第二节　发酵食品微生物菌种选育保藏及扩大培养

一、发酵食品微生物菌种的选育

菌种是发酵食品生产的关键，性能优良的菌种才能使发酵食品具有良好的色、香、味等食品特征。菌种的选与育是一个问题的两个方面，向大自然索取没有的菌种，即菌种的筛选；已有的菌种还要改造，以获得更好的发酵食品特征，即育种。因此菌种选育的任务是不断向自然界发掘新菌种，改造已有菌种，达到提高产量、符合生产的目的。

育种的理论基础是微生物的遗传与变异，遗传和变异现象是生物最基本的特性。遗传中包含变异，变异中也包含着遗传，遗传是相对的，而变异则是绝对的。微生物由于繁殖快速，生活周期短，在相同时间内，环境因素可以相当大地重复影响微生物，使个体较易于变异，变异了的个体可以迅速繁殖而形成一个群体表现出来，便于自然选择和人工选择。

（一）自然选育

自然选育是菌种选育的最基本方法，它是利用微生物在自然条件下产生自发变异，通过分离、筛选，排除劣质性状的菌株，选择出维持原有生产水平或具有更优良生产性能的高产菌株。因此，通过自然选育可达到纯化与复壮菌种、保持稳定生产性能的目的。当然，在自发突变中正突变概率是很低的，选出更高产菌株的概率一般来说也很低。由于自发突变的正突变率很低，多数菌种产生负变异，其结果是使生产水平不断下降。因此，在生产中需要经常进行自然选育工作，以维持正常生产的稳定。

自然选育也称自然分离，主要作用是对菌种进行分离纯化，以获得遗传背景较为单一的细胞群体。一般的菌种在长期的传代和保存过程中，由于自发突变使菌种变得不纯或生产能力下降，因此在生产和研究时要经常进行自然分离，对菌种进行纯化。其方法比较简单，尤其是单细胞细菌和产孢子的微生物，只需将它们制备成悬液，选择合适的稀释度，通过平板培养获得单菌落就能达到分离目的。而那些不产孢子的多细胞微生物（许多是异核的），则需要用原生质体再生法进行分离纯化。自然选育分以下几步进行。

1．通过表现形态来淘汰不良菌株

菌落形态包括菌落大小、生长速度、颜色、孢子形成等可直接观察到的形态特征。通过形态变化分析判断去除可能的低产菌落，将高产型菌落逐步分离筛选出来。此方法用于那些特征明显的微生物，如丝状真菌、放线菌及部分细菌，而外观特征较难区别的微生物就不太适用。以抗生素菌种选育为例，一般低产菌的菌落不产生菌丝，菌落多光秃型；生长缓慢，菌落过小，产孢子少；孢子生长及孢子颜色不均匀，产生白斑、秃斑或裂变；或生长过于旺盛，菌落大，孢子过于丰富等。这类菌落中也可能包含着高产型菌，但由于表现出严重的混杂，其后代容易分离和不稳定，也不宜作保存菌种。判断高产菌落则根据：孢子生长有减弱趋势，菌落中等大小，菌落偏小但孢子生长丰富，孢子颜色有变浅趋势，菌落多、密、表面沟纹整齐，分泌色素或逐渐加深或逐渐变浅。

2．通过目的代谢物产量进行考察

这种方法是建立在菌种分离或者诱变育种的基础上进行的，在第一步初筛的基础上对选出的高产菌落进行复筛，进一步淘汰不良菌株。复筛通过摇瓶培养（厌氧微生物则通过静置培养）进行，复筛可以考察出菌种生产能力的稳定性和传代稳定性，一般复筛的条件已较接近于发酵生产工艺。经过复筛的菌种，在生产中可表现出相近的产量水平。复筛出的菌种应及时进行保藏，避免过多传代而造成新的退化。

3．进行遗传基因型纯度试验考察菌种的纯度

其方法是将复筛后得到的高产菌种进行分离，再次通过表观形态进行考察，分离后的菌落类型愈少，则表示纯度愈高，其遗传基因型较稳定。

4．传代的稳定性试验

在生产中活化、逐级扩大菌种，必然要经过多次传代，这就要求菌种具有稳定的遗传性。在试验中一般需要进行3～5次的连续传代，产量仍保持稳定的菌种方能用于生产。在传代试验中，要注意试验条件的一致性，以便能正确反映各代间生产能力的差异。

通过自然发生的突变，筛选那些含有所需性状得到改良的菌种。随着富集筛选技术的不断完善和改进，自然育种技术的效率有所提高，如含有突变基因naE、mutD、mutT、mutM、mutH、mutI等的大肠杆菌突变率相对较高。酒精发酵是最早把微生物遗传学原理应用于微生物育种实践而提高发酵产物水平的成功实例。自然选育是一种简单易行的选育方法，可以达到纯化菌种、防止菌种退化、提高产量的目的，但发生自然突变率特别低，一般为10^－9～10^－6。这样低的突变率导致自然选育耗时长，工作量大，影响了育种工作效率。

（二）诱变育种

诱变育种是利用物理、化学或生物的方法处理均匀分散的细胞群，促使其发生更多的突变，在此基础上采用简便、实用、快速的筛选方法，从中挑选出符合目的的突变株。在现代育种领域，诱变育种主要是提高突变菌株产生某种产物的能力。

1．诱变育种的基本方法

诱变育种的基本方法包括物理因子诱变、化学因子诱变和复合因子诱变3种。

（1）物理因子诱变　物理诱变剂包括紫外线、X射线、γ射线、激光、低能离子等。DNA和RNA的嘌呤和嘧啶有很强的紫外线吸收能力，最大吸收峰在260nm，此时紫外辐射作用DNA最强，是最有效的致死剂量。紫外辐射可以引起转换、颠换、移码突变或缺失等。紫外线是常用的物理诱变因子，是诱发微生物突变的一种非常有用的工具。由于紫外线的能量比X射线和γ射线低得多，在核酸中能造成比较单一的损伤，所以在DNA的损伤与修复的研究中，紫外线也具有一定的重要性。常用的电离辐射有X射线、γ射线、β射线和快中子等，如γ射线具有很高的能量，能产生电离作用，因而直接或间接地改变DNA结构。电离辐射还能引起染色体畸变，发生染色体断裂，形成染色体结构的缺失、易位和倒位等。

