第三节 水生植物茎叶微界面附植生物研究概述
“界面”这一术语最早起源于物理学，是指密切接触的两相之间的过渡区。界面现象在自然界中普遍存在，通常有液-气、液-固、液-液、固-气、固-液等界面。至今，就界面问题开展的研究工作几乎是各个领域的前沿研究内容（李文华等，2004）。国内先后由汤鸿霄和曲久辉提出环境微界面的概念并加以发展，提出环境微界面是在相对微观的环境中，对物质交换、转移、转化、反应、暴露等具有影响的非均相介质间的微观界面，它是各主要环境要素的基本特征和联系不同环境介质的桥梁（汤鸿霄，2003；曲久辉等，2008），研究环境微界面过程对于控制污染物的迁移转化具有重要的环境意义和科学意义（钱宝等，2013）。
水生态系统中主要存在水-气微界面、水-沉积物微界面、生物-沉积物（根际圈）微界面和生物-水微界面（如水生植物表面与水之间）4个微界面。微界面存在相互分异又密切联系的氧化-还原异质环境，往往是有机物降解、物质循环及生命活动最强烈的场所，发生着剧烈的交换、降解、转化和沉积等过程（Risgaard-Petersen，Jensen，1997）。水-沉积物微界面的研究已经取得了长足进展（Jorgensen，DesMarais，1990；Cai，Reimers，1993；Lansard et al，2003；Xu et al，2009；王永平等，2013），研究表明，在水-沉积物界面，氧（O2）、pH值、氧化还原电位（ORP）等因子时空变化较大，物质的迁移转化过程活跃，尤其是反硝化作用十分剧烈（Gardner，McCarthy，2009；Strauss et al，2009；Trimmer et al，2013；VanZomeren et al，2013）。
生物-水微界面广泛存在于各种生物表面，而在浅水湖泊生态系统中，沉水植物-水微界面占据着湖泊生态系统的重要界面，具有重要的生态作用，对湖泊生产力及生物地球化学循环具有重要的影响（Carpenter，1980；Pakdel et al，2013；Pomazkina et al，2012）。研究表明，在富营养化水体中，沉水植物茎叶表面附着有各种碎屑、泥沙、菌胶团、藻类等，形成了特殊的生物-水微界面（Sand-Jensen，1989；Stevens，Hurd，1997；董彬等，2013；何聃等，2014）。该微界面密集的附着物是植物和周围水体间可溶性物质运输的屏障，且对沉水植物有遮阴和资源竞争作用，降低了沉水植物的光合作用，影响了沉水植物的生长发育，加速沉水植物退化甚至消失（Sand-Jensen et al，1985；Sand-Jensen，1990；Liboriussen，Jeppesen，2003；秦伯强等，2006；董彬等，2013；秦伯强等，2013）。因此，对沉水植物-水微界面的研究逐渐引起了相关学者的关注（Pietro et al，2006；Spilling et al，2010；He et al，2012）。初步研究已证实沉水植物叶-水微界面亦存在好氧-厌氧交替出现的氧化-还原微环境（Sand-Jensen et al，1985；Sand-Jensen，Revsbech，1987；Jones et al，2002）。微界面溶解性化学物质的运输主要通过分子扩散，但由于微界面附着物特殊的物质组成，较高的光合作用速率和异养过程都有可能在微界面发生，有可能出现因这些生物通过代谢消耗或生产而造成的陡化学梯度（steep gradients）。因此，微界面内环境因子及溶解性物质的分布可能与植物周围的上覆水中的分布有很大差异。
微界面附着物及其内部异质微环境对植物生长发育和生态系统的养分转化具有重要的生态效应。研究富营养化水体中沉水植物茎叶微界面结构、环境特征、影响因素，探明微界面的生态效应和作用机制，对于水生态系统养分循环的认识和利用沉水植物的生态调控功能提高水环境质量具有十分重要的理论意义和实践意义。
