病原生物学(第4版)(全国高等学历继续教育“十三五”(临床专升本)规划教材)
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第五节 细菌感染的诊断和预防

学习目标

掌握 细菌学诊断,包括标本采集、致病菌的检验程序。

熟悉 细菌感染的血清学诊断。

了解 细菌感染的特异性预防。

根据病史及临床表现推测患者存在细菌性感染时,应采取合适的临床标本进行及时、准确的细菌学和血清学检验,根据检查结果有针对性地开展特异性防治。另外,临床标本分离获得病原体之后,还可做药物敏感试验,为临床选择抗菌药物提供依据。

一、病原学诊断

(一)标本采集

临床标本的采集和送检是细菌学检查的关键环节,方法正确与否直接影响病原菌检出的效率和准确性,通常需注意以下原则:

1.遵循无菌操作采集标本

送检病原学检测的临床标本应注意无菌操作,避免环境及感染部位周边定植细菌污染待检标本。

2.早期采集

在疾病早期和使用抗菌药物之前采集,已经使用了抗菌药物者需在标本分离培养时加入药物拮抗剂。血清标本需要采集急性期和恢复期双份血清。标本必须新鲜,采集后尽快送检。

3.采集合适的标本

采集感染部位或者病变明显部位的标本,例如针对菌痢患者采集有脓血的粪便标本;流行性脑膜炎病人取脑脊液、血液或出血瘀斑;根据疾病的不同病期采集标本,例如伤寒有较长的病程,不同阶段细菌存在部位不同,在病程1~2周内取血液,2周以后取粪便和尿液,但粪便和尿液培养主要用于带菌状态的筛查,临床诊断意义不及血培养。

4.标本量需满足检查需求

由于多数血流感染成人患者血液中病原菌浓度低于1CFU/ml,故为确保病原检出率,成人患者血培养标本的采集量不应低于20ml,新生儿及儿童患者采集量可适当少些。

5.正确保存和送检

所有临床标本必须新鲜,要尽快送检。送检过程中大多数细菌学标本可以冷藏,但疑奈瑟菌感染标本需要保温。志贺菌抵抗力相对较弱,粪便标本需要置于甘油缓冲液中保存。此外,标本采集及运送过程中必须注意生物安全,防止传播和自身感染。烈性传染病标本必须按国家相关规定包装,由专人运送。

(二)致病菌的检验程序

1.涂片镜检

对于一些具有典型形态、排列特征和特殊染色性的病原菌,直接涂片镜检具有很高的诊断意义。例如对疑似结核患者的痰涂片进行抗酸染色镜检,如发现抗酸染色阳性,形态细长的杆菌,对于结核病的诊断意义很大,但随着非结合分枝杆菌感染逐渐增多,有条件者应进行分离、鉴定;在患者脓性脑脊液或瘀血点中的白细胞内检出革兰氏阴性的双球菌即可初步诊断为流行性脑脊髓膜炎;在生殖器官病变部位的标本中发现革兰氏阴性的双球菌,结合临床症状即可初步诊断为淋病奈瑟菌感染。因此,涂片镜检是初步诊断部分细菌性感染最快速、最简便的检验方法。

2.分离培养

从血液、脑脊液等无菌部位采集的标本,可直接接种至营养丰富的液体或固体培养基。从正常菌群存在部位采取的标本,应接种至选择或鉴别培养基。接种后放37℃孵育,一般经16~20小时大多可形成菌落。少数如布鲁菌、结核分枝杆菌生长缓慢,分别需经3~4周和4~8周才长成可见菌落。分离培养的阳性率要比直接涂片镜检高,但需时间较久。因此,遇白喉、气性坏疽等急性传染病时,可根据病人临床表现和直接涂片镜检结果作出初步诊断并及时治疗,不必等待培养报告,以免贻误治疗时间。

3.生化鉴定

细菌的生化反应特点可作为鉴别细菌的依据。例如肠道杆菌种类很多,形态、染色性基本相同,菌落亦类似。但它们的糖类和蛋白质的分解产物不完全一样,因而,可利用不同生化试验区别不同细菌,进行菌种鉴定。目前国内外大型医院大多采用半自动或全自动的细菌鉴定系统及其配套商品化试剂盒,一般24小时内即可完成从细菌微量培养、自动监测、记录并打印出结果的全过程。

