的一个重大成果。