亲水性分子印迹磁性聚合物微球的制备及磁分散固相萃取牛奶中四环素类药物残留

赵文革，李霄洋，吕运开^*

（河北大学化学与环境科学学院，保定 071002）

四环素类药物作为一种广谱抗菌药物，在禽畜饲养过程中被广泛应用，用来防治疾病和促进生长。由此产生的药物残留问题给人们身体健康带来严重威胁^[1]。我国规定了牛奶中四环素类兽药的最大残留限量为0.1mg/kg^[2]及其标准检测方法^[3]。其检测标准和文献中一般采用Oasis HLB柱和阳离子树脂柱净化样品，以及液液萃取后浓缩或C18柱进行富集^[4]。该样品前处理方法操作繁琐、回收率低。因此，急需发展一种集选择性富集和净化为一体的新型吸附剂。

分子印迹聚合物引入了特异性吸附位点，增强了在实际样品分析过程中的选择性富集效果。因此，分子印迹技术已经成为制备高选择性吸附剂的主要方法^[5]。为了实现简便快速的样品处理过程，磁性分子印迹微球的制备方法获得了迅速发展^[6]。在分离富集药物分子时，样品基体中的大分子物质（如蛋白质、核酸等）会吸附在吸附剂表面，不仅影响药物分子吸附，而且严重干扰其分析检测。如何实现选择性吸附富集小分子化合物，又能排阻生物大分子吸附。

本工作设计了一个吸附剂的外层亲水，内层特异性吸附药物小分子的磁性分子印迹聚合物微球。采用反相乳液-悬浮聚合方法制备的微球，解决了常规悬浮聚合中高黏度功能单体和交联剂分散性差，而导致粒径较大、微球大小不一致和微球粘连的问题。通过选择性实验、热重实验、红外光谱分析、接触角测定、蛋白质吸附试验等分析手段，详细研究了该微球的选择性、排阻性、亲水性等性能，并应用于磁分散固相萃取牛奶样品中四环素药物残留。

1　实验部分

1.1　试剂和仪器

苯乙烯（St）、甲基丙烯酸（MAA）、丙烯酰胺（AM）和二乙烯基苯（DVB）购于天津市百世化工有限公司。甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）、羟乙基纤维素、偶氮二异丁腈（AIBN）、盐酸四环素（TC）、盐酸土霉素（OTC）、盐酸强力霉素（DC）、盐酸金霉素（CTC）、牛血清白蛋白购于国药集团化学试剂北京有限公司。所用试剂均为分析纯或色谱纯，水为二次蒸馏水。

称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml 95%乙醇，再加入100ml 85%磷酸，用水稀释至1L，即得0.01%（质量浓度）考马斯亮蓝试剂。在0.15mol/L NaCl中配置0.5mg/ml牛血清白蛋白溶液。Na₂EDTA-McIlvaine缓冲溶液（0.1mol/L）：将0.2mol/L 156.5ml磷酸氢二钠溶液与250ml 0.1mol/L柠檬酸溶液混合，再加入15.1g Na₂EDTA，搅拌均匀，并用氢氧化钠和盐酸调节pH值到4.0左右。

仪器及其分析条件：LC-20A高效液相色谱仪（Shimadzu，Kyoto，Japan）。色谱柱：Venusil XBP C18 柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇/乙腈/10mmol/L草酸（5 : 25 : 70，体积比）；流速1.0ml/min；检测波长350nm；温度25℃。T6新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。

1.2　限进介质-分子印迹微球的制备

1.2.1　磁流体的制备

分别配制0.5mol/L的FeCl₂溶液和0.25mol/L的FeCl₃溶液，待用，将50ml H₂O加热至60℃并恒温，加入10ml FeCl₂溶液和40ml FeCl₃溶液，磁力搅拌混合均匀，然后逐滴加入1.0mol/L的NaOH溶液40ml，溶液由黄色变为红棕色，最后完全变为黑色；NaOH溶液滴加完毕后，恒温60℃反应4h，得到黑色Fe₃O₄粒子的悬浮液，静置24h后，将绝大部分上清液去除，即可得到Fe₃O₄磁流体。洗至中性，干燥备用。