4.血清学鉴定

利用已知抗体的细菌种、型特异性,检测临床标本中分离、纯培养的细菌,以确定细菌的种、型。对有许多血清型的细菌进行种属鉴定时常采用此类方法,例如肠杆菌科的一些种属,包括埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属等,常用方法为玻片凝集试验。

5.动物实验

用于特殊致病菌的分离、鉴定,测定菌株产毒性等,主要应用于科研,临床常规实验室少有开展。常用实验动物有小白鼠、豚鼠和家兔等。接种后应仔细观察动物的食量、精神状态和局部变化,有时尚要测定体重、体温和血液等指标。若死亡应立即解剖,检查病变,或进一步作分离培养,证实由何病菌所致。含杂菌多的标本,也可通过接种易感动物获得纯培养,达到分离致病菌的目的。例如,将疑患肺炎链球菌性肺炎病人痰接种至小鼠腹腔。测试细菌的产毒性,可用家兔或豚鼠皮肤检测白喉棒状杆菌是否产生白喉毒素;家兔结扎肠段测定大肠埃希菌不耐热肠毒素等。

6.药物敏感试验

随着抗菌药物的广泛使用,临床上耐药菌株的分离比率越来越高,药敏试验对指导临床抗菌药物选择,及时控制感染有重要意义。药敏试验方法有纸片扩散法、稀释法、E test法等,其中纸片扩散法和稀释法是常用的方法。前者依据抗菌药物纸片周围是否出现抑菌圈及其大小,后者则凭借观察抑菌或杀菌药物浓度来判断细菌对某种药物的敏感或耐药程度。在药敏试验中,最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)是指能够抑制培养基内细菌生长的最低药物浓度,纸片扩散法通常不能测定MIC;最低杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,MBC)是指能够杀灭培养基内99.9%细菌的最低药物浓度。MIC和MBC值越低,表示细菌对该药越敏感。相关研究机构根据抗菌药物抑制临床分离细菌生长所需要MIC结合抗菌药物常用剂量时人体内所能达到的血药浓度,制订细菌对各种抗菌药物敏感性的判断标准,我国采用美国临床实验室标准化研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)制订的标准。

CLSI采用敏感(S)、中介(I)、耐药(R)三级划分制,分别表示受试菌对抗菌药的敏感性,某些特殊抗菌药物如头孢吡肟还设定了剂量依赖敏感(SDD)标准。敏感(S)表示采用抗菌药物常规剂量时体内达到的血药浓度超过该药对受试细菌MIC的5倍以上,表明该药物常规剂量可有效治疗受试细菌所致感染。中介(I)表示采用常规剂量时达到的血药浓度相当于或略高于受试细菌的MIC,表明该菌所致感染治疗需用高剂量药物,或该菌感染位于体内抗菌药物浓缩部位方能获得临床疗效。剂量依赖敏感(SDD)的意义与中介(I)相近。耐药(R)则表示药物对受试细菌的MIC高于药物治疗剂量在血液或体液内能达到的药物浓度,或受试菌能产生破坏抗菌药物的修饰酶等特殊耐药机制,提示采用该药治疗受试菌感染通常不能获得临床疗效。

随着对常用抗菌药物均耐药的临床分离菌增多,部分细菌采用单一药物治疗难以奏效,常需采用两种或两种以上药物联合治疗。联合药敏试验结果可为药物联用提供参考依据。联合药敏试验应先进行单药的药敏试验,然后以接近两者的MIC的几个浓度进行两药的交叉联合测试药敏。具体方法有肉汤稀释棋盘法、琼脂稀释棋盘法、单药纸片搭桥法、复合药物纸片法等。稀释法较为准确,通常用部分抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration index,FIC)作为联合药敏试验结果的判断依据。纸片法相对简便,但结果有时不易判读。

7.分子生物学检测

核酸杂交技术和聚合酶链反应(PCR)不需分离培养即可鉴定出病原菌,尤其适用于病毒和难以或不能培养的病原菌(如梅毒螺旋体),以及培养时间较长或培养条件苛刻的病原菌(如立克次体、衣原体、结核分枝杆菌、幽门螺杆菌、空肠弯曲菌、军团菌和无芽胞厌氧菌等)。

(1)核酸杂交技术:

核酸杂交技术包括Southern印迹杂交(Southern blot)、Northern印迹杂交(Northern blot)、斑点杂交(dot blot)和原位杂交(in situ hybridization,ISH)等。这些技术同时具备了碱基互补的高度特异性和标记技术的敏感性。核酸杂交可从标本中直接检出病原体,受标本中杂质影响小,对难以分离培养的病原体尤为适用,例如结核分枝杆菌、幽门螺杆菌、空肠弯曲菌等。

(2)PCR:

在病原菌诊断方面,PCR技术理论上可检测除朊粒以外所有含DNA或RNA的病原,目前主要用于检测结核分枝杆菌、淋病奈瑟菌、军团菌等培养困难以及产肠毒素型大肠埃希菌、艰难梭菌等产特殊毒素的病原菌。需要注意的是,PCR反应敏感性极高,理论上标本中存在1个拷贝的DNA分子,就可获得阳性结果,因此极微量的污染即可造成假阳性结果。所以PCR实验要严格操作规程,避免PCR产物及环境微生物的污染。

二、血清学诊断

病原菌侵入机体会释放各种抗原物质,并刺激机体免疫系统产生特异性反应,例如其抗原物质能刺激机体产生特异性抗体。抗体存在于血液或其他体液中,常随病程进展表现出效价的升高。根据这一特点,可以采用病原菌或其特异性抗原检测病人体内是否产生了相应的特异性抗体及其效价变化,作为某些病原菌感染的辅助诊断。需要明确的是此类抗体产生后,会在机体中持续多年,在机体血清中检测出抗体,特别是IgG类抗体,很难判断是近期感染还是既往感染,甚至疫苗接种造成的。因此,抗体效价须显著高于当地正常人的水平或随病程有显著升高才有诊断价值,而检测IgM类抗体则对诊断新近感染更有意义。血清学诊断一般适用于病程较长和免疫原性较强的病原菌引起感染的诊断。此外也可采用特异性抗体检测体内抗原物质,如嗜肺军团菌的培养需特殊培养基,多数实验室未常规开展该菌的分离培养,采用抗原检测方法则可简便、快速地检测其特异性抗原,获得病原学诊断,因此抗原检测是部分细菌性感染的快速诊断方法。由于抗原、抗体检测通常采集血清作为标本进行测定,故称为血清学诊断(serological diagnosis)。常用的血清学诊断试验包括:玻片或试管凝集试验、沉淀试验、补体结合试验、冷凝集试验以及酶联免疫吸附试验(ELISA)等。

三、细菌感染的特异性预防

根据机体抗感染免疫的形成机制,可以采用人工方法模拟自然状态下发生的免疫过程,从而提高机体的特异性免疫水平,达到预防和治疗特定感染性疾病的目的。此外,针对某些特定病原菌的易感者,也可采用抗菌药物进行预防。

1.人工主动免疫

常用到的生物制品包括灭活疫苗、减毒活疫苗、类毒素、亚单位疫苗、基因工程重组蛋白质疫苗、化学合成多肽疫苗、核酸疫苗及治疗性疫苗等。

2.人工被动免疫

主要用于急性传染病的治疗或紧急预防。如注射白喉和破伤风的抗毒素紧急预防或治疗白喉和破伤风。

3.抗菌药物预防

某些特定病原菌的易感者可采用抗菌药物进行感染的针对性预防。例如罹患镰刀状细胞贫血的婴幼儿对肺炎链球菌易感,可采用青霉素类口服制剂长期口服预防感染。孕妇妊娠后期(孕35~37周)阴道或肠道携带B群链球菌(group B streptococcus,GBS),新生儿易发生GBS感染,也可给予孕妇青霉素G或头孢唑啉静滴,以预防新生儿GBS感染。与流行性脑脊髓膜炎患者有密切接触者可采用利福平或环丙沙星等抗菌药物口服,预防脑膜炎奈瑟菌感染。

(徐晓刚)

学习小结

细菌感染一般需要进行病原学诊断以明确病因。准确进行病原学检验要正确地采集标本并运送,获得标本后可以进行直接涂片检查、分离培养、血清学实验、分子生物学技术等方法进行检测,必要时进行动物试验。获得的细菌应进行药敏测定,为临床抗菌药物选择提供客观依据。细菌感染的特异性预防包括人工主动免疫和人工被动免疫。

复习参考题

1.如何正确采集和送检临床细菌学的标本?

2.对疑似细菌感染性疾病如何进行病原学诊断?