第二节　细菌的生理

学习目标

细菌是一大类具有独立生命活动的单细胞微生物，具有表面积大，摄取营养快，代谢旺盛，生长繁殖迅速等特点。它的新陈代谢就是从周围环境中摄取营养，以获得能量和合成自身组分的原料，同时排出多种代谢产物。我们研究细菌生理，了解其新陈代谢特点及生长繁殖规律，以便在医学实践中分离和鉴别细菌，为传染病的诊断和控制提供依据，同时重视细菌的有益作用。

一、细菌的化学组成和物理性状

（一）细菌的化学组成

细菌的化学组成与其他生物细胞相似，含有多种化学成分，主要包括：

1.水

是细菌细胞重要的组成部分，占细胞总重量的75%~90%。

2.无机盐

主要有碳、氢、氮、氧、磷和硫等。还有少数的无机离子，如钾、钠、铁、镁、钙和氯等，用以构成菌细胞的各种成分、维持酶的活性和跨膜化学梯度。

3.蛋白质

占细胞固体成分的50%~80%，大部分为复合蛋白，如核蛋白、糖蛋白和脂蛋白等，构成结构蛋白与功能蛋白。

4.糖类

含量占固体成分的10%~30%。

5.脂类

含量较少，仅占1%~7%。

6.核酸

核酸包括DNA与RNA两种，在DNA碱基配对中，鸟嘌呤（G）与胞嘧啶（C）的含量在四种碱基总量中所占的百分比有一定范围，变化不大，故可利用（G＋C）mol%的测定作为细菌分类的主要依据之一。

7.特殊成分

如肽聚糖、磷壁酸、D型氨基酸、二氨基庚二酸、吡啶二羧酸等，这些成分在真核生物细胞中尚未发现。

（二）细菌的物理性状

1.光学性质

细菌为半透明体，当光线照射至细菌，部分被吸收，部分被折射，因此细菌悬液呈混浊状态，细菌越多浊度越大，可用比浊法估计液体中的细菌数量。

2.带电现象

细菌蛋白由许多氨基酸组成，在溶液中可电离成带正电荷的氨基（）和带负电荷的羧基（COO-）。氨基酸的电离与细菌所处环境的pH有关。当pH高时，细菌带负电荷，pH低时细菌带正电荷。在一定pH溶液内，氨基酸电离的阳离子和阴离子数相等，此时pH即称为细菌的等电点（pI）。革兰氏阳性菌的pI为2~3，革兰氏阴性菌的pI为4~5。在生理条件（中性或弱碱性）下，细菌均带负电荷，由于革兰氏阳性菌pI较阴性菌低，带有更多的负电荷。细菌的带电现象与细菌的革兰氏染色性、菌体凝集试验、抑菌和杀菌作用等都有密切关系。

3.表面积

细菌体积虽小，但其单位体积里细胞表面积总和却比其他生物体大。细菌表面积大，有利于同外界进行物质交换，故细菌的代谢旺盛、繁殖迅速。

4.半透性

细菌的细胞壁和细胞膜均具半透膜性质，只允许水分子和小分子物质通过，有利于吸收营养物质和排出代谢产物。

5.渗透压

细菌体内含有高浓度的营养物质和无机盐，一般革兰氏阳性菌的渗透压高达20~25个大气压，革兰氏阴性菌为5~6个大气压。细菌所处一般环境相对低渗，但有坚韧细胞壁的保护不致崩裂。若处于比菌内渗透压更高的环境中，菌体内水分逸出，胞质浓缩，细菌就不能生长繁殖。

二、细菌的营养与生长繁殖

（一）细菌营养类型

各类细菌的酶系统不同，代谢活性有差异，因而对营养物质的需要也不同。根据细菌所利用的能源和碳源不同，将细菌分为两大营养类型。

1.自养菌（autotroph）

能以简单的无机物为原料，如利用CO2、碳酸盐作为碳源，以氮气、氨或硝酸盐等作为氮源，合成菌体成分。这类细菌所需能量来自无机化合物的氧化所产生，称为化能自养菌（chemotroph），亦可通过光合作用获得能量，称为光能自养菌（phototroph）。