低能离子注入育种技术是近些年发展起来的物理诱变技术。该技术以较小的生理损伤得到较高的突变率、较广的突变谱，而且具有设备简单、成本低廉、对人体和环境无害等优点。目前，利用离子注入进行微生物菌种选育时所选用的离子大多为气体单质离子，并且均为正离子，其中以N^＋最多，也有报道使用其他离子的，如H^＋、Ar^＋等。辐射能量大多集中在低能量辐射区。早在1996年，离子束诱变用于右旋糖酐产生菌，得到产量提高36.5%的突变株；随后N₂激光辐照钝齿棒状杆菌，使其谷氨酸产量和糖酸转化率提高31%；用低能离子注入糖化酶生产菌，糖化酶活力从1.5万单位提高到2万单位。此外，用红外射线诱变果胶酶产生菌、双向磁场应用于产腈水合酶的诺卡氏菌种的诱变育种都得到了较好效果；还有微波、双向复合磁场、红外射线和高能电子流等新诱变技术，它们与其他诱变源一起进行复合诱变，能起到很好的诱变效果，因此从某种意义上称这些诱变源为“增变剂”。

（2）化学因子诱变　这是一类能与DNA起作用而改变其结构，并引起DNA变异的物质。其作用机制都是与DNA起化学作用，从而引起遗传物质的改变。化学诱变剂包括烷化剂（如甲基磺酸乙酯、硫酸二乙酯、亚硝基胍、亚硝基乙基脲、乙烯亚胺及氮芥等）、天然碱基类似物、脱氨剂如亚硝酸、移码诱变剂、羟化剂和金属盐类如氯化锂及硫酸锰等。烷化剂是最有效，也是应用最广泛的化学诱变剂之一，依靠其诱发的突变主要是GC-AT转换，另外还有小范围切除、移码突变及GC对的缺失。化学诱变剂的突变率通常要比电离辐射的高，并且十分经济，但这些物质大多是致癌剂，使用时必须十分谨慎。

（3）复合因子诱变　菌株长期使用诱变剂之后，除产生诱变剂“疲劳效应”外，还会引起菌种生长周期延长、孢子量减少、代谢减慢等，这对生产不利，在实际生产中多采用几种诱变剂复合处理、交叉使用的方法进行菌株诱变。复合诱变是指两种或多种诱变剂的先后使用、同一种诱变剂的重复作用、两种或多种诱变剂同时使用等诱变方法。普遍认为复合诱变具有协同效应，即诱变剂合理搭配使用较单一诱变效果更好。

2．诱变育种的影响因素

（1）诱变剂的种类：诱变剂的种类繁多，应根据实际情况，选用简便有效的诱变剂。诱变剂所处理的微生物一般要求呈悬浮液状态，细胞尽可能分散，有利于细胞均匀地接受诱变，便于随后培养形成单菌落。

（2）细胞核的结构：诱变剂所处理的细胞中的细胞核（或核质体）越少越好，最好是处理单核细胞。

（3）微生物的生长期：微生物的生理状态对于诱变的效果也有影响，一般对数期的细菌对于诱变剂的处理最敏感。用抗缬氨酸突变为指标，曾经测得大肠杆菌在对数期中所诱发的突变，比在停滞期高出4～10倍。

（4）诱变剂的剂量：因为诱变剂往往也是杀菌剂，在接触低剂量诱变剂的细胞群体中，突变发生的频率较低，而高剂量的诱变剂可能造成大批细胞的死亡，不利于特定的筛选。在产量性状的诱变育种中，凡在提高诱变率的基础上，既能提高变异幅度，又能促使变异移向正变范围的剂量，就是合适的剂量。

（5）出发菌株：出发菌株就是用于育种的原始菌株，选用合适的出发菌株有利于提高育种效率。一般多用生产上正在使用、对诱变剂敏感的菌株。

3．高产菌株筛选

诱变育种的目的在于提高微生物的生产量，但对于产量性状的突变来讲，不能用选择性培养方法筛选。因为高产菌株和低产菌株在培养基上同样生长，也没有一种显示差别性的杀菌作用能区分高产菌株和低产菌株。

测定菌株的产量高低采用摇瓶培养，然后测定发酵液中产物的数量。如果把经诱变剂处理后出现的菌落逐一用上述方法进行产量测定，工作量很大。如果能找到产量和某些形态指标的关联，甚至设法创造两者间的相关性，则可以大大提高育种的工作效率。因此在诱变育种工作中应该利用菌落可以鉴别的特性进行初筛，例如在琼脂平板培养基上，通过观察和测定某突变菌菌落周围蛋白酶水解圈、淀粉酶变色圈、色氨酸显色圈、柠檬酸变色圈、抗生素抑菌圈、纤维素酶对纤维素水解圈等的大小，估计该菌落菌株产量的高低，然后再进行摇瓶培养法测定实际的产量，可以大大提高工作效率。

上述这一类方法存在的缺陷是对于产量高的菌株，作用圈的直径和产量并不呈直线关系。为了克服这一难点，在抗生素生产菌株的育种工作中，可以采用耐药性的菌株作为指示菌，或者在菌落和指示菌中间加一层吸附剂吸去一部分抗生素。

一个菌落的产量愈高，它的产物必然扩散得也愈远。对于特别容易扩散的抗生素，即使产量不高，同一培养皿上各个菌落之间也会相互干扰，可以采用琼脂块法克服产物扩散所造成的困难。该方法是在菌落刚开始出现时就用打孔器连同一块琼脂打下，把许多小块放在空的培养皿中培养，待菌落长到合适大小时，把小块移到已含有供试菌种的一大块琼脂平板上，以分别测定各小块抑菌圈大小并判断其抗生素的效价。由于各琼脂块的大小一样，且该菌落的菌株所产生的抗生素都集中在琼脂块上，所以只要控制每一培养皿上的琼脂小块数和培养时间，或者再利用耐药性指示菌，就可以得到彼此不相干扰的抑菌圈。

（三）杂交育种

杂交育种是指两个不同基因型的菌株通过接合使遗传物质重新组合，从中分离和筛选具有新性状的菌株的方法。杂交育种往往可以消除某一菌株在诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象，因而是一种重要的育种手段。但杂交育种方法较复杂，许多工业微生物有性世代不十分清楚，故没有像诱变育种那样得到普遍推广和使用。

1．杂交育种的目的

（1）通过杂交育种使不同菌株的遗传物质进行交换和重新组合，从而改变原有菌株的遗传物质基础，获得杂种菌株（重组体）。

（2）通过杂交把不同菌株的优良性状汇集重组体菌株中，提高产量和质量，甚至改变菌种特性，获得新的品种。

（3）获得的重组体可能对诱变剂敏感性提高，便于重新使用诱变方法进行选育。

2．杂交育种的过程

（1）菌种准备　杂交育种中使用原始亲本和直接亲本两种菌株。原始亲本菌株是用来进行杂交的野生型菌株，可以是不同系谱的，也可以是相同系谱但代数相差较多的，主要是遗传基础差别要大，这样重组后的变异性也大；另外，菌种特性必须清楚，遗传标记明显，要具有生产上需要的特性，如高产、孢子丰富、代谢速度快、发酵液后处理容易等，两菌株的优点能互相补充，亲本菌株要有较广泛的适应性。所谓直接亲本菌株是直接用于进行配对的菌株，一般由原始亲本经诱变剂处理得到。直接亲本菌株要有遗传标记，常用的标记有营养、形态、抗性、敏感性、产量、酶活力等，用得最多的是经诱变得到的营养缺陷型。

