第二节　放射性造血系统损伤模型

Bergonie和Tribondeau提出“组织和细胞辐射敏感性与其增殖能力成正比，与其分化程度成反比。”造血组织具有高度增殖分化能力，对射线极为敏感，0.5Gy全身照射后就会引起血液学改变。当全身或大部分机体受到较大剂量射线照射后，造血组织的损伤是机体最早出现的基本损伤之一。全身大面积照射常发生于原子弹爆炸、核事故、放射工作人员在事故抢救过程中及放射源丢失事件时，照射后造血系统很快就有十分明显的形态、功能、数量及特性的变化。白血病患者骨髓或外周干细胞移植前接受全身照射、淋巴瘤患者进行大面积野照射时因接受的是小剂量分次照射，并且可能既往接受过放疗或化疗，故其血液学变化不再典型。

射线对造血系统的损伤主要表现为造血功能的抑制和破坏，由此诱发机体感染、出血、免疫功能抑制等致死性疾病。具体表现为：①造血干细胞及多种成熟细胞损伤，出现凋亡、坏死，数目急剧下降。②造血微环境改变，出现炎症反应、吞噬清除反应异常等。③血管损伤，出现血管和血窦充血、出血、组织水肿等。骨髓抑制是辐射损伤的主要表现，也是临床放疗常见副反应，是限制放疗剂量的主要因素。因此，全身照射后造血系统损伤的轻重和恢复的快慢在很大程度上影响放射病的病情和转归。

多种动物模型已应用到造血系统辐射损伤的研究中，最常见的实验动物有三种：小鼠，犬和恒河猴。小鼠、犬的造血系统组成与功能和人相似，辐射损伤后机体修复性和内分泌代谢的改变也类似于人。造血系统辐射反应实验中，小鼠、犬的血细胞对刺激反应敏感，其反应近似于人。非人灵长类模型是美国食品药物管理局（Food and Drug Administration，FDA）认证通过的药物研发试验标准模型。非人灵长类模型有许多无法比拟的优势，它在组织结构、基因同源性、机体代谢方式、寿命与人类极其相似，并在人类疾病研究上表现出与人高度相似的组织病理学改变以及分子发生机制。

评估全身照射后造血系统辐射损伤最广泛使用的特征性观察终点是LD₅₀，即照射后的半数致死剂量。小鼠接受半数致死剂量后，骨髓综合征的发展速度最快，30天后数目剩余一半（LD_50/30）。体型更大的动物接受半数致死剂量后，45~60天后数目剩余一半（LD_50/45~60）。人类死亡的高峰发生在暴露后30天左右。

放射性造血系统损伤出现较早，易于发生，常采用全身照射方式制作损伤模型。我们以最常见的雄性C57BL/6小鼠为例，阐述放射性造血系统损伤模型的建立步骤与常见检测指标。将小鼠放入与体型匹配的有机玻璃固定装置内，使其保持清醒状态且固定身体，四肢平铺，呈俯卧位。应用医用电子直线加速器全身照射一次，射线种类为6MeV电子线，剂量为8Gy，剂量率为200cGy/min，源皮距为100cm。

照射后每天称量体重，并按实验所需时间点颈椎脱臼处死小鼠，称量脾脏重量，计算脾重指数［脾重（mg）/体重（g）］。

分离双侧股骨，10%中性甲醛固定过夜，常规石蜡包埋切片，HE染色于光镜下观察骨髓组织病理学改变。

按实验所需时间点采集小鼠眼眶血，全自动血液分析仪进行血常规分析，测定白细胞、红细胞、血小板数量及血红蛋白浓度。

给照射后小鼠尾静脉内注入一定数量的正常同系小鼠的骨髓细胞后，受体小鼠脾表面出现肉眼可见的圆形结节，即脾结节，每一个脾结节称为一个脾结节形成单位或脾集落形成单位（colony forming unitspleen，CFU-S），每一个脾结节来源于单个细胞。

按实验所需时间点颈椎脱臼处死小鼠，取双侧股骨，采集骨髓有核细胞，以终浓度为10⁵/孔铺入12孔板中，培养箱孵育1周，计算集落形成数目，≥30个细胞为一个集落。

按实验所需时间点采集小鼠眼眶血，混匀后分别采用双标CD3/CD19、CD3/NK1.1、三标CD3/CD4/CD8荧光标记、孵育，应用流式细胞仪检测荧光分布，采集数据。

按实验所需时间点颈椎脱臼处死小鼠，采集脾脏并制成单细胞悬液。以细胞终浓度为2×10⁶个/ml铺入96孔板，培养箱孵育并采用CCK-8或MTT法测定淋巴细胞转化增殖能力。

造血组织是辐射高度敏感组织，暴露于射线后，血液系统很快就有十分明显的形态、功能及数量、特性的变化，血细胞生成各阶段的细胞数量和功能以及调控网络的各个环节都可发生明显异常，且与照射剂量相关，因此是临床分类诊断的极好的生物学指标，外周血白细胞数的变化与放射病临床分期在时相上十分一致，常作为临床病程，病情和转归预后的判断依据之一。造血系统损伤的轻重和造血重建的好坏与放射病的发展和结局关系密切。因此，在一定的照射剂量范围内，改善造血促进重建也是临床治疗的关键措施。基于全身照射方式的放射性造血损伤动物模型的建立，为我们充分、深入的了解辐射造血损伤的发病特点及发生机制提供了丰富的证据。对于放射性造血损伤的防护与救治药物筛选、疗效验证提供了合理、适用的研究工具。