但当前在水生植物对水体的生态调控功能研究中，多集中在对植物本身的研究上，而对水生植物-水界面特性及其与外界相关因素的相互关系研究较少。加之由于技术和条件的限制，目前对沉水植物-水界面基本结构、环境特征、不同生物及环境条件下微界面环境因子（O2浓度、pH值、ORP等）的变化规律及其生态效应的同步测定和系统研究尚比较缺乏。特别是富营养化水体中典型沉水植物茎叶微界面基本结构和不同营养状态、光照、底质、生境及不同生长阶段时沉水植物茎、叶微界面结构及环境因子O2浓度、pH值、ORP等的时空变化规律如何？微界面氧化-还原微环境的生态效应和调控机制是什么？沉水植物附植生物反硝化作用在水体反硝化脱氮中地位如何？附植生物有哪些应用？这是诸多学者一直在关注但还仍未得到很好解决的问题，迫切要求进行系统而深入的研究。
一、国内外研究进展
1.水生植物微界面结构组成
水生植物附着物作为茎叶微界面重要的物质成分，主要由附着藻类、附着动物、细菌、真菌、有机碎屑、菌胶团、泥砂等组成（Br¨onmark，1989；Jones et al，1999；Dodds et al，2004；Vis et al，2006）。目前，对水生植物微界面附着物的研究较多地集中在附着藻类和附着细菌的群落结构和数量上（Morin，Kimball，1983；Pip，Robinson，1984；Sand-Jensen et al，1985；Rimes，Goulder，1986；Blindow，1987；Iwan Jones et al，2000b；Asaeda et al，2004；纪海婷等，2013），而对其他有机物和无机物质的研究较少。对沉水植物附着物的基本结构、生物化学组成的研究也非常少。水生植物附植生物的组成、结构和数量主要受植物种类（Pip，Robinson，1984；Baker，Orr，1986；Rimes，Goulder，1986；苏胜齐等，2002；由文辉，1999；He et al，2012）、生长阶段（Br-¨onmark，1989；Morin et al，1999；苏胜齐等，2002；Asaeda et al，2004）、水体营养水平（Pizarro et al，2002；袁信芳等，2006；Lin et al，2006；Chen et al，2007；Raeder et al，2010；董彬等，2013；魏宏农等，2013；张亚娟等，2014）和生物等因素的影响。
水生植物微界面附着物具有明显的时空变化（Rimes，Goulder，1986；Cai et al，2013；董彬等，2013）。由于水生植物本身就有一个生长、衰老和分解的过程，所以附植生物的季节变化较为复杂。水生植物豆瓣菜（Nasturtium officinale）、Apium nodzjlorum、Glyceria Juitans的附着菌类密度在1月末至3月降低，4～6月增加（Rimes，Goulder，1986）。蓖齿眼子菜（Potamogeton pectinatus L.）附植生物在5～6月增加，7月降低或保持同等数量，随后增加到一个比较高的水平（van Dijk，1993）。太湖各点附着藻类以春季种类和数量最多，而冬季最少（袁信芳等，2006）。水温较低的季节附着藻类种类数最低，变化大且每个种类的细胞数在全年中也最少；初夏和秋季附着藻类的种类和数量均较多；夏季藻类的种类数和细胞数均达到最大（杨红军等，2002）。但由文辉发现淀山湖附着藻类冬季数量最多而夏季最少。苏胜齐也发现菹草不同时期附着藻类的密度和生物量不同，表现为快速生长季节（生长期）和生物量较大的季节（成熟期）时附着藻类的密度和生物量较小，而菹草生物量较少季节（幼苗期）和衰亡期时藻类附着密度和生物量要高得多（苏胜齐等，2002）。桑沟湾楮岛海域大叶藻（Zosterae Marinae）附植生物，春季褐藻类为主要附着生物，附着高峰出现在4月份，夏季附着的大型海藻种类明显减少；硅藻附着高峰出现在秋季，冬季仅有微藻类的硅藻附着（高亚平等，2010）。