3.5.3　混合物料堆肥DOM光谱学分析

3.5.3.1　DOM紫外光谱

有机化合物的紫外吸收光谱决定于分子的结构，随有机分子复杂度的不同而异。图3-42为4个处理不同堆肥时期DOM的紫外吸收光谱曲线。从图3-42可以看出，堆肥DOM紫外吸收强度随波长的增加而呈降低趋势，在280nm附近出现一吸收平台，随着堆肥的进行整个研究波段的紫外吸收强度增加。已有的研究显示，280nm附近的吸收平台为腐殖质物质中木质素磺酸及其衍生物的光吸收所引起的，并且随着腐殖质芳香族和不饱和共轭双键结构的增加，腐殖质物质单位摩尔紫外吸收强度增强。因此，上述不同堆肥阶段DOM的紫外吸收曲线及其变化趋势表明，堆肥DOM中含有腐殖质类物质，并且随着堆肥的进行，腐殖质物质的芳香度和不饱和度增加，腐殖化程度加大^［80］。

从图3-42还可看出，在堆肥过程中水溶性有机物的紫外光谱缺乏较为明显的特征，没有明显的最高峰和最低峰。所有处理紫外光谱基本一致，但在各波长下的吸光度有所差异，堆肥结束后各处理吸光度从大到小依次为T₃、T₂、T₁、T₄。一般情况下，随着DOM分子结构复杂化程度的增加，其紫外光谱各波长对应的吸光度均呈增加趋势^［81］，因此由图可得堆肥结束后T₃的芳构化程度最高。

有研究认为，相同碳浓度的DOM在254nm波长下吸光度的变大意味着非腐殖质向腐殖质的转化；有专家研究水体中有机物表明，有机物在波长280nm下的吸光度可提供有关DOM腐殖化程度、分子量及分子缩合度等方面的信息；在有机质的紫外光谱研究中，除了特定波段或波长吸收值的研究外，另一个常用的参数是两个特定波长吸光度的比值，有研究表明E₂₅₀/E₃₆₅和E₂₅₃/E₂₀₃可反映DOM的腐殖化程度，将这两个参数用于混合堆肥DOM腐殖化研究。

由表3-29可见，各处理SUVA₂₅₄、SUVA₂₈₀、E₂₅₃/E₂₀₃随堆肥时间均呈升高的趋势，这说明随着堆肥进行DOM分子量不断变大、分子结构的缩合度和不饱和度也逐渐变大，DOM腐殖化程度呈升高趋势，这与前人的研究结果一致。分别比较各处理堆肥结束后（即第30天）上述3个参数大小，可发现SUVA₂₅₄、SUVA₂₈₀、E₂₅₃/E₂₀₃从大到小排序均为T₃>T₂>T₁>T₄，说明T₃处理腐殖化程度最高，T₄处理最低。与上述3参数不同，各处理E₂₅₀/E₃₆₅随堆肥进行基本呈降低趋势，有研究表明，该值与有机质分子量呈反比关系，说明在堆肥过程中DOM分子量是逐渐变大的。堆制30d后，各处理E₂₅₀/E₃₆₅从小到大排序均为T₃<T₂<T₁<T₄，这与上述紫外波段光谱研究结果一致。

3.5.3.2　DOM发射光谱

不同堆肥阶段水溶性有机物的荧光发射光谱表现为宽而单一的荧光峰，随着堆肥的进行荧光强度不断增强（见图3-43）。一般而言，发射光谱的峰宽由2个因素决定，即基态能级变化及水溶性有机物中结构类似物的多少^［82］，前者在不同物质中一般是固定的，因此水溶性有机物的发射光谱峰宽主要取决于结构类似物的多少，故不同堆肥阶段水溶性有机物荧光发射光谱中出现的较宽荧光峰表明堆肥水溶性有机物是一大类结构类似物的集合体^［83］。

从图3-43发现4个处理堆肥DOM有相似的发射光谱图，图中出现了一个以440nm为中心、波长范围较宽的谱带，这类似于Senesi等报道的污泥中富里酸的荧光发射光谱，图中出现的410～415nm处的峰是水的Raman肩峰^{［84，85］}。一般相同条件下，待测有机物不饱和结构（主要是含苯环类物质）的多聚化或联合程度越大，则波峰强度越小。随着堆肥的进行，各处理堆肥DOM的荧光强度不断增强，说明各处理DOM芳构化程度不断增加。4个处理堆肥DOM发射光谱基本一致，但荧光峰强度有所差异，从大到小排序为T₃>T₂>T₁>T₄，说明堆肥结束后各处理腐殖化程度最高的是T₁，其次是T₂、T₁，T₄腐殖化程度最低。