（2）营养缺陷型的筛选　它的诱变处理和一般处理基本相同。在经处理的群体中往往野生型占多数，因此必须设法把野生型淘汰，使缺陷型浓缩以便于检出。浓缩方法有青霉素法、菌丝过滤法、差别杀菌法、饥饿法等。

① 青霉素法　青霉素能杀死细菌，是因为它能抑制细菌合成细胞壁。在含有青霉素的基本培养基中，野生型细菌细胞中的蛋白质等物质继续在合成增长，可是细胞壁却不再增大，造成细菌破裂死亡，而缺陷型细菌在基本培养基中不生长，不被杀死，这便是用青霉素法淘汰野生型的原理。

② 菌丝过滤法　野生型霉菌或放线菌的孢子能在基本培养液中萌发并长成菌丝，缺陷型的孢子一般不能萌发，或者虽能萌发却不能长成菌丝。所以把经诱变剂处理的孢子悬浮在基本培养液中，振荡培养若干小时后滤去菌丝，缺陷型孢子便得以浓缩。振荡培养和过滤应重复几次，每次培养时间不宜过长，这样才能达到充分浓缩的效果。

③ 差别杀菌法　细菌的芽孢远较营养体耐热。经诱变剂处理的细菌形成芽孢，把芽孢在基本培养液中培养一段时间，然后加热（例如80℃、15min）杀死营养体。由于野生型芽孢能萌发所以被杀死，缺陷型芽孢不能萌发所以不被杀死而得到浓缩。

酵母菌和子囊菌的孢子虽然不像细菌芽孢那样耐热，但是比起它们的营养体来也较为耐热，所以可用同样方法（例如58℃、4min）浓缩缺陷型。

④ 饥饿法　微生物的某些缺陷型菌株在某些培养条件下会自行死亡，可是如果在某一细胞中发生了另一营养缺陷型突变，这一细胞反而会避免死亡，从而被浓缩。比如，胸腺嘧啶缺陷型细菌在不给以胸腺嘧啶时短时间内细胞大量死亡，在残留下来的细菌中可以发现许多营养缺陷型。暂且不管这些突变是怎样发生的，但是只要发生了另一突变，它们往往就能避免死亡，便会积累起来。

（3）营养缺陷型的检出　营养缺陷型的检出可以采用逐个测定法、夹层培养法、限量补给法和影印培养法等。

① 逐个测定法　把经过浓缩的缺陷型菌液接种在完全培养基上，待长出菌落后将每一菌落分别接种在基本培养基和完全培养基上。凡是在基本培养基上不能生长而在完全培养基上能生长的菌落就是营养缺陷型。

② 夹层培养法　先在培养皿上倒上一层不含细菌的基本培养基，待冷凝以后加上一层含菌的基本培养基，冷凝以后再加上一层不含菌的基本培养基。经培养出现菌落后在培养皿底做上菌落标记，然后再加上一层完全培养基，再经培养以后出现的菌落多数是营养缺陷型。

③ 限量补给法　将经诱变剂处理的细菌接种在含有微量补充养料（例如0.01%蛋白胨）的基本培养基上，野生型迅速生长为较大的菌落，缺陷型则较慢地生长为较小的菌落。

④ 影印培养法　将经处理的细菌涂在完全培养基的表面，待出现菌落以后用灭菌丝绒布将菌落影印接种到基本培养基表面。待菌落出现以后比较两个培养皿，凡在完全培养基上出现菌落而在基本培养基上的同一位置上不出现菌落者，便可以初步断定是一个缺陷型。

以上这些方法都可以应用在微生物营养缺陷型的检出中，不过具体方法应随着研究的对象不同而改变。

（4）营养缺陷型的鉴定　营养缺陷型的鉴定方法可以分为2类：一类方法是在同一培养皿上测定一个缺陷型对于多种化合物的需要情况；另一类方法是在同一培养皿上测定许多缺陷型对于同一化合物的需要情况。方法是把待测微生物（10⁷～10⁸CFU/mL）悬液0.1mL加入到基本培养基平皿中混合，待冷凝后在标定的位置上放置少量氨基酸、碱基等结晶或粉末（滤纸片法也可），经培养就可以看到在缺陷型所需要的营养物的周围出现生长圈，说明此菌就是该营养物的缺陷新突变株。

用类似方法可测定双重或多重营养缺陷型。测定需要2种甚至3种化合物的缺陷型菌株，可以使每一培养皿中缺少一种化合物，当一个缺陷型菌株在缺A培养基上不能生长，而在缺B、C等培养基上都能生长，可以知道它需要化合物A；如果它在缺A培养基和缺B培养基上都不能生长，而在其他培养基上都能生长，可以知道它需要化合物A和B。此外，可以采用影印接种方法来代替多次重复接种。

3．杂交育种使用的培养基

杂交育种使用的培养基常见有：完全培养基、基本培养基、有限培养基和补充培养基4种。

（1）完全培养基 　一种含有糖类、多种氨基酸、维生素、核酸碱基及无机盐等比较完全的营养物质，野生型和营养缺陷型菌株均可生长。

（2）基本培养基　只含纯的碳源、无机氮和无机盐类，不含有氨基酸、维生素、核苷酸等有机营养物，营养缺陷型菌株不能在其上生长，只允许野生型生长。这种培养基要求严格，所用器皿必须用洗液浸泡过，用蒸馏水冲净，琼脂也必须事先洗净。

（3）有限培养基　在基本培养基或蒸馏水中含有完全培养基成分。

（4）补充培养基（鉴别培养基）　在基本培养基中加入已知成分的氨基酸、维生素、核苷酸等。本培养基通常是在鉴别营养缺陷型的类型时使用。

在考察所选出的杂交株的生产性能时，应该用生产试验中使用的种子和发酵用培养基。

4．杂交育种的方法

（1）细菌杂交　将两个具有不同营养缺陷型、不能在基本培养基上生长的菌株，以10⁵CFU/mL的浓度在基本培养基中混合培养，结果可以有少量菌落生长，这些菌落就是杂交菌株。细菌杂交还可通过F因子转移、转化和转导等方式发生基因重组。

（2）放线菌的杂交育种　放线菌杂交是在细菌杂交基础上建立起来的，虽然放线菌也是原核生物，但它有菌丝和孢子，其基因重组方式近似于细菌，育种方法与霉菌有许多相似之处。

（3）霉菌的杂交育种　不产生有性孢子的霉菌是通过准性生殖进行杂交育种的。准性生殖是真菌中不通过有性生殖的基因重组过程。准性生殖包括3个相互联系的阶段：异核体形成、杂合二倍体的形成和体细胞重组（即杂合二倍体在繁殖过程中染色体发生交换和染色体单倍化，从而形成各种分离子）。准性生殖具有和有性生殖类似的遗传现象，如核融合，形成杂合二倍体，接着是染色体分离，同源染色体间进行交换，出现重组体等。