沉水植物旺盛生长期有碍附着藻类的增殖，生长减缓或衰亡时，附着藻类呈现增长态势。沉水植物附着物还存在空间分布差异。Rimes和Goulder发现水生植物豆瓣菜、Apium nodzjlorum、Glyceria Juitans叶片的附着菌类密度小于茎部和叶柄处（Rimes，Goulder，1986）。同一叶片的不同部位菌群密度存在显著差异，叶片越老菌群密度越大（Baker，Orr，1986）。Morin和Kimball发现狐尾藻属（Myriophyllum heterophyllum）茎的不同部位附着藻类的分布也不同（Morin，Kimball，1983）。
综上所述，目前人类对水生植物微界面基本结构、生物化学组成的研究还比较欠缺。
2.微界面环境特征及其影响因素
由于原位测定沉水植物茎叶微界面环境因子如O2浓度、pH值和ORP的难度较大，到目前为止，对这方面的研究相对较少。初步的研究发现沉水植物叶微界面O2浓度存在明显的陡梯度变化和时空分布特征（Sand-Jensen et al，1985；Sand-Jensen，Revsbech，1987；董彬等，2015）。Sand-Jensen等运用微电极技术测定水生植物菹草（Potamogeton crispus）、Littorella uniflora、大叶藻（Zostera marina）、宣藻（Scytosiphon lomentaria）叶微界面O2浓度的变化，发现越接近植物叶表面O2浓度越高，且其随着光照强度增强而升高，叶微界面O2的空间分布梯度明显，白天植物表面产生富氧环境，而夜间叶微界面附着层内出现厌氧微环境。研究还发现，菹草叶表O2浓度对光照的响应速率8月份快于6月份，不同植物叶微界面内O2浓度对光照的响应存在差异，菹草快于Littorella uniflora（Sand-Jensen et al，1985）。Sorrell和Dromgoole发现水蕴草（Egeria densa）茎的泌氧能力亦存在昼夜差异，白天泌氧能力明显高于夜间（Sorrell，Dromgoole，1988）。Sand-Jensen等亦发现沉水植物叶微界面的pH值要高于周围水体的pH值，且差值随附着层厚度增大而增加（Sand-Jensen et al，1985）。董彬等亦证实菹草茎叶微界面O2浓度具有明显的昼夜变化、生长阶段变化和空间变化（董彬等，2015）。Jones等将人造叶片与伊乐藻（Elodea nuttallii）在室内共同培养，利用微电极技术研究了人造叶片附着层pH值的空间分布，发现自微界面外侧垂直至叶表pH值逐渐升高，叶表处达到最高，且附着层越厚，pH值的增加幅度越大，但并未实际测定沉水植物伊乐藻叶微界面pH值的变化。他认为附着生物光合作用及附着层对游离态CO2的阻抑是导致pH值垂直分布差异的主要原因（Iwan Jones et al，2000a）。Spilling等发现光照强度显著影响海洋植物褐藻Fucus vesiculosus叶组织内外O2浓度和pH值的微环境分布（Spilling et al，2010）。
微界面内O2浓度、pH值和ORP的空间变化势必将引起其他可溶性物质的变化，可能对植物的生长和水生态系统的结构和功能产生重要影响。沉水植物是水生态系统的重要部分，在富营养化水体生态修复中起着举足轻重的作用。上述仅有的研究仅初步显示了沉水植物叶微界面内O2浓度的陡梯度变化，但对茎叶微界面pH值的研究涉及甚少，对茎叶微界面ORP的研究还未见文献报道。到目前为止，结合附着物的影响对沉水植物茎叶微界面O2浓度、pH值和ORP的综合研究还比较缺乏。Fang等利用微电极发现富营养化太湖蓝藻颗粒内外O2浓度、pH值和ORP存在明显的分布，蓝藻颗粒内外这种生理微环境特征的发现为治理蓝藻水华提供了新方法（Fang et al，2013）。Dong等对太湖贡湖湾的马来眼子菜（Potamogeton malaianus）不同部位茎叶微界面的O2浓度、pH值和ORP分布特征进行了比较研究，发现附着物厚度和叶龄对微界面结构和功能有重要影响（Dong et al，2014）。