3.5.3.3　DOM同步光谱

堆肥水溶性有机物同步荧光光谱主要出现了4个荧光峰，280nm附近有一个十分强的荧光强度峰；340nm和385nm附近分别有中等强度峰；430nm附近有一个荧光强度十分弱的肩峰（见图3-44）。根据已有的报道可知，280nm附近的荧光峰与堆肥样品中的类蛋白质物质和含高度共轭结构的挥发性脂肪族有机酸的存在有关^［86］，激发波长335nm特征峰相当于2环芳烃化合物，400nm附近的特征峰为3、4环芳烃化合物；450nm则相当于5环芳烃化合物。随着堆肥的进行，水溶性有机物中类蛋白峰荧光强度呈下降趋势，而340nm、385nm和430nm附近的荧光峰强度都呈上升趋势，显示在堆肥进行时，蛋白质类物质不断降解，而水溶性有机物中2环、3环、4环及5环芳烃化合物均有不同程度的增加。同时，280nm附近的荧光峰有较为明显的红移现象，这种红移现象说明堆肥后水溶性有机物分子中共轭作用加强，分子结构的缩合增加。堆肥过程中，4个处理荧光同步扫描光谱形状基本相似，但荧光强度有明显差别，堆肥结束后，激发波长在300～500nm范围内，由大到小依次为T₃、T₂、T₁、T₄。表明堆肥后，T₃处理水溶性有机物分子结构最复杂、芳构化和腐殖化程度最高。T₁～T₄处理DOM荧光同步光谱见图3-44～图3-47。

3.5.3.4　DOM三维荧光光谱

书后彩图2～彩图5是4个处理不同堆肥时期DOM的三维荧光光谱，根据已有的报道可知，荧光峰T₁属于类色氨酸荧光，T₂为类蛋白峰，它们来自堆肥物质中以游离的形式存在或结合在蛋白质和/或腐殖质中的色氨酸及其降解产物，荧光峰A为紫外区类富里酸峰，荧光峰C为可见区类富里酸峰^［87］。堆肥起始时只存在荧光峰T₁、T₂，随着堆肥的进行T₁、T₂的荧光强度都不断变弱，而两个类富里酸峰出现后其荧光强度不断增强。Baker等研究表明，紫外区类富里酸峰主要来自一些低分子量，高荧光效率的物质，而可见区类富里酸峰则是由相对稳定、高分子量的芳香性类富里酸物质所产生^［88］。因此，堆肥DOM三维荧光特性解析证实，随着堆肥的进行，DOM中的有机成分发生显著变化，由堆肥初期的简单的类蛋白类物质逐渐转变为结构较为复杂的类富里酸类物质。同时也表明，堆肥过程中随着腐殖质的形成，堆肥中DOM的腐殖化程度也呈明显增加的趋势。

荧光峰A和C荧光强度的比值r（A，C）是一个与有机质结构和成熟度有关的信息，可能会揭示一些有关堆肥稳定化或腐熟度的信息^［89］。从书后彩图2～彩图5可看出，堆肥过程中，4个处理DOM三维荧光光谱图基本类似，4个处理r（A，C）都大致呈下降趋势，说明其腐殖化程度在不断变大。堆肥结束后，4个处理r（A，C）从小到大排序为T₃<T₂<T₁<T₄，即4个处理混合堆肥DOM腐殖化程度排序为T₃<T₂<T₁<T₄。

3.5.4　基于PCR-DGGE方法的混合物料堆肥过程细菌群落演替规律分析

3.5.4.1　堆肥微生物基因组DNA提取效果分析

由于堆肥过程中会产生大量的腐殖质类物质，有研究表明腐殖质会严重影响DNA的提取和PCR的扩增效果，因此在用土壤DNA试剂盒提取之前对样品进行了预处理，分别用PBS缓冲溶液和添加了PVP的脱腐缓冲溶液进行充分的洗涤，直至溶液呈现较清的颜色。如书后彩图6所示，经试剂盒提取后的基因组DNA片段大小在23kb左右，无需纯化可直接进行PCR扩增。

3.5.4.2　堆肥过程中细菌16SrDNAV3区PCR扩增效果分析

如书后彩图7所示，细菌的基因组DNA经过PCR扩增后的产物片段在接近200bp，经PCR产物纯化试剂盒纯化回收后的各个样品均适宜进行后续DGGE分析。

3.5.4.3　堆肥过程中细菌群落演替规律研究

（1）混合堆肥过程中细菌DGGE图谱分析

从书后彩图8可以看出4个堆肥处理的DGGE条带种类和分布表现出了明显的差异，T₂和T₃的细菌种类和数目明显高于T₁和T₄，尤其是在堆肥高温期以后，表现出了较高的多样性。条带E、H、J、K、L、M、N、O、R、S、T、V、W、Y为4个处理的共有条带，但在不同处理堆肥过程中各条带亮度和持续时间都有所不同。它们的共同特征是在T₂、T₃处理中亮度高、宽度大和持续时间长，尤其是在T₃处理，大多数共有条带贯穿整个堆肥过程，可视为T₃处理的优势菌群；共有条带在T₁、T₄处理，尤其在T₄处理中亮度低、宽度窄、持续时间很短。原因可能是T₂、T₃处理猪粪和鸡粪含量高，营养物质丰富，为微生物菌群生长创造了适宜的条件。T₁、T₄处理微生物数量少原因可能是沼渣含量高，难降解的木质素、纤维素、半纤维素含量高，仅能被少数微生物种群降解。