霉菌的杂交通过4步完成：选择直接亲本、形成异核体、检出二倍体和检出分离子。

① 选择直接亲本　两个用于杂交的野生型菌株即原始亲本，经过人工诱变得到的用于形成异核体的亲本菌株称为直接亲本，直接亲本有多种遗传标记，在杂交育种中用得最多的是营养缺陷型菌株。

② 形成异核体　把两个营养缺陷型直接亲本接种在基本培养基上，强迫其互补营养，使其菌丝细胞间吻合形成异核体。此外还有液体完全培养基混合培养法、固体完全培养基混合培养法、液体有限培养基混合培养法、有限培养基异核丛形成法等。

③ 检出二倍体　一般有3种方法：一是将菌落表面有野生型颜色的斑点和扇面的孢子挑出进行分离纯化；二是将异核体菌丝打碎，在完全培养基和基本培养基上进行培养，出现异核体菌落，将具有野生型的斑点或扇面的孢子或菌丝挑出，进行分离纯化；三是将大量异核体孢子接于基本培养基平板上，将长出的野生型原养型菌落挑出分离纯化。

④ 检出分离子　将杂合二倍体的孢子制成孢子悬液，在完全培养基平板上分离成单孢子菌落，在一些菌落表面会出现斑点或扇面，每个菌落接出一个斑点或扇面的孢子于完全培养基的斜面上，经培养纯化，鉴别而得到分离子。也可用完全培养基加重组剂对氟苯丙氨或吖啶黄类物质制成选择性培养基，进行分离子的鉴别检出。

（四）原生质体融合育种

原生质体融合就是通过酶解作用将两个亲株的细胞壁去除，在高渗条件下释放出只有原生质膜包被着的球状原生质体，然后将两个亲株的原生质体在高渗条件下混合，加入融合促进剂聚乙二醇（化学）、仙台病毒（生物）或电融合等助融，使它们相互凝集。通过细胞质融合，促使两套基因组之间的接触、交换、遗传重组，在适宜条件下使细胞壁再生，在再生的细胞中获得重组体。

1．原生质体融合技术的特点

（1）重组频率较高　由于没有细胞壁的阻碍，且在原生质体融合时又加入融合促进剂，所以微生物的原生质体间的杂交频率明显高于常规的杂交方法，如霉菌和放线菌的融合频率为10^－3～10^－1，细菌、酵母菌融合频率也达10^－6～10^－3；天蓝色链霉菌的种内重组率可达20%。

（2）受接合型或致育性的限制较小　两亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因而有利于不同属间微生物的杂交。另外，原生质体融合是和性无关的杂交，所以受接合型或致育性的限制比较小。

（3）重组体种类较多　由于原生质体融合后，两个亲株的整个基因组之间发生相互接触，有机会发生多次交换，产生各种各样的基因组而得到多种类型的重组子；参与融合的亲株不限于两株，这是常规杂交达不到的。

（4）遗传物质的传递更为完整　由于原生质体的融合是两个亲株的细胞质和细胞核进行类似合二为一的过程，因此，遗传物质的交换更为完整。原核生物中可以得到将两个或更多个完整的基因组携带到一起的融合产物，放线菌中能形成短暂的或稳定的杂合二倍体或四倍体等多倍体。

虽然各类参与食品发酵的微生物的形态与结构不同、遗传特性各异，生理代谢类型差异也较大，但制备原生质体，并对其进行融合的程序有类似之处，原生质体融合的关键步骤也基本一致。微生物原生质体融合技术的基本程序包括：原生质体的制备与形成、原生质体融合与融合子形成、原生质体或融合子再生、正变融合子的筛选与保藏。

2．微生物原生质体融合育种的过程

（1）标记菌株的筛选　原生质体融合过程中，两个亲本菌株需要带有遗传标记，以便于筛选，而且两亲本株应带有不同的遗传标记，以便筛选融合子。常用的遗传标记有营养缺陷型、耐药性和形态特征等，标记必须稳定。不同目的选用标记不同，如以提高抗生素产量为目的的融合试验，用营养缺陷型就不理想，而用耐药性标记就比较好。一般诱变的方法可获得遗传标记，但诱变同时会影响到菌株的生产性能。因此，在选择标记时最好选取菌株本身原有的各种遗传标记，如营养缺陷、耐药、利用某些物质、产生某些产物、菌落特征、细胞形态、培养条件等。

（2）原生质体的制备　在制备原生质体时主要是通过酶解去除细胞壁，根据不同微生物细胞壁的化学组分不同，选用不同的酶处理。细菌和放线菌制备原生质体主要采用溶菌酶；制备酵母菌原生质体，一般采用蜗牛酶；制备丝状真菌原生质体时可用蜗牛酶和纤维素酶，对丝状真菌一般采用两种或三种酶混合进行处理才能收到好的效果。

（3）原生质体的再生试验　在进行原生质体融合前，需要对制备好的原生质体进行再生试验，测定其再生率，以判别亲本菌株的融合频率和再生频率，并可作为检查、改善原生质体再生条件，分析融合试验结果，改善融合条件的重要指标。

（4）原生质体的融合　为了使融合频率大幅度提高，必须加入表面活性剂聚乙二醇（PEG，又称为融合促进剂）。PEG具有强制性地促进原生质体融合的作用，同时还起到稳定作用。作为微生物原生质体促融剂的PEG合适分子量为100～6000，尤其是4000和6000，其中在链霉菌原生质体融合时，采用分子量为1000的PEG，其浓度为40%～60%，低于40%时融合率较低；霉菌和细菌原生质体融合时用分子量为4000或6000的PEG，其浓度细菌为40%，霉菌为30%。在原生质体融合中除加PEG外，加钙离子、镁离子等阳离子也有促进融合作用，见图1-1。

（5）融合子的选择　原生质体经过融合得到的融合细胞出现两种情况：一种是真正的融合，产生杂合二倍体（融合后的二倍体细胞分裂而不分离，分裂后的细胞仍保持二倍体状态）或单倍重组体；第二种情况是暂时的融合，形成异核体。如何将真正的融合子从众多的细胞中选择出来，进一步做人工筛选，以得到所需要的变异菌株，这是极其重要的。根据微生物种类不同，其选择方法也不同。

（6）优良菌株的筛选　微生物原生质体融合实际是一种基因重组技术，它具有定向育种的含义，但原生质体经融合后所产生的融合子类型是多样性的，其性状和生产性能也不一样，因此，对得到的融合子仍要通过常规的人工筛选方法，把优良菌株筛选出来。