2.异养菌（heterotroph）

不能利用简单的无机物为原料，必须以多种有机物为原料，如蛋白质、糖类等，才能合成菌体成分并获得能量。异养菌包括腐生菌（saprophyte）和寄生菌。腐生菌以动植物尸体、腐败食物等作为营养物；寄生菌寄生于活体内，从宿主的有机物获得营养。所有的病原菌都是异养菌，大部分属寄生菌。

（二）细菌的营养物质

1.水

水是细菌重要成分之一，细菌营养的吸收与代谢均需有水才能进行。

2.碳源

各种含碳的无机或有机物，如CO2、碳酸盐、糖、脂肪等都能被细菌吸收和利用，合成菌体组分和作为获得能量的主要来源。病原菌主要从糖类获得碳。

3.氮源

用于合成菌体的结构蛋白、功能蛋白与核酸等。致病菌主要从氨基酸、蛋白胨等有机氮化合物中获得氮。少数病原菌如克雷伯菌亦可利用硝酸盐甚至氮气，但利用率较低。

4.无机盐

细菌所需要的无机盐主要是钾、钠、钙、镁、磷、硫、铁、氯、钴、锌、锰、铜等。各类无机盐的功用如下：①构成菌体的成分；②作为酶的组成部分，维持酶的活性；③参与能量的储存和转运；④调节菌体内外的渗透压；⑤某些元素与细菌致病作用有关。例如白喉棒状杆菌在含铁0.14mg/L的培养基中毒素产量最高，铁的浓度达到0.6mg/L时则完全不产毒。在人体内，大部分铁结合在铁蛋白、乳铁蛋白或转铁蛋白中，细菌必须与人体细胞竞争得到铁才能生长繁殖。具有载铁体（siderophore）的细菌就有此竞争力，它可与铁螯合和溶解铁，并带入菌体内以供代谢之需。如结核分枝杆菌的有毒株和无毒株的一个重要区别就是前者有一种称为分枝菌素（mycobactin）的载铁体，而后者则无。

5.生长因子

某些细菌在生长过程中尚需一些自身不能合成的生长因子（growth factor），通常为有机化合物，包括维生素、X因子和V因子等，X因子是高铁血红素，V因子是辅酶Ⅰ或辅酶Ⅱ，两者为细菌呼吸所必需。

（三）细菌生长繁殖的条件

1.充足的营养物质

主要包括碳源、氮源、无机盐、生长因子和水，为细菌的新陈代谢及生长繁殖提供必要的原料和充足能量。

2.合适的酸碱度（pH）

细菌体内的生化反应是酶促反应，酶促反应都有一个最适pH范围。pH可影响细胞质膜的透性和稳定性及物质的溶解性等。大多数病原菌的最适pH为7.2~7.6，在此pH时细菌的酶活性最强，在宿主体内极易生长。大多数嗜中性细菌生长的pH范围是6.0~8.0，嗜酸性细菌最适生长pH可低至3.0，嗜碱性细菌最适生长pH可高达10.5。个别细菌如霍乱弧菌在pH 8.4~9.2条件下生长最好，而结核分枝杆菌则在pH 6.5~6.8条件下最适宜。

3.适宜的温度

温度影响细菌酶活性，影响细菌细胞质、细胞膜等组分的流动性以及物质的溶解度。病原菌的最适生长温度为37℃，与人的体温一致。个别细菌如鼠疫耶尔森菌在28~30℃的条件下生长最好。嗜热菌能在50~60℃下生长，海洋细菌嗜低温，能在0~30℃条件下生长。

4.必要的气体环境

病原菌生长繁殖时需要的气体主要是氧和二氧化碳。一般细菌在代谢过程中产生的二氧化碳即可满足自身需要，但有些细菌（如脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、牛布鲁菌等）在初次分离培养时，需提供5%~10%的二氧化碳。按细菌代谢时对分子氧的需求与否可分为四种类型。