条带A为处理T₁、T₄的特有条带，仅在堆肥开始时出现，可能是A菌群不能耐受高温。条带B仅在T₁处理堆肥起始出现，可能是混合堆肥环境不适合其生存或其对温度的耐受性差。条带C分别出现在T₁的14d和T₂的6d。条带D在T₃整个堆肥过程中持续存在，分别在T₂和T₄的30d和0d出现。条带F仅出现在T₄处理的0d。条带G仅出现在T₃的30d和T₄的30d。条带I分别出现在T₁、T₂、T₃的6d和14d。条带P分别出现在T₁、T₂的6d和T₃的30d。条带Q分别出现在T₁的6d、T₂的6d和14d。条带U分别出现在T₁的0d和6d、T₂的6d和14d。条带X分别出现在T₂、T₃的14d和30d。条带Z分别出现在T₁、T₂、T₃的6d。条带A₁分别出现在T₂、T₃的14d和30d。

分析以上现象可以发现：a.非共有条带主要分布在T₁、T₂、T₃处理，T₄处理较少，原因可能是T₁、T₂、T₃处理的沼渣含量相对较少，易降解有机质含量丰富的猪粪和鸡粪量较多，导致微生物种群数多；b.非共有条带在各个处理分布的时期大致相同，说明温度是决定非共有条带存在的一个主要因素；c.在混合堆肥中温度对微生物群落的梯度效应表现得不太明显。

总之，不同配比混合堆肥过程中微生物种类和分布有很大的差异。

（2）混合堆肥过程中细菌群落相似性分析

对不同时间的堆肥样品的相似性指数（表3-30）和条带的聚类分析图（图3-48）可以看出不同堆肥处理第0天样品聚为一类、第6天样品聚为一类、第14天和第30天样品分别聚为一类，且三类中两两相似性很低，说明不同堆肥时期菌群组成差异较大。同一种堆肥处理样品的图谱除T₃外相似性较低，不同堆肥处理相同堆肥时期的图谱相似性较高，如T₄第0天样品和T₁第0天样品图谱相似性为62%，T₂第6天样品和T₁第6天样品图谱的相似性为71.5%，T₁第14天样品和T₂第14天样品图谱相似性为62.9%，T₃第30天样品和T₂第30天样品图谱相似性为77.2%。说明温度变化是T₁、T₂、T₄处理中微生物群落结构跃迁的一个至关重要的因素，但对T₃处理的影响不明显，说明在堆料中有机质含量充足的情况下温度对细菌群落的筛选作用会变小。

（3）混合堆肥过程中细菌群落多样性分析

生物多样性指数是有效表征生态环境中物种丰富度及分布均匀性的一个重要指标。通过计数DGGE图谱中的条带数和计算Shannon-Weaver指数来分析堆肥过程中的细菌多样性，从图3-49可以看出：T₁和T₂处理的条带数和Shannon-Weaver指数在堆肥周期中变化趋势相同，但在堆肥第14天和第30天T₂处理条带数和Shannon-Weaver指数明显高于T₁，原因可能是T₂处理猪粪和鸡粪含量多，供给微生物生长繁殖的营养物质丰富，细菌多样性高。T₃处理的条带数和Shannon-Weaver指数与T₄表现出显著差异（p<0.05），在堆肥高温期后（第6天后）T₃的条带数和Shannon-Weaver指数明显高于T₄处理，这说明堆料营养物质丰富可以提高堆肥降温期和腐熟期细菌多样性。比较4个处理14d和30d的带数和Shannon-Weaver指数可以发现，4个处理从大到小排序为T₃>T₂>T₁>T₄，这与4个处理堆料中猪粪和鸡粪总和所占比例从大到小排序顺序是一致的，这也说明堆料营养物质丰富可以提高堆肥降温期和腐熟期细菌多样性。另外，由图3-49还可看出，T₃处理在高温期过后，条带数和多样性指数明显降低，随后由于堆温降低，条带数和多样性指数明显回升，在堆肥末期堆料中易降解有机质消耗殆尽，剩下难降解的木质纤维类大分子物质，其条带数和多样性指数又逐渐降低。

（4）混合堆肥过程中细菌优势群落分析

表3-31是对4个处理堆肥过程中的优势条带测序并将测序结果提交到Genebank中进行比对后获得的比对结果。在沼渣混合物料堆肥过程中检测到了变形菌门细菌、厚壁菌门细菌、不动杆菌属细菌、堆肥细菌和大量的用传统方法不能培养但在堆肥过程中发挥了重要作用的细菌。这与解开治等^［90］分别在研究海洋动物资源堆肥和猪粪堆肥过程中检测到的结果相似。另外，还检测到了具有木质纤维素降解功能的梭菌属细菌、拟杆菌属细菌、假单胞菌、解木聚糖细菌。值得注意的是在沼渣混合物料堆肥中检测到了未培养的厌氧细菌、脱硫肠杆菌属细菌和嗜冷杆菌属细菌，说明与单一物料堆肥相比，沼渣、猪粪、鸡粪混合堆肥功能微生物多样性高。