任务六　显微镜

任务要求

1.了解显微镜的分类

2.掌握普通光学显微镜的构造

3.掌握普通光学显微镜的使用方法

4.了解普通光学显微镜的日常维护方法

显微镜是人类微生物科学研究领域最伟大的发明之一。在它发明出来之前，人类对周围事物的认知只能靠肉眼或者靠放大镜帮助肉眼观察，显微镜的出现使人类从宏观世界向微观世界观察成为可能，有助于科学家发现新物种和医生治疗部分疾病。

由于微生物个体微小，肉眼看不见或看不清楚，因此必须借助显微镜来观察。熟悉显微镜和掌握显微镜的操作技术是研究微生物必不可少的方法和手段。而显微镜是精密仪器，必须熟悉其构造及各部件的作用，才能真正掌握其使用方法，做到既懂得仪器维护，又敢于放手工作。

一、显微镜的种类

现代显微镜一般可以分为两大类：一类是光学显微镜；另一类是非光学显微镜。光学显微镜又分为可见光显微镜和不可见光显微镜。可见光显微镜按照明技术分为明视野、暗视野和荧光显微镜；按成像技术分为相差显微镜、干涉相差显微镜和偏光显微镜；按照镜体结构分为倒置、实体和比较显微镜。而不可见光显微镜分为紫外、红外和X射线显微镜。非光学显微镜分为电子显微镜和超声波显微镜，前者又有透射电子显微镜和扫描电子显微镜两种。下面将重点介绍几种常用的显微镜。

（一）普通光学显微镜

普通光学显微镜是通过目镜和物镜两组透镜系统组合作用实现放大成像的，故又被称为复式显微镜。普通光学显微镜由机械装置和光学系统两部分组成。机械装置包括镜座、镜臂、载物台、调焦螺旋等部件，是显微镜的基本组成单位，保证了光学系统的准确和灵活调控。光学系统由物镜、目镜、聚光器、光源等组成，直接影响着显微镜的性能，是显微镜的核心。一般的显微镜都可配置多种可互换的光学组件，通过这些组件的变换改变显微镜的功能，如明视野、暗视野、相差等。

（二）暗视野显微镜

营养态细菌在明视野显微镜下观察是透明的，不易看清楚，而暗视野显微镜则利用特殊的聚光器实现斜射照明，给样品照明的光不直接穿过物镜，而是由样品反射或折射后再进入物镜。因此，整个视野是暗的，而样品是明亮的，就像白天看不到的星空在黑夜能清楚地显现一样，在暗视野显微镜中由于样品与背景之间的反差增大，可以清晰地观察到在明视野显微镜中不易看清的活菌体等透明的微小颗粒。而且，即使所观察微粒的尺寸小于显微镜的分辨率，依然可以通过它们散射的光而发现其存在。因此，暗视野显微镜主要用于活细菌运动性的观察。

（三）相差显微镜

光线通过较透明的菌样时，光的波长（颜色）和振幅（亮度）都没有明显的变化，因此用普通光学显微镜观察未经染色的菌体时，其形态结构很难辨别。如果光线通过不同的折射率和厚度的细胞时，直射光和衍射光的光程就会发生改变。随着光程的增加或减少，加快或落后的光波的相位也会发生改变并产生相位差。相差显微镜因配备环状光阑和相差板等特殊的光学装置，利用光的干涉现象，就能将光的相位差转变为人眼可以察觉的明暗差，从而使原来透明的菌体表现出明显的明暗差异和对比度。从而实现了在不染色的情况下比较清楚地观察到活细胞及其细胞的细微结构。

（四）荧光显微镜

荧光是指荧光素吸收紫外线并转放出的一部分光波较长的可见光。经紫外线照射，发荧光的物体会在黑暗的背景下表现为光亮的有色物体，这就是荧光显微镜的工作原理。由于不同荧光素的激发波长范围不同，因此同一菌品可以同时用两种以上的荧光素标记，它们在荧光显微镜下经过一定波长的光激发出不同颜色的光，从而达到显像目的。荧光显微镜在免疫学、环境微生物学、分子生物学领域应用广泛。