3．影响原生质体融合的因素

影响原生质体融合率的因素有很多，除了影响原生质体制备与原生质体再生的因素均与融合率有关以外，原生质体融合的聚合剂种类、剂量、型号以及融合处理的条件（如渗透压、离子种类和浓度、pH、温度、时间）等，都会直接影响到原生质体的融合率。

（1）培养基成分　培养基成分的改变直接或间接地影响着细胞壁的状况，对原生质体的释放量也有显著影响。因此，选择适合的培养基成分是十分必要的。

（2）溶壁酶　用酶法破壁制备原生质体，酶的作用是关键。不同种类真菌的细胞壁成分和结构是不同的，鞭毛菌亚门是以纤维素和β-葡聚糖为主要成分；接合菌亚门是以脱乙酰几丁质为主要成分；子囊菌亚门（半子囊菌除外）和担子菌亚门则以几丁质、β-葡聚糖为主要成分。同一种真菌的不同发育时期或不同菌态的细胞壁成分不同。因此分离原生质体时，不同的真菌、同一种真菌的不同发育时期、不同培养方式，对溶壁酶的种类和浓度要求不同。

（3）渗透压稳定剂　渗透压稳定剂对原生质体的形成之所以重要，是因为其在菌丝与酶这样一个反应系统中起着一种媒介物的作用。首先，渗透压稳定剂的浓度是维持和控制原生质体数量的重要因素。它使菌丝细胞内外压力一致，使菌丝细胞保持生理状况的稳定，原生质体完整地释放出来，且保持原生质体不破裂也不收缩。其次，渗透压稳定剂的性质影响着裂解酶的反应活性。不同的裂解酶需要不同性质的渗透压稳定剂才能得到最佳的效果。例如分离台湾根霉原生质体时以糖醇为渗透压稳定剂，酶解初期有原生质体释放，而3～4h后菌丝在酶液中生长起来，可见糖醇大大降低或是抑制了酶的反应活性，促使了菌丝生长。而以KCl或NaCl为渗透压稳定剂，则可能有助于酶与底物的结合，对酶反应起促进作用。

（4）菌龄　菌丝体生理状况是决定原生质体产量的主要因素，而菌丝体的生理状况又受菌龄和培养基成分的影响。菌丝体的菌龄对原生质体释放的影响主要由于壁的成分和结构的变化引起。菌龄短的菌丝体的壁成分相对简单，壁也相对薄些；随着菌龄增加，壁上沉积色素等次生物质，酶的作用相对困难些，壁难以被溶解。但菌龄过短，又会造成菌丝量不足，或影响原生质体的再生。不同种类的真菌对酶解时最佳菌龄是不同的，研究报道产生大量原生质体的关键是获得足够的对数早期和中期的菌丝体。

（五）基因工程育种

基因工程育种是指利用基因工程方法对生产菌株进行改造而获得高产菌株，或者是通过微生物间的转基因而获得新菌种的育种方法。通过体外DNA重组和转移等技术，对原物种进行定向改造，获得对人类有用的新性状，大大缩短了育种时间。

1．基因工程育种的过程

重组DNA技术一般包括4步，即目的基因的获得、与载体DNA分子的连接、重组DNA分子引入宿主细胞及从中筛选出含有所需重组DNA分子的宿主细胞。作为发酵工业的工程菌株在此基础上再加上外源基因的表达及稳定性的考虑。

2．基因工程育种的关键步骤

（1）获取目的基因　获取目的基因是实施基因工程的第一步，主要有两条途径：一条是从供体细胞的DNA中直接分离基因；另一条是人工合成基因。

直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。该方法是用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段，再将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让这些外源DNA的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制（也称扩增），从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的DNA片段分离出来。用鸟枪法获得目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性。

对于含有不表达的DNA片段的真核细胞基因，一般使用人工合成的方法。目前人工合成基因的方法主要有两条途径：一条途径是以目的基因转录成的mRNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需要的基因；另一条途径是根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对的原则，推测出它的基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。如人的血红蛋白基因、胰岛素基因等就是通过人工合成基因的方法获得。

（2）基因表达载体的构建（即目的基因与运载体结合）　基因表达载体的构建即为目的基因与运载体结合，是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。将目的基因与运载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。如果以质粒作为运载体，首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。然后用同一种限制酶切割目的基因，使其产生相同的黏性末端。将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，质粒的黏性末端与目的基因DNA片段的黏性末端就会因碱基互补配对而结合，形成一个重组DNA分子。如人的胰岛素基因就是通过这种方法与大肠杆菌中的质粒DNA分子结合，形成重组DNA分子（也叫重组质粒）的。

（3）将目的基因导入受体细胞　目的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步。目的基因的片段与运载体在生物体外连接形成重组DNA分子后，下一步是将重组DNA分子引入受体细胞中进行扩增。基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。用人工方法使体外重组的DNA分子转移到受体细胞，主要是借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。例如载体是质粒，受体细胞是细菌，一般是将细菌用氯化钙处理，以增大细菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。目的基因导入受体细胞后，就可以随着受体细胞的繁殖而复制，由于细菌的繁殖速度非常快，在很短的时间内就能够获得大量的目的基因。

（4）检测并鉴定　目的基因导入受体细胞后，是否可以维持稳定并表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道，这是实施基因工程的第四步。在全部的受体细胞中真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞是很少的，因此必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。检测的方法有很多种，例如大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因，当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。重组DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。

通过基因工程方法获得的工程菌包括氨基酸类、工业用酶制剂（脂肪酶、纤维素酶、乙酰乳酸脱羧酶及淀粉酶等）以及头孢菌素C等。工程菌的出现大幅度提高了生产能力，改造了传统发酵工艺，如与氧传递有关的血红蛋白基因克隆到远青链霉菌，降低了对氧的敏感性，在通气不足时，其目的产物放线红菌素产量可提高4倍。

（六）基因组改组

20世纪90年代，美国Maxgen公司Cardayr等提出了基因组改组（genome shuffling）的概念。基因组改组技术（也称为基因组重排技术）是微生物育种的新技术，基因组改组在首轮改组之前，通过经典诱变技术获得初始突变株，然后将包含若干正突变的突变株作为第一轮原生质体融合的出发菌株，此后经过递推式的多轮融合，最终使引起正向突变的不同基因重组到同一个细胞株中。基因组改组技术的重组对象是整个基因组，可以同时在整个基因组的不同位点重组，将多个亲本的优良表型通过多轮的重组集中于同一株菌株，不必了解整个基因组的序列数据和代谢网的信息。与经典的诱变方法相比，基因组改组技术可以快速、高效地筛选出优良菌株，而且这些菌株集多种正突变于一体，因此在很大程度上弥补了经典诱变方法的缺陷。