沉水植物叶微界面结构及环境因子可能受多种因素的影响，目前仅有的几例研究主要集中在光照和附着物上，而水体营养状态、底质类型、流速、生境、植物种类、部位和生长阶段也可能对微界面结构和功能有重要的影响，因此这方面的研究还有待深入和加强。
3.水生植物微界面生态效应
沉水植物茎叶微界面附着物通过遮阴和阻抑物质迁移减缓植物光合作用和生长。光通过附着层到达植物叶表面时会发生衰减，附着层厚度越大光衰减越多，且光衰减在一定条件下会降低沉水植物的光合作用速率，最终对植物生长产生重要影响（Madsen，Sand-Jensen，1991；宋玉芝等，2010；Chen et al，2007）。附着物的存在增大了水与植物表面间物质的传输距离和阻力，阻碍了游离态O2、CO2和可溶性有机碳（DOC）等可溶性物质在水相和植物表面间的迁移（Sand-Jensen et al，1985；Sand-Jensen，1989；Ramcharan et al，2009）。Jones等发现由于附植生物对水中CO2的利用，使沉水植物叶微界面内的CO2浓度降低至2μmol/L，无机碳浓度成为沉水植物光合作用的关键限制因子，对沉水植物光合作用产生了不利影响（Jones et al，2000）。微界面附着物可使沉水植物叶绿素含量发生改变、叶片枯死量增加和光合作用产量下降（Asaeda et al，2004）。Chen等研究发现水体营养负荷的提高可促进沉水植物菹草叶片表面附着藻类的增殖，导致叶片光合机能下降（Chen et al，2007）。Laugaste等认为，在富营养化湖泊藻类暴发过程中，首先发生附植生物的大量增殖，而后才发生浮游藻类暴发，并指出附植生物的大量繁殖可能是藻类暴发和沉水植物消亡的重要诱因（Laugaste，Lessok，2004）。附植生物的大量增殖可能是富营养化水体中沉水植物消亡的一个重要原因，但在附植生物大量增殖是否是沉水植物消亡的最直接原因这一问题上，目前的观点并不一致（Harwell，Havens，2003；Roberts et al，2003）。一部分学者认为，由浮游藻类大量繁殖所导致的水体透明度降低以及遮光作用所引起的水下光照缺乏是沉水植物消亡的直接原因；但还有人认为，附植生物与水生植物对营养盐和光等生态资源的竞争以及其产生的代谢产物对沉水植物光合作用的抑制可能是造成沉水植物在富营养化水体中退化的关键（Liboriussen，Jeppesen，2003）。研究已初步证实，附植生物对沉水植物的抑制比营养盐更加直接。
微界面附植生物在水生态系统中占据着独特的生态位，发挥着重要作用。沉水植物微界面附着物能通过水体理化条件、流速、自身吸收和硝化反硝化等途径对水体养分循环产生影响（Dodds，2003；纪海婷等，2013），在草-藻型湖泊转变过程中发挥着重要作用（Poulickova et al，2008）。宋玉芝等通过附植生物对富营养化水体氮、磷去除效果的研究发现，有附植生物的水体中总氮（TN）浓度从5mg/L左右下降到2mg/L左右，半个月内对水体TN的累积去除率可达60%（宋玉芝等，2009）。而在一个氮不足的清水性草型湖泊中，附植生物仍可达到很高的生物量，这可能归因于其较高的氮循环效率（Sánchez et al，2010）。
基于群落水平的研究表明，水生植物对水体的氮循环有显著影响。在营养物质丰富的水体中，沉水植物群落内的硝化作用强度比无沉水植物的区域高10倍（Eriksson，Weisner，1997）。几个有沉水植物和无沉水植物的沉积物斑块的反硝化作用速率的直接比较表明沉水植物对反硝化作用有积极的影响（Caffrey，Kemp，1992；Christensen，Sorensen，1986；Iizumi et al，1980；Wang et al，2013）。