（五）电子显微镜

由于显微镜的分辨率取决于所用光的波长，波长越短，成像放大倍数越大。因此，用波长极短的电磁波取代可见光来放大成像，可制造出分辨率更高的显微镜。1933年，德国人最早制造出世界上第一台以电子作为“光源”的电子显微镜。其工作原理是电子束通过电磁场时发生复杂的螺旋式运动，产生偏转、汇聚或发散，并同样可以聚集成像。而一束电子具有波长很短的电磁波的性质，其波长与运动速度成反比，速度越快，波长越短。理论上，电子波的波长最短可达到0.005nm，所以电子显微镜的分辨能力要远高于光学显微镜。几十年来，电子显微镜发展迅速，应用也日益广泛，对包括微生物学在内的许多学科的进步都起到了积极推动作用。

（六）扫描电子显微镜

扫描电子显微镜与光学显微镜和透射电镜不同，它的工作原理类似于显像管电视。电子枪发出的电子束被磁透镜汇聚成极细的电子“探针”，在菌体表面进行“扫描”，电子束扫到的地方就可激发菌样表面释放出二次电子。二次电子产生的多少与电子束入射角度有关，也就是说与样品表面的立体结构有关。与此同时，在观察用的荧光屏上另一个电子束也做同步的扫描。二次电子由探测器收集后被闪烁器转变成光信号，再经光电倍增管和放大器再次转变成电压信号来控制荧光屏上电子束的强度。这样，菌样上产生二次电子多的地方，在荧光屏上相应的部位就亮，从而就能得到一幅放大的菌样立体图像。

二、普通光学显微镜的基本构造

普通光学显微镜主要由机械装置和光学系统两部分组成。机械装置包括镜座、镜臂、转换器、载物台、调焦螺旋等，光学系统包括目镜、物镜、聚光器、光源等。普通光学显微镜结构见图2-44。

（一）机械装置

（1）镜座　位于显微镜底部，呈马蹄形，支撑整个显微镜。

（2）镜臂　位于镜筒后面，为弓形，起支撑镜筒作用，并且是搬移显微镜时握持部位。显微镜镜臂可根据需求改变角度，方便观察使用。

（3）镜筒　位于显微镜上方，上面安装目镜，下面连接转换器。根据镜筒个数可分为单镜筒和双镜筒两种。

（4）物镜转换器　位于镜筒下方，为两个金属圆碟合成的一个转盘，一般有4个圆孔，其可装配不同放大倍数的物镜，使物镜通过镜筒与目镜构成完整的放大系统。

（5）载物台　也叫镜台，一般为方形，上面有玻片夹，用于放置和固定标本。载物台上装有玻片移动器，可实现标本片的上下左右移动。另外，载物台中央有一通光孔，光线可以通过通光孔而直射到标本上。

（6）调焦螺旋　又叫准焦螺旋，在显微镜的镜臂上左右各有粗细准焦螺旋一对。粗准焦螺旋，可实现载物台的快速升降，便于迅速找出图像；细准焦螺旋，可实现载物台的细微升降，便于调节清晰图像。

（二）光学系统

（1）目镜　安装在镜筒上端，用于眼睛直接观察。目镜的作用是将由物镜放大的实像进一步放大，但不增加显微镜的分辨率。目镜上刻有放大倍数，常用的目镜有10×、16×，镜中可自装一条黑色纫丝作为“指针”，用来指示所观察的部位。根据需要，目镜内也可安装目镜测微尺，经校对后用以测量所观察物体的大小。

（2）物镜　安装在物镜转换器下方，用于放大物像。物镜是决定显微镜性能（如分辨率）的最重要的构件。物镜的作用是将标本第一次放大成倒像。一般显微镜常备有4个物镜，每个物镜由数片不同球面半径的透镜组成。物镜下端的透镜口径越小，镜筒越长，其放大倍数越高。物镜分为低倍物镜和高倍物镜，其放大倍数一般刻在物镜镜头上，例如4×、10×、40×、100×，分别表示4倍、10倍、40倍和100倍，其中40倍叫高倍物镜，100倍称为油镜。

（3）聚光器　安装在载物台下方支架上，主要由聚光镜和光圈组成。聚光镜作用是汇聚光线，增加标本的照明。光圈位于聚光镜下方，由多片金属片组成，中心圆孔大小可变，以调节光线强弱。另外，升降聚光器也可调节照明强度。在光圈下面，还有一个圆形的滤光片架，可根据镜检需要放置滤光片。