基因组改组技术是经典微生物诱变育种技术与原生质体融合技术的有机结合，在微生物经典诱变的基础上，通过原生质体融合，使多个带有正突变的亲本杂交，产生新的复合子。具体方法如下：①利用传统诱变方法获得突变菌株库，并筛选出正向突变株；②以筛选出来的正向突变株作为出发菌株，利用原生质体融合技术进行多轮递推原生质体融合；③最终从获得的突变体库中筛选出性状优良的目的菌株。

例如，R.J.Patnaik等（2002）将基因组改组应用于乳酸生产菌Lactobacillus的低pH耐受性菌种的筛选，通过5轮基因组改组得到在pH 3.8的酸性环境下生长良好的菌株，提高了乳杆菌的耐酸性能，在pH 4.0的条件下该菌株的乳酸产量比野生型菌株提高了3倍，这对乳酸的大规模工业生产具有重要的意义。

基因组改组技术不是对微生物基因进行人工改造，而是利用原有基因进行重组。这是在传统育种、原生质体融合的基础上对微生物育种技术的一次革命性的创新。基因组改组技术不需对微生物的遗传特性完全掌握，只需了解微生物遗传性状就实现了微生物的定向育种，获得了大幅度正突变的菌株，成为发酵工程中的一种安全有效的育种工具。

（七）代谢控制育种

代谢控制育种兴起于20世纪50年代末，以1957年谷氨酸代谢控制发酵成功为标志，并促使发酵工业进入代谢控制发酵时期。近年来代谢工程取得了迅猛发展，尤其是基因组学、应用分子生物学和分析技术的发展，使得导入定向改造的基因及随后在细胞水平上分析导入外源基因后的结果成为可能。快速代谢控制育种的活力在于以诱变育种为基础，获得各种解除或绕过微生物正常代谢途径的突变株，从而为有用产物选择性地大量生成积累，打破了微生物调节这一障碍。

代谢控制育种在工业上应用非常广泛。Tsuchida等采用亚硝基胍诱变等方法处理乳糖发酵短杆菌2256，最终选出一株L-亮氨酸高产菌，可在13%葡萄糖培养基中积累L-亮氨酸至34g/L。代谢控制育种提供了大量工业发酵生产菌种，使得氨基酸、核苷酸、抗生素等次级代谢产物产量成倍地提高，大大促进了相关产业的发展。

二、发酵食品微生物菌种的衰退

菌种退化是指群体中退化细胞在数量上占一定数值后，表现出菌种生产性能下降的现象。在形态上常表现为分生孢子减少或颜色改变，甚至变形，如放线菌和霉菌在斜面上经多次传代后产生了“光秃”型，从而造成生产上用孢子接种的困难；在生理上常指产量的下降，如乳酸菌发酵性能的退化、黑曲霉的糖化能力衰退、抗生素生产菌的抗生素发酵单位下降等。

1．菌种衰退原因

菌种衰退不是突然发生的，而是从量变到质变的逐步演变过程。开始时，在群体细胞中仅有个别细胞发生自发突变（一般均为负变），不会使群体菌株性能发生改变。经过连续传代，群体中的负变个体达到一定数量，发展成为优势群体，从而使整个群体表现为严重的衰退。导致这一现象的原因有以下几方面。

（1）基因突变导致菌种衰退　菌种衰退的主要原因是有关基因的负突变。如果控制产量的基因发生负突变，则表现为产量下降；如果控制孢子生成的基因发生负突变，则产生孢子的能力下降。

（2）表型延迟造成菌种衰退　表型延迟现象也会造成菌种衰退。如在诱变育种过程中，经常会发现某菌株初筛时产量较高，进行复筛时产量却下降了。

（3）质粒脱落导致菌种衰退　质粒脱落导致菌种衰退的情况在抗生素生产中较多，不少抗生素的合成是受质粒控制的。当菌株细胞由于自发突变或外界条件影响（如高温），致使控制产量的质粒脱落或者核内DNA和质粒复制不一致，即DNA复制速度超过质粒。经多次传代后，某些细胞中就不具有对产量起决定作用的质粒，这类细胞数量不断提高达到优势，则菌种表现为衰退。

2．影响菌种衰退的因素

（1）连续传代 连续传代是加速菌种衰退的一个重要原因。有数据显示在DNA的复制过程中，碱基发生错配的概率低于5×10^－1，菌种在移种传代过程中发生自发突变，由于微生物具有极高的代谢繁殖能力，随着传代次数增加，衰退细胞的数目就会不断增加，在数量上逐渐占优势，致使群体表型出现衰退，最终成为一株衰退了的菌株。

（2）不适宜的培养和保藏条件 不适宜的培养和保藏条件是加速菌种衰退的另一个重要原因。不良的培养条件（如营养成分、温度、湿度、pH、通气量等）和保藏条件（如营养、含水量、温度、氧气等）不仅会诱发衰退型细胞的出现，还会促进衰退细胞迅速繁殖，在数量上大大超过正常细胞，造成菌种衰退。

3．菌种衰退的防止

根据菌种衰退原因的分析，可以制定出一些防治衰退的措施，主要从以下几方面考虑。

（1）创造良好的培养条件　创造一个适合原种的良好培养条件，可以防止菌种衰退。如培养营养缺陷型菌株时应保证适当的营养成分，尤其是生长因子；培养一些抗性菌时应添加一定浓度的药物于培养基中，使回复的敏感型菌株的生长受到抑制，而生产菌能正常生长；控制好碳源、氮源等培养基成分和pH、温度等培养条件，使之有利于正常菌株生长，限制退化菌株的数量，防止衰退。

（2）利用不易衰退的细胞移种传代　在放线菌和霉菌中，由于它们的菌丝细胞常含几个细胞核，甚至是异核体，因此用菌丝接种就会出现不纯和衰退，而孢子一般是单核的，用它接种时，就不会发生这种现象。在实践中，若用灭过菌的棉团对放线菌进行斜面移种，避免了菌丝的接入，因而达到了防止衰退的效果；另外，有些霉菌（如构巢曲霉）若用其分生孢子传代就易衰退，而改用子囊孢子移种则能避免衰退。

（3）采用有效的菌种保藏方法控制传代次数　尽量避免不必要的移种和传代，将必要的传代降低到最低限度，以减少发生突变的概率。不论在实验室还是在生产实践上，必须采用良好的菌种保藏方法，减少不必要的移种和传代次数。有效的菌种保藏方法是防止菌种衰退极其必要的措施。在实践中，有针对性地选择菌种保藏的方法。例如啤酒酿造中常用的酿酒酵母，保持其优良发酵性能最有效的保藏方法是－70℃低温保藏，其次是4℃低温保藏，若采用绝大多数微生物保藏效果很好的冷冻干燥保藏法和液氮保藏法，其效果并不理想。

一般斜面冰箱保藏法只适用于短期保藏，而需要长期保藏的菌种，应当采用砂土保藏法、冷冻干燥保藏法及液氮保藏法等方法。对于比较重要的菌种，尽可能采用多种保藏方法。

（4）利用菌种选育技术　在菌种选育时，应尽量使用单核细胞或孢子，并采用较高剂量使单链突变而使另一单链丧失作为模板的能力，避免表型延迟现象。同时，在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化，以保证菌种的纯度。