在富营养化水体中，水生高等植物生长区水的氨化作用产气量为敞水区（无水生植物区）的2倍，凤眼莲（Eichhornia crassipes）、水花生（Alternanthera Philoxeroides）覆盖下水的反硝化产气量分别为敞水区的6.2倍和4.8倍，表明水生高等植物可促进氮素脱离水体，释放进入大气（王国祥等，1999）。通过模拟实验，借助具创新性的收集凤眼莲种植水体释放N2O的装置和方法，发现凤眼莲可以促进富营养化水体的硝化、反硝化和耦合的硝化-反硝化反应过程（高岩等，2012）。微宇宙实验中发现有浮水植物浮萍（Lemna sp.）和蕨壮满江红（Azolla filiculoides）的处理的反硝化作用速率明显高于无浮水植物的，促进了污水的氮去除（Jacobs，Harrison，2014）。在氨氮丰富的淡水生态系统（如污水处理厂）中，沉水植物群落内水化学性质的昼夜变化促进硝化作用和反硝化作用的耦合（如硝化细菌将
氧化为
，随后的反硝化作用将还原为N2），刺激向N2的转化，而沉水植物可为附着的硝化细菌提供表面可能是另一个重要因素（Eriksson，Weisner，1997）。
目前，与对海洋、湖泊沉积物-水界面反硝化作用的深入研究相比（Nielsen et al，1990；Trimmer et al，2013；Yin et al，2014），对淡水植物-水界面的附植生物硝化反硝化作用的研究较少（Eriksson，Weisner，1996；Eriksson，2001；Toet et al，2003），其具体过程和机制还不了解。虽然早在1983年Kurata就观察到在芦苇（Phragmites australis）和其他挺水植物茎上附植生物的反硝化作用，但并没有定量的数据。Eriksson等经多年对富营养化水体中篦齿眼子菜（Potamogeton pectinatus）附植生物反硝化作用进行研究，发现附植生物反硝化作用相当可观，与沉积物的相当。Toet等发现污水处理厂出水的湿地中芦苇和伊乐藻附植生物的反硝化作用速率显著高于沉积物（Toet et al，2003）。这些初步的零星报道表明，富营养化水体中沉水植物附植生物的反硝化作用相当可观，可能是水生态系统中重要的氮去除途径之一。上述研究在一定程度上显示了沉水植物附着物对氮去除有明显贡献。但是，目前研究沉水植物附植生物反硝化作用的文献仅有少数几例。在中国富营养化浅水湖泊中，附植生物反硝化作用特征及其对水生态系统反硝化脱氮的贡献如何还有待深入探讨。因此，系统研究养分丰富的浅水淡水生态系统中沉水植物附植生物群落的反硝化作用对理解微界面的生态效应非常必要。
同时，附着藻还能够敏感地响应水环境的变化，可作为水生态系统的理想指示物种（Roman，Ekelund，2000），在湖泊生态修复中发挥着重要作用（Rodusky et al，2001；Schneider，Lindstr⌀m，2011；纪海婷等，2013）。
二、微界面附植生物研究方法和技术
对微界面附着物结构或附着物附着过程的研究早期主要采用普通扫描电子显微镜（Allanson，1973；Rogers，Breen，1981），但是普通扫描电镜观测前必须对植物样品进行冷冻干燥，易造成附着物的脱落和自然结构的破坏（Rogers，Breen，1981；Allanson，1973），观测结果可能与微界面附着物的真实形貌存在较大误差。近年来发展的基于共聚焦激光扫描显微术（CLSM）的光谱指纹技术可用于研究微界面附着物的深度剖面和生物监测。利用环境扫描电镜沉水植物样品可直接上机测定，可以更直观地呈现附着物的自然形貌特征，但目前使用还较少。
与浮游生物相比，学者们对附植生物的研究还远远不够，其中一个重要的原因是附植生物取样比较困难。自然条件下，水生植物与附植生物的分布不均衡，而且附植生物难以从水生植物茎叶表面完全分离，因此目前在如何采集附植生物方面还没有统一的标准。对微界面附着藻类的研究采用常规的定性定量分析方法（袁信芳等，2006；Morin，Kimball，1983）；对附着微生物的研究多采用PCR法、RFLP法、DGGE法、FISH法和克隆基因文库分析法（李华芝等，2006；何聃等，2014）；而对附着物养分含量的分析还没有标准方法，也较少有人涉及。
