利用FPLC分析转基因小型猪血浆脂蛋白

魏静元^*，刘成雁，王志嘉

（辽宁省标准化体系建设工程技术研究中心辽宁省分析科学研究院，沈阳 100015）

载脂蛋白CⅢ（Apolipoprotein CⅢ，ApoCⅢ）是一种低分子水溶性蛋白质，79个氨基酸残基，单链多肽，分子量为8.7～8.8kD，主要分布在血浆高密度脂蛋白（HDL）、极低密度脂蛋白（VLDL）和乳糜微粒（CM）中。ApoCⅢ抑制脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，LPL）^[1-4]，但没有证据显示它们之间存在直接结合^[5] 。我们应用核移植^[6]等技术，获得了人ApoCⅢ（hApoCⅢ）转基因克隆小型猪^[7]。hApoCⅢ转基因克隆猪由于过表达了人的ApoCⅢ蛋白，其脂蛋白构成发生了变化，由此也带来了一些生理功能方面的改变，本文对此进行了分析和探讨。

FPLC全称为快速蛋白液相色谱其原理与高效液相色谱理论类似，利用不同的色谱柱（疏水、离子交换、凝胶、亲和、反相等），将所需的蛋白质^[8,9]、多肽^[10]及多核苷酸^[11]或要去除的杂蛋白从样品中分离出来。

FPLC不但保持了HPLC的快速、高分辨率等特性，而且还具有柱容量大、回收效率高及不易使生物大分子失活等特性；因此在近年来在分离蛋白质、多肽及寡核苷酸等方面得到了广泛应用。

1　材料

1.1　实验动物

hApoCⅢ转基因克隆猪。

1.2　主要仪器和材料

快速蛋白液相色谱仪（AKTA explore10），Superdex 200TM 10 /30 GL型凝胶过滤柱，Milli-Q纯水机，0.22μm Millipore滤膜。离心机（CF16RXII，日立）。

乙腈为色谱纯，其他为分析纯。

流动相：乙腈-水（体积比1 : 1），流速为1.0ml/min。检测波长为360nm，柱温25℃，进样量为20μl。

2　方法

2.1 FPLC(快速蛋白液相色谱)分析

小型猪血浆200µl，经0.22µm滤器过滤后上样，以500µl/min的速度自动收集所分离的组分，每个组分500µl，共收集35个组分。

2.2 VLDL的SDS-PAGE

分别采集转基因和非转基因小型猪血浆各5ml，缓慢加至含有5ml生理盐水的10ml离心管底部，各离心管称重配平，10℃、3.8×10⁴r/min超速离心18h，离心结束后小心移取上层VLDL进行脱脂。聚丙烯酰胺梯度凝胶4%～18%，调整上样量，使甘油三酯等量。

3　结果

3.1 FPLC分析

在FPLC脂蛋白分析中，hApoCⅢ转基因小型猪血浆极低密度脂蛋白（VLDL）颗粒较非转基因小型猪显著增高［图1（b）］，但是胆固醇两者没有显著差异［图1（a）］。

3.2 VLDL的分离

VLDL的SDS-PAGE分离电泳如图2所示，hApoCⅢ转基因小型猪血浆的ApoCⅢ表达量明显比非转基因猪多，但是两者的ApoE表达数量近似。

4　讨论

作为脂蛋白代谢之重要调节剂的ApoCⅢ，与高脂血症和心血管疾病密切相关。本研究中，hApoCⅢ不但在小型的猪肝脏^[和小肠进行了表达，而且小型猪VLDL/CM颗粒也显著增高，结果是其血浆甘油三酯的清除造成延迟。此一方面表明ApoCⅢ的过表达抑制了LPL的活性，进而减慢了VLDL/CM的分解，另一方面也显示ApoCⅢ极有可能作为１型糖尿病的一个有效治疗靶点。

FPLC是一种常用的中压液相色谱，由于其快速、简单，很早就用于蛋白质的分离纯化。根据所要纯化的目的蛋白的特性，利用FPLC结合不同的色谱柱分离纯化蛋白质的报道已屡见不鲜。本研究用FPLC分析转基因小型猪血浆脂蛋白，为深入研究提供了可能。

参考文献

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基金项目：国家自然科学基金(No. 31172172; No. 31201874; No. 31201761)，中国博士后科学基金(No. 2011M500616, No. 2012T50303)，辽宁省博士启动基金计划(20121108)