（4）光源　光源可以分为灯源和反光镜反射光两种。现代显微镜多以灯泡作为光源，可通过开关按钮控制光线强弱。反光镜安装在聚光器或转盘下方，其作用是把光源投射来的光向上反射到聚光器上为观察标本提供光线。

三、普通光学显微镜的使用

（一）显微镜的取放

显微镜使用时要从镜箱中取出，取放时注意右手握持镜臂，左手托住镜座，保持镜身直立，切不可用一只手倾斜提携，防止摔落目镜。要轻取轻放，放置时注意镜臂朝向自己，距桌边沿5～10cm。摆放显微镜的桌子要求平稳，桌面清洁，避免阳光直射。

（二）显微镜使用方法

1.开启光源

打开电源开关，通过开关按钮调节光线强弱。

2.放置载玻片标本

将待镜检的载玻片标本放置在载物台上用玻片夹固定，移动标本正对通光孔中央。

3.低倍物镜观察

用显微镜观察标本时，应遵循“先低倍再高倍”的原则。先用低倍物镜找到物像，因为低倍物镜观察范围大，较易找到物像，且容易找到要作精细观察的部位。具体操作如下：

（1）转动粗准焦螺旋，用眼从侧面观望，使载物台快速上升，直到低倍物镜距标本0.5cm左右停止。

（2）眼睛接近目镜观察，用手慢慢转动粗准焦螺旋，使载物台缓慢下降，直到视野内的物像较清晰为止。然后改用细准焦螺旋，调节至物像清晰。

（3）前后左右轻移载玻片位置，在视野中找到要观察的部位。注意视野中的物像为倒像，移动载玻片时应向相反方向移动。

4.高倍物镜观察

在低倍观察基础上，转动转换器至高倍物镜，进行高倍观察。具体操作如下：

（1）将欲观察的部位移至低倍镜视野正中央，物像要清晰。

（2）旋转物镜转换器，使高倍物镜移到卡槽位置上，利用物镜镜头的等焦性微调细准焦螺旋，使物像清晰。

（3）再次移动载玻片标本找到欲观察的部位。

5.换片

观察完毕，如需换用另一载玻片标片时，将物镜转回低倍物镜，取出玻片，更换新片，稍加调焦，即可观察。

6.整理

显微镜使用结束后，下降载物台至最低处，取下载玻片标本，清洁显微镜，把物镜转动呈“八”字形或置于最低倍物镜下，并调节玻片夹至适当位置，使物镜不会碰到。最后，套上专用防尘罩，并将显微镜放回指定位置。

四、普通光学显微镜使用注意事项

（1）显微镜是精密仪器，使用时必须按照操作规程，做到细心和耐心，切勿操之过急，动作过猛，以防操作失误而损坏构件。

（2）不要用手触摸显微镜光学玻璃部件，注意保持玻璃表面清洁。

（3）观察时载玻片要加盖盖玻片，注意防止载玻片上的水流到载物台上，更不要让酸、碱等腐蚀性化学药品接触显微镜。

（4）使用细准焦螺旋微调时，如遇到不能继续向同一方向转动而到达极限时，不能蛮转，应向相反方向转动粗准焦螺旋，然后再用细准焦螺旋进行微调。

（5）使用高倍物镜时，由于物镜与标本之间距离很近，因此要特别仔细，调焦时不能用粗准焦螺旋，只能用细准焦螺旋。

（6）目镜、物镜如有不洁时，使用擦镜纸作直线方向擦拭，切勿用手指或手帕及棉布涂擦。目镜或物镜如沾有油污，可先用擦镜纸蘸少许二甲苯擦拭干净，再用干净擦镜纸擦拭。

（7）换片时千万不可在高倍物镜下操作，以防损坏镜头。

（8）观察时坐姿要端正，双目并开，可两眼轮换观察以减轻疲劳。如需要绘图，一般用左眼观察标本，右眼看图纸，这样有利于提高工作效率。

（9）显微镜使用完毕，用擦镜纸清洁镜头，将各部分还原，并使低倍物镜转至中央或者将物镜转动呈“八”字形，下降载物台，套上防尘罩，放回箱内。

思考与交流

1.依据显微镜的分类，普通光学显微镜应属于明视野还是暗视野显微镜？为什么？

2.自行查阅资料，了解为什么观察细菌时要滴加香柏油。