3.2　堆肥过程中腐殖质还原菌的影响因素分析

3.2.1　有机组分与官能团对腐殖质还原菌群的影响

运用Canoco for Windows 5.0对34种腐殖质还原菌与堆肥过程中腐植酸及其前体物质进行分析，首先，利用除趋势对应分析（detrended correspondence analysis，DCA），第一排最大梯度为3.388。因此，本研究采用双峰模型CCA（典型关联分析）研究34个腐殖质还原菌种属与堆肥过程中的特定有机组分及腐植酸的相关性。

根据堆肥过程中腐殖质还原菌群落的CCA的统计信息，第一排序轴与第二排序轴的特征值分别为0.518和0.433，种类与环境因子的相关系数为0.924和0.876。充分说明本研究利用CCA可较好地反映腐殖质还原菌与堆肥过程中腐植酸及其前体物的响应关系。其中第一排序轴解释了28.5%的物种变化量，第二排序轴解释了32.2%的物种变化量，四个排序轴共解释物种60.4%的变化量。

堆肥过程中腐植酸形成会直接影响腐殖质还原菌的变化，有研究表明，羧基、多酚、氨基酸、多糖及还原糖是腐植酸形成的重要前体物质^［9］。其中，羧基、多酚及氨基酸不仅可作为腐植酸的前体物质，也是堆肥过程中起电子转移功能的重要的官能团^［10］，因此，堆肥过程中特定有机组分的变化会对腐殖质还原菌的演替规律产生重要影响。为进一步明确影响腐殖质还原菌的菌群结构的关键有机组分，我们采用偏相关分析筛选显著影响指标。结果表明，腐植酸、羧基、氨基酸及酚对腐殖质还原菌的菌群分布呈现显著的相关性（P<0.05），说明堆肥过程中此类有机组分变化显著影响腐殖质还原菌菌群演替规律。而由于堆肥过程中有机质的腐殖化过程主要是由于微生物引起的，也可说明腐殖质还原菌在不同有机组分及腐植酸形成过程中也起到至关重要的作用。

利用非度量多维尺度分析了单个指标解释腐殖质还原菌变化的百分含量。其中，腐植酸单独解释变量为31.5%（F=2.047，P=0.002），羧基单独解释变量为15.1%（F=2.043，P=0.014），氨基酸单独解释变量为14.2%（F=1.619，P=0.022），多酚单独解释变量为11.4%（F=1.541，P=0.046）。通过各指标解释变量比较表明，腐植酸单独解释变量最高，说明腐植酸对腐殖质还原菌的菌群分布影响最为显著。但由于多糖与还原糖对腐殖质还原菌分布影响较小，单独解释变量分别为7.6%（F=0.753，P=0.069）和5.8%（F=1.541，P=0.046）。多糖与还原糖可作为腐殖质还原菌的电子供体，并且对腐植酸形成也具有重要作用^［9］，因此，多糖与还原糖对腐殖质还原菌菌群结构变化存在直接或间接的影响。

根据排序图可以看出不同物质之间的相互关系以及与腐殖质还原菌的相关性，其中酚、羧基位于第一象限，氨基酸与腐植酸位于第二象限，多糖、还原糖位于第四象限，说明多糖、还原糖与羧基、酚呈负相关关系，羧基、酚与腐植酸呈负相关关系，而氨基酸与腐植酸、羧基、酚等相关性并不明显，进一步说明还原糖与多糖类物质促进了羧基及多酚的形成，而多酚、羧基对腐植酸的形成也起到重要的作用。这一过程的变化影响了腐殖质还原菌的菌群分布，如图3-4所示，第一象限中，类别Ⅰ（OTU5、OTU63、OTU54、OTU65、OTU58、OTU73、OTU170、OTU152及OTU74）与羧基、酚呈显著正相关，与多糖、还原糖呈负相关，说明类别Ⅰ中腐殖质还原菌可以多糖及还原糖作为碳源，并且随着羧基与多酚的逐渐形成，其数量也逐渐增多。类别Ⅰ与腐植酸呈负相关，说明这类腐殖质还原菌可利用的电子受体为羧基、多酚，而腐植酸中部分与电子转移能力相关的功能基团（如酚、醌等）会随着堆肥的进行逐渐降低。类别Ⅱ（OTU53、OTU138、OTU59、OTU169、OTU167、OTU144、OTU30及OTU145）与氨基酸呈正相关，氨基酸与微生物的胞外电子转移紧密相关，说明氨基酸在此类腐殖质还原菌的生长过程中起到重要作用。类别Ⅲ（OTU9、OTU26、OTU121、OTU74、OTU170、OTU132、OTU138及OTU166）与腐植酸呈正相关，在腐植酸形成过程中，有多种与电子转移能力相关的功能基团也随之变化，说明此类腐殖质还原菌可以此类功能基团为电子受体，进行腐殖质呼吸以供自身生长。类别Ⅳ（OTU2、OTU57、OTU51、OTU50、OTU42、OTU36、OTU31、OTU155及OTU90）靠近轴心位置，与其他几种物质相关性较弱，说明此类腐殖质还原菌的群落演替是与多种有机组分变化的共同作用相关联的，并不与某单一组分显著相关。