（5）定期进行分离纯化　定期对菌种进行分离纯化，挑选指标明显的特征菌落是有效防止菌种衰退的方法。

三、发酵食品微生物菌种的复壮

狭义的复壮是指在菌种已经发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。广义的复壮是指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状测定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。

由此可见，狭义的复壮是一种消极的措施，而广义的复壮是一种积极的措施，也是目前工业生产中积极提倡的措施。复壮的方法有纯种分离法、淘汰法和遗传育种法。

1．纯种分离法

通过纯种分离，可将衰退菌种细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来，经扩大培养，就可恢复原菌株的典型性状。常用的分离纯化方法归纳为两类：一类较粗放，只能达到“菌落纯”的水平，即从种的水平来说是纯的，例如采用稀释平板法、涂布平板法、平板划线法等方法获得单菌落；另一类是较精细的单细胞或单孢子分离方法，它可以达到“细胞纯”，即“菌株纯”的水平。后一类方法应用较广，种类很多，既有简单的利用培养皿或凹玻片等作为分离室的方法，也有利用复杂的显微操纵器的纯种分离方法。对于不长孢子的丝状菌，则可用无菌小刀切取菌落边缘的菌丝尖端进行分离移植，也可用无菌毛细管截取菌丝尖端单细胞进行纯种分离。

2．淘汰法

将衰退菌种进行一定的处理（如药物、低温、高温等），往往可以起到淘汰已衰退个体而达到复壮的目的。如将“5406”的分生孢子在低温（－30～－10℃）下处理5～7d，使其死亡率达到80%，结果发现在抗低温的存活个体中留下了未退化的健壮个体。

3．遗传育种法

遗传育种法是把退化的菌种重新进行遗传育种，从中选出高产、不易退化、稳定性较好的生产菌种。

进行复壮前应仔细分析和判断一下自己的菌种究竟是发生了衰退，还是仅属一般性的表型变化（饰变）或只是杂菌的污染。只有对症下药，才能使复壮工作奏效。

四、发酵食品微生物菌种的保藏

微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚至死亡，因而常常造成菌种的衰退，并有可能使优良菌种丢失。菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不被污染，以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要。

首先，挑选典型菌种的优良纯菌株来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如孢子、芽孢等。其次，应根据微生物生理、生化特点，人为地破坏生长条件，使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。生长条件是干燥、低温和缺氧，另外，避光、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂。

菌种的保藏方法多样。生产中常用的保藏方法有斜面低温保藏法、悬液保藏法、寄主保藏法、石蜡油封藏法、砂土管保藏法、麸皮保藏法、冷冻干燥保藏法、液氮超低温保藏法等。实验室中最常用的几种菌种保藏方法见表1-1。

菌种是一种资源，为了使分离到的可以用于科研、教学和生产的菌种能够妥善保存下来，便于互相交流和充分利用这些资源，以及避免不必要的混乱，国内外都成立了相应的机构，负责菌种的保存和管理，特别是对一些标准的模式菌种的保存。

在各机构保藏的菌种中，第一类是模式菌种即标准菌种，第二类是用于教学科研的普通菌种，第三类是生产应用菌种。根据需要向有关机构索购，保藏机构在寄售菌种时附送说明中包括该菌种较适合的培养基、培养条件等。

五、发酵食品微生物菌种的扩大培养

（一）菌种扩大培养的目的和任务

菌种扩大培养是将保存的菌种接入试管斜面或液体培养基中活化后，经过三角瓶（茄形瓶）液体摇床培养（或固体培养）以及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种的过程。这些纯种培养物又称种子。菌种扩大培养的目的是为每次发酵的投料提供相当数量、代谢旺盛的种子。

（二）菌种扩大培养的类型和方法

按照不同的划分标准，食品发酵菌种的培养可分为以下几种基本方法。

1．静止培养和通气培养

根据菌种对氧的要求，可分为静止培养和通气培养。静止培养又称嫌氧培养或厌氧培养，是指将发酵菌种接种于含有培养基的培养容器中，进行不通气培养的方法。该方法适用于厌氧微生物的培养，如双歧杆菌发酵、乳酸发酵、丙酮-丁醇发酵的菌种培养。通气培养又称好气（氧）培养，是指发酵过程中进行人工通气。

2．固体培养和液体培养

根据培养基的性质，可分为固体培养和液体培养。固体培养又称曲法培养，是指发酵菌种接种于固体培养基中进行培养的方法，如酿酒、制醋中各种曲的培养，酱油酿造和食用菌生产中的菌种培养。液体培养系指将发酵菌种接种于液体培养基中进行培养的方法，这是发酵工业中菌种培养的主要方法。

3．浅层培养和深层培养

根据培养基的厚度，可分为浅层培养和深层培养。浅层培养又称表面培养，是指在三角瓶、茄形瓶、克氏瓶、蘑菇瓶、瓷盘或曲盘（盒）中进行液体或固体培养的方法，其料液厚度一般小于3cm。浅层培养适用于需氧型发酵培养。一般来说，实验室一级种子常采用浅层培养。深层培养是指在种子罐、发酵罐或曲池中进行液体或固体培养的方法。料液层较厚，一般来说，生产现场的二级种子、三级种子及发酵罐种子常采用深层培养。

（三）扩大培养对菌种的要求

微生物广泛分布于土壤、水和空气等自然界中，资源非常丰富。作为大规模生产的微生物工业菌种，应尽可能满足下列要求：菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐或曲池后能迅速生长，延缓期短；生理性状稳定；菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐或曲池的要求；无杂菌污染；保持稳定的生产能力；菌种不是病原菌，在培养和发酵过程中不产生任何有害物质和毒素，以保证食品安全。

（四）扩大培养级数的确定

1．一般工艺流程

食品发酵菌种扩大培养过程可分为实验室和生产车间种子制备两个阶段。其一般工艺流程如图1-2所示。

2．食品发酵菌种扩大培养

（1）实验室种子制备　保藏的菌种经无菌操作接入适合于孢子发芽或营养体生长的斜面培养基中，经培养成熟后挑选菌苔正常的孢子或营养体再一次接入试管斜面，反复培养几次，这一阶段也称菌种活化。活化的目的是使贮藏的菌种达到正常稳定的生长代谢速度。斜面活化的菌种进一步扩大培养，根据菌种特性不同可采用不同的培养方法。

① 细菌和放线菌　常见的细菌斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。培养温度为37℃，时间为1～2d，产芽孢的细菌培养则需要5～10d。放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。培养温度一般为28℃，培养时间为5～7d。

② 霉菌　霉菌为好氧微生物，实验室培养时多采用浅层固态培养，孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。培养温度一般为25～28℃，培养时间一般为5～7d。