对微界面环境因子如O2浓度、pH值和ORP等的研究多采用微电极技术（Fang et al，2013；Dong et al，2014）。由于氧是生物系统中一个关键的参数，复杂环境中的氧梯度对理解和量化诸多代谢过程极其重要，所以文献中对光纤针式氧电极和Clark型电化学氧电极的描述和应用相对较多（Klimant et al，1995；K¨uhl，2005；Armstrong et al，2000；Xu et al，2009；Spilling et al，2010）。目前，微电极多用于研究沉积物（de Beer et al，1997；Nakamura et al，2004；Xu et al，2009；王永平等，2013）、藻垫（Babauta et al，2014；Jones et al，2000；Fang et al，2014）、生物膜（Revsbech et al，1983；Sweerts et al，1989；Wang et al，2013）、植物根系（Armstrong et al，2000）等的微环境变化。但利用微电极对沉水植物茎、叶微界面的研究还相对较少，这与沉水植物微界面的重要作用极不相符。对微界面附植生物反硝化的研究早期多采用乙炔抑制法（Eriksson，Weisner，1996；Toet et al，2003），现开始发展到稳定同位素法（Eriksson，2001）。对微界面附植生物群落结构和功能的研究主要采用微生物的方法，在上一章已进行了详细论述。总之，对微界面的研究方法和技术虽然取得了阶段性成果，但还有待进一步完善和改进。
三、微界面附植生物研究存在的问题
近年来，淡水生态系统附植生物生态学的研究得到了快速发展，测定技术也得到同步发展，对附植生物生态学的发展起了巨大的推动作用。但是，由于附植生物生态学是一个集合，其研究不仅涉及生态学的诸多领域如生理的、群落的、种群的和生态系统的，而且还涉及环境化学、生物化学、生物地球化学、分子生物学、植物生理生态学、微生物学等多种学科，同时还有赖于现代先进的分析测试和微观观测手段的有机融合，虽然相关研究取得了长足的进展，但关于附植生物在水生态系统中的形成机制、生态功能等仍没有清晰而明确的答案，仍有很多问题尚未解决。相对于其他学科，附植生物生态学仍是一门年轻的科学，诸多领域仍处于未开发或未充分开发的状态。
目前，研究存在的主要不足如下。
①目前，淡水生态系统附植生物的研究主要是基于自然环境，但由于许多生态过程同时发生，基于野外观测的数据通常很难解释根本的机制，得出可靠的结论更不容易。而且，现有的围隔实验或少量小型室内的模拟实验与实际的野外环境存在很大差异，因此，如何最大限度地模拟野外环境是今后必须解决的一个重点问题。
②对附植生物各种指标的测定还没有标准统一的方法，尤其是还没有高效的标准取样方法，如不同基质上附植生物的取样方法；对附植生物分类的研究还远远不够；附植生物养分动态、生物量和生产力的研究没有现成的准则。
③附植生物群落作为一个功能微系统，对同时出现在界面层内的自养和异养过程的研究还不够深入，附植生物的代谢及其与养分的耦合过程和机制的研究还涉及较少。
④对不同于自然状态（如贫营养、富营养、酸化、水体荒漠化等）和控制条件下水体养分循环的研究还有待深入，对附植生物在养分循环中的功能了解较少，对附植生物和基质间的物质能量交换了解甚少，对不同污染状态下水体养分循环的调控机制的研究还比较缺乏。
⑤附植生物群落结构和种群动态分析对评价水质非常有价值，但目前来说应用指示生物评价水质仍然相当主观和缺少普遍性，其因果关系尚不明确。
⑥对附植生物生态功能的应用领域尚有待进一步拓展，如对重金属污染、有机污染、蓝藻水华预警、古环境分析等方面的应用研究还比较少。
⑦对附植生物相关理论的研究还比较少。