1.2.2　有机相制备

① 油酸接枝：取1.0g磁流体放入50ml烧杯中，加入1ml油酸，搅拌10min，超声20min，备用。

② 将0.72g的四环素、0.9ml的MAA、0.36g的AM以及2ml水加入到50ml烧杯①中，充分溶解。

③ 将0.5ml甲苯和0.06g AIBN加入到②中，待AIBN完全溶解后加入2ml DVB和4.6ml的GMA及10ml的St，将溶液搅拌均匀，加入经油酸接枝的Fe₃O₄磁流体及烧杯①中的液体，搅拌5min，混合均匀，超声分散5min，即可得到有机相。

1.2.3　悬浮聚合

将0.4g的HEC加入到100ml水中，搅拌12h，使其完全溶解并搅拌均匀，将其转入到250ml烧瓶中，通氮气除氧5min，加入有机相，在温度60℃，转速530r/min下反应1h；1h后补加0.06g AIBN，调转速至650r/min，升温至90℃反应4h，即可得到亲水性分子印迹磁性微球。用蒸馏水洗涤至澄清，再用甲醇洗2～3次，将洗净后的亲水性分子印迹磁性微球倒入到50ml的烧杯中，加入乙酸：甲醇（1 : 9，体积比），震荡24h，取出，用蒸馏水冲洗至中性，在80℃真空干燥箱中干燥至恒重。

1.2.4　开环反应

将微球放入到25ml高氯酸（20%，体积比）溶液中，在室温下以转速为200r/min，反应24h，反应完成后，用水洗至为中性，最后在40℃真空干燥箱中干燥24h。

1.3　蛋白质吸附实验

取6只试管，分别加入浓度（mg/ml）为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5的标准蛋白质溶液0.1ml，然后加入5ml考马斯亮蓝试剂，震荡混匀，2min后于595nm测定吸光度，以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线^[7]。20mg微球加入5ml 0.2mg/ml蛋白质溶液，在室温下震荡8小时。按照上述步骤测定上清液蛋白质含量，计算吸附容量。

1.4　磁分散萃取奶样中四环素类抗生素

在一个玻璃离心管内，加入5g奶样，然后加入2ml 20%三氯乙酸（TCA），振荡后，加入20ml Na₂EDTA-McIlvaine缓冲溶液。这混合物以4000转离心20min。取出上清液，调pH值为5.4左右，在其中加入磁性微球（微球用3ml甲醇和2ml水活化），振荡1h；分离出磁性微球，用2ml 5%甲醇水溶液淋洗微球，除去杂质，再用3ml甲醇洗脱四环素类药物。洗脱液采用氮吹仪除去溶剂，剩余物溶于1ml流动相中，用一个0.45μm PTFE滤膜过滤，然后进行液相色谱分析。

2　结果与讨论

2.1　磁性微球形貌表征

将磁性微球经过洗涤至干净后，通过光电显微镜表征，结果如图1所示。由图1可以看出通过悬浮聚合法制备的分子印迹亲水性磁性微球，分散性好，成球性好，表面光滑，微球平均粒径为250μm。

2.2　红外光谱表征

图2为亲水性分子印迹磁性微球开环前和开环后的红外分析图谱。如图2所示，在3441cm⁻¹附近处出现了O-H伸缩振动峰，在2925cm⁻¹处出现芳烃C-H伸缩振动峰，而1598cm⁻¹、1452cm⁻¹和1462cm⁻¹均为苯环上C=C骨架伸缩振动峰。经图2中（a）和（b）两图进行对比，可看出在1109cm⁻¹出现C-O伸缩振动峰有明显变化，经过开环反应的磁性微球C-O伸缩振动峰明显增大，C-O键比未开环前明显增多，说明通过开环反应，已经将GMA的环氧基团打开。