③ 酵母菌　酵母菌为兼性厌氧性微生物，对氧的要求不甚严格，易在糖基培养基上生长繁殖。培养温度为20～30℃，时间为1～2d。

（2）生产车间种子制备　实验室制备的孢子或液体种子移种至种子罐或盘（盒）扩大培养，种子罐或盘（盒）的作用在于使实验室制备的有限数量的菌种营养体或孢子发芽、生长并繁殖成足够量的营养体或孢子，接入发酵罐或发酵曲池培养基后能迅速生长，达到一定菌体量，以利于产物的合成。

种子罐级数的确定及扩大培养：种子罐级数是指制备种子需逐级扩大培养的次数。种子罐种子制备的工艺过程因菌种不同而异，一般可分为一级种子、二级种子和三级种子。采用茄形瓶孢子、营养体或摇瓶种子接入体积较小的种子罐培养得到的种子称为一级种子；将一级种子接入体积较大的种子罐内，经培养得到的种子称为二级种子；将二级种子接入发酵罐内发酵，称为三级发酵，得到的种子称为三级种子。同理，使用三级种子的发酵称为四级发酵。

① 细菌种子罐级数及扩大培养　对于细菌种子的培养，由于细菌生长快，种子用量比例少，级数也较少，一般常采用二级发酵。其制备过程为茄形瓶→种子罐→发酵罐。

② 霉菌种子罐级数及扩大培养　由于霉菌生长缓慢，种子制备需要较长的时间，因此，常采用三级发酵。其制备过程为孢子悬浮液→一级种子罐（27℃，40h孢子发芽，产生菌丝）→二级种子罐（27℃，10～24h，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）→发酵罐。

③ 放线菌种子罐级数及扩大培养　放线菌菌体生长很慢，所以常采用四级发酵。

④ 酵母种子罐级数及扩大培养　由于酵母的生长速度比细菌慢，但比霉菌、放线菌快，所以，通常直接使用一级种子。

（五）扩大培养影响种子质量的主要因素

菌种扩大培养的关键就是种子罐或曲池的扩大培养，影响种子罐或曲池培养的主要因素包括营养条件、培养条件、染菌的控制、扩大级数和接种量控制等。

1．培养基

培养基对微生物生长繁殖、酶的活性与产量都有直接的影响。不同微生物对营养的要求不一样，但它们所需要的基本营养大体是一致的，其中以碳源、氮源、无机盐、生长素和无机盐等最为重要。不同类型的微生物所需要的培养基成分与浓度配比并不完全相同，必须按照实际情况加以选择。

2．种龄与接种量

种子培养期应选取菌种的对数生长期。种龄过短或过长，不但会延长发酵周期，而且会降低产量。因此，对种子的种龄必须严格掌控。接种量直接影响发酵周期。大量接入成熟的菌种，可以缩短生长过程的延缓期，缩短发酵周期，有利于降低染菌的概率。因此，一般都将菌种扩大培养，进行二级发酵或三级发酵。

3．温度

大多数微生物的最适生长温度为25～37℃，细菌的最适生长温度大多比霉菌高些。如果所培养的微生物能承受稍高一些的温度进行生长、繁殖，则可降低染菌的概率，减少夏季培养所需的降温辅助设备，对工业生产有很大好处。

4. pH

各种微生物都有自己生成合成酶的最适pH。同一菌种合成酶的类型与酶系组成可随pH的改变而产生不同程度的变化，培养基pH在发酵过程中能被菌体代谢所改变，阴离子（醋酸根、磷酸根）被吸收或氮源被利用后产生NH，使pH上升；阳离子（Na^＋、K^＋）被吸收或有机酸的积累，使pH下降。一般来说，高碳源培养基倾向于酸性pH转移，高氮源培养基倾向于碱性pH转移，这都与碳氮比直接相关。

5．通气和搅拌

需氧菌或兼性需氧菌的生长与合成酶都需要供给氧气。不同微生物要求的通气量不同，即使是同一菌种，在不同生理时期对通气量的要求也不相同。因此，在控制通气条件时，必须考虑到既能满足菌种生长与合成酶的不同要求，又能降低电耗，以提高经济效益。通气量最好按氧溶解的量确定。一般来说，培养罐深、搅拌转速大、通气管开孔小或多，气泡在培养液内停留时间就长，氧的溶解速度也就大，且在这些因素确定的条件下，培养基的黏度越小，氧的溶解速度就越大。因此，根据罐的结构和培养液的黏度，增减通气量，使溶解氧达到菌体所需的浓度，满足菌体呼吸的需要。

6．泡沫

菌种培养过程中产生的泡沫与微生物的生长和酶合成有关。泡沫的持久存在影响微生物对氧的吸收，阻碍CO₂的排除，不利于发酵。此外，由于泡沫大量地产生，导致培养液的体积一般只占种子罐容量的一半左右，大大影响设备的利用率，甚至发生跑料现象，导致染菌，增加损失。

微生物工业目前使用的消泡剂有各种天然的动植物油以及来自石油化工生产的矿物油、改性油、表面活性剂等，这类消泡剂往往因培养液的pH、温度、成分、离子浓度以及表面性质的改变，在消泡能力上出现很大的差别，且在培养液内残留量也高，给净化处理造成一定的困难。而新型的有机硅聚合物（如硅油、聚硅氧烷树脂等），则具有效率高、用量省、无毒性、无代谢性、可提高微生物合成酶的效率等优良特性。

7．染菌的控制

染菌是微生物发酵生产的大敌，一旦发现染菌，应及时进行处理，以免造成更大的损失。染菌的原因，除设备本身结构存在“死角”外，还包括设备、管道、阀门漏损或灭菌不彻底，空气净化不好，无菌操作不严或菌种不纯等。要控制染菌继续发展，必须及时找出染菌的原因，采取措施，杜绝染菌事故再现。

（六）各类食品发酵菌种的扩大培养

各类食品发酵菌种的扩大培养包括了常见的细菌类、酵母菌类、霉菌类发酵菌种的扩大培养以及传统曲（大曲、小曲、红曲）的制造，获得满足各类发酵食品生产使用的“种子”。另外，“种子”也有直投式的干燥菌剂或孢子粉，按一定比例（一般接种量为千分之几至万分之几）添加于发酵培养基中，进行发酵食品生产，如应用广泛的直投式发酵乳酸菌剂（酸奶、泡菜等）、活性干酵母（白酒、面包等）、曲精（酱油等）。具体各类食品发酵菌种的扩大培养参见各类发酵食品生产。

思考题

1．简述发酵工业常用微生物种类。

2．什么因素导致菌种衰退？菌种复壮的方法有哪些？如何保藏发酵菌种？

3．简述食品发酵菌种的育种方法。

4．论述食品发酵菌种发酵剂的制备。