图3-4　堆肥过程中腐殖质还原菌与特定有机组分的CCA排序图

3.2.2　微环境对腐殖质还原菌群的影响

对腐殖质还原菌的相对丰度采用除趋势对应分析，即DCA分析，第一排序轴最大梯度为4.505，因此，选择双峰模型CCA分析堆肥过程中微环境因子对腐殖质还原菌菌群结构变化的影响。其中，种类与环境因子的相关系数分别为0.964和0.886。充分说明CCA分析可较好地反应腐殖质还原菌菌群结构与微环境因子之间的响应关系。其中，第一排序轴与第二排序轴分别解释了22.2%和39.5%的物种变化量。四个排序轴共解释73%的物种变量。

为筛选不同物料中堆肥微环境对腐殖质还原菌群落演替的关系，分区变化分析表明，可溶性有机氮、N-N、发芽率、有机质、pH值、可溶性有机碳、C/N及N-N分别单独解释了总变量的48.7%、41.7%、34.9%、43.7%、29.2%、28.5%、27.5%及25.5%，明显高于温度（7.4%）与含水率（6.6%）的单独解释变量。说明温度与含水率对腐殖质还原菌的菌群分布影响较小。采用偏相关分析进一步表明，发芽率、可溶性有机氮、可溶性有机碳显著影响腐殖质还原菌菌群结构的变化（P<0.05）。其他微环境因子对腐殖质还原菌的菌群分布影响程度相对较小。

CCA排序图可更为清晰地展现腐殖质还原菌与微环境因子的相关性，见图3-5（a）。类别1（OTU31、OTU36、OTU26、OTU9、OTU115及OTU142）与N-N呈正相关，而与N-N呈负相关，说明类别1中腐殖质还原菌菌群与氮的转化紧密相关，也证明堆肥过程中腐殖质还原菌菌群功能的多样性^{［10，11］}。类别2（OTU42、OTU138）与发芽率、秸秆腐熟期、枯枝腐熟期、牛粪腐熟期、杂草腐熟期、鸡粪腐熟期、果蔬腐熟期、秸秆升温期及秸秆高温期呈正相关，而与pH值呈负相关。类别3中含有的腐殖质还原菌种类最多，与有机质、可溶性有机碳、可溶性有机氮、鸡粪升温期、杂草升温期、污泥升温期、污泥高温期及升温期牛粪呈正相关，此类微生物主要存在于堆肥升温期及富含蛋白类的物料中［图3-5（b）］，这是由于大部分微生物在堆肥升温期需要丰富的营养源作为电子供体，以供自身生长^［12］。类别4（OTU9、OTU169及OTU65）与pH值呈正相关，堆肥过程中pH值的变化范围为6.23～8.89，说明弱碱条件能够促进类别4增长。这一结果也为在弱碱条件下筛选腐殖质还原菌提供了可能性。

图3-5　堆肥过程中腐殖质还原菌与微环境因子的CCA排序图分析及样品与微环境因子的排序图分析

CM—鸡粪；DCM—牛粪；FVW—果蔬；WW—杂草；SW—秸秆；GW—枯枝；SS—污泥；

1—升温期；2—高温期；3—腐熟期；DOC—可溶性有机碳；

DON—可溶性有机氮；N-N—硝态氮；N-N—氨态氮；OM—有机质；GI—发芽率

由于腐殖质还原菌可在污染环境中降解有机污染物^［13］，因此通过一定的过程调控技术手段，增加腐殖质还原菌的数量，理论上可以提升堆肥或土壤中污染物的生物修复效率。基于上述理论，通过腐殖质还原菌与微环境的响应关系分析，本研究构建了一种促进腐殖质还原菌生长的堆肥过程微环境调控方法。如图3-5所示，可溶性有机氮、可溶性有机碳和发芽率是影响堆肥腐殖质还原菌菌群分布的显著指标，那么，在秸秆、枯枝中适当添加易利用碳源、氮源可以促进类别3中腐殖质还原菌的生长。发芽率是一个重要的生物学指标，它的升高代表堆肥毒性的降低，并且与醌呈显著的相关性^［14］。也就是说，堆肥腐熟度及稳定性是促进腐殖质还原菌生长的另一个重要指标。另外，堆肥过程中腐殖质还原菌的生长对降低堆肥过程中的毒性也有重要作用。在合适的范围内降低pH值可促进类别2中腐殖质还原菌的生长，抑制了类别4中腐殖质还原菌的生长。类别1中腐殖质还原菌与氮转化过程密切相关，当N-N浓度升高时，类别1中腐殖质还原菌数量会被抑制，反之，类别2中腐殖质还原菌受到抑制。基于微环境与腐殖质还原菌的相关性，提出一种控制堆肥过程中腐殖质还原菌菌群结构的调控方法。然而，还有更多的研究工作需要继续开展，为进一步通过调控微环境促进腐殖质还原菌生长提供技术支持。