2.3　热重分析

如图3中曲线a所示，磁性聚合物在室温至800℃静态空气中有三段明显的失重。第一段失重在约100～350℃时，失重量为10%；第二次发生在约350～450℃，失重曲线陡直，失重量达到约70%；第三次失重从约450～650℃，失重曲线平缓，失重量约为16%，总失重量约为86%，650℃之后磁性微球质量基本保持恒定，体系中只剩下无机Fe₃O₄粒子，因此可知含Fe₃O₄颗粒约为14%。而由图中曲线b可以看出，纯有机的苯乙烯微球经过测试几乎失重完全，则可进一步说明亲水性磁性微球中含有无机Fe₃O₄粒子。

2.4　微球表面亲水特性及蛋白质吸附研究

通过测定开环前后的磁性微球的接触角，研究其疏水亲水特性。如图4所示，环氧基磁性微球的接触角为116.13°，明显大于90°，显示其具有疏水性；开环后的磁性微球的接触角为29.90°，小于90°，显示为亲水性。由图5可看出，GMA开环后对蛋白质的吸附量远远小于GMA开环前对蛋白质的吸附量，这是由于开环后的微球表面有大量的二醇基基团，降低了对蛋白质的特异性吸附和蛋白变性现象。因此，在水相体系中，亲水性分子印迹磁性微球对水溶性蛋白质具有较好的排阻能力。

2.5　富集作用

亲水性分子印迹磁性微球对四环素类抗生素富集效果是采用0.1mg/L标准混合溶液（OTC、TC、CTC、DC）进行实验。取10ml标准溶液（pH=4，柠檬酸盐缓冲溶液）按照1.3的步骤进行操作，残留物重新溶解于1ml的流动相中，然后用HPLC-UC进行分析，其富集的色谱图如图6所示，富集因子（EF）通过方程式EF=c_f /c_i计算，其中c_i是样品溶液中分析物的初始浓度，c_f是最终浓度，计算得知富集因子分别是8.98（OTC）、9.06（TC）、8.72（CTC）和9.03（DC），由此可见，亲水性分子印迹磁性微球对目标分子有一定的富集作用。

2.6　牛奶样品中四环素类抗生素残留的测定

为了研究亲水性分子印迹磁性微球对牛奶中四环素类抗生素测定的可行性，我们通过磁性分散萃取法对加标回收率进行了测定，分析结果如图7所示。在最佳条件下，0.1mg/kg、0.2mg/kg和0.5mg/kg加标奶样中的四种四环素类抗生素的平均回收率在80.2%～92.6%内，相对标准偏差（RSD）在1.9%～5.0%内，并且用该方法OTC、TC、CTC、DC的检出限（LOD，S/N=3）和定量限（LOQ，S/N=10）分别是2.68和8.93，2.45和8.17，5.82和19.4，4.79和16.0μg/kg，如表1所示。

3　结论

本研究以四环素为模板分子，成功的制备了亲水性分子印迹磁性微球。经实验证明，亲水性分子印迹磁性微球具备内层疏水外表面亲水的优越性能，同时具备选择性强、净化效果好、对蛋白质大分子有效排除的特点。通过对牛奶样品中四环素类药物进行净化富集，经高效液相色谱检测，达到了良好的分析效果，其回收率≥80.2%，检出限≤5.82μg/kg。亲水性分子印迹磁性微球在生物样品、食品样品中具有较好的潜力应用前景。

参考文献

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[2] 农业部第235号公告. 动物性食品中兽药最高残留限量[S]. 2002: 12.

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[4] Fritz JW, Zuo Y. Food Chem, 2007, 105 (3): 1297-1301.

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[6] Lv YK, Zhao CX, Li P, et al. J Sep Sci, 2013, 36(16): 2656-2663.

[7] Bradford MM. Anal Biochem, 1976, 72: 248-254.

基金项目：国家自然科学基金资助项目(21375032)、河北省自然科学基金项目(B2016201213)

^*通信作者：吕运开，男，教授，Tel：0312-5079795，E-mail：lvyunkai@hbu.edu.cn