（1）专性需氧菌（obligate aerobe）：

具有完善的呼吸酶系统，需要分子氧作为受氢体以完成需氧呼吸，仅能在有氧环境下生长。如结核分枝杆菌、霍乱弧菌。

（2）微需氧菌（microaerophilic bacterium）：

在低氧压（5%~6%）生长最好，氧浓度>10%对其有抑制作用。如空肠弯曲菌、幽门螺杆菌。

（3）兼性厌氧菌（facultative anaerobe）：

兼有需氧呼吸和无氧发酵两种功能，不论在有氧或无氧环境中都能生长，但以有氧时生长较好。大多数病原菌属于此类。

（4）专性厌氧菌（obligate anaerobe）：

缺乏完善的呼吸酶系统，只能在无氧环境中进行发酵。有游离氧存在时，不但不能利用分子氧，且还将受其毒害，甚至死亡。如破伤风梭菌、脆弱拟杆菌。

专性厌氧菌在有氧环境中不能生长，其原因可能是：

1）缺乏氧化还原电势（Eh）高的呼吸酶：

各种物质均有其固有的Eh。在氧化还原过程中，Eh高的物质可氧化Eh低的物质，反之不能。人组织的Eh约为150mV，普通培养基在有氧环境中Eh可达300mV左右，因此细菌必须具有Eh比它们更高的呼吸酶，如细胞色素和细胞色素氧化酶，才能氧化环境中的营养物质。专性厌氧菌缺乏这类高Eh呼吸酶，只能在120mV以下的Eh时生长，有氧时Eh高于此值，故不能生长。

2）缺乏分解有毒氧基团的酶：

细菌在有氧环境中代谢时，常产生具有强烈杀菌作用的超氧阴离子（）和过氧化氢（H2 O2）。在有铁存在条件下，这两种物质还可产生对生物大分子有损害作用的羟基（•OH）。需氧菌有超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和触酶（catalase），前者将超氧阴离子还原成过氧化氢，后者将过氧化氢分解为水和分子氧。有的细菌不产生触酶，而是产生过氧化物酶（peroxidase），将H2 O2还原成无毒的水分子。专性厌氧菌缺乏这三种酶，故在有氧时受到有毒氧基团的影响，不能生长繁殖。

5.渗透压

一般培养基的盐浓度和渗透压对大多数细菌是安全的，少数嗜盐菌需要在高浓度（3%）NaCl的环境中生长良好。

（四）细菌的生长繁殖

1.细菌个体生长繁殖的方式与速度

细菌以二分裂的方式进行无性繁殖。细菌分裂一代所需时间随细胞种类不同而异，但总体看，在适宜条件下，绝大多数细菌的繁殖速度很快，一般细菌（如大肠埃希菌）繁殖一代只需20~30分钟，个别细菌分裂较慢，如结核分枝杆菌繁殖一代需18~20小时。

细菌分裂时菌细胞首先增大，染色体复制。革兰氏阳性菌的染色体与中介体相连，当染色体复制时，中介体一分为二，各向两端移动，分别将复制好的两条染色体拉向菌细胞的两侧。接着染色体中部的细胞膜向内陷入，形成隔膜。同时细胞壁亦向内生长，最后肽聚糖水解酶使细胞壁肽聚糖的共价键断裂，分裂成为两个菌细胞。革兰氏阴性菌多无中介体，DNA直接连接在细胞膜上，以双向复制方式进行。DNA复制完成后，两个DNA随着新的细胞壁和膜物质的增生而被分开。壁在两个DNA之间向心生长，最后会合而形成隔膜。细胞壁沿隔膜内陷，整个细胞分裂成两个子代细胞，每一套 DNA进入一个子代细胞中（图 5-2-1）。

2.细菌生长繁殖的规律

细菌繁殖极快，在最佳条件下，若以20分钟繁殖一代，1个细菌1小时后经3次分裂成8个细菌，10小时经30次分裂可达10亿以上。以此计算下去细菌群体将庞大到难以置信的程度。但由于细菌大量堆积，生长环境中营养物的不断消耗，有害代谢产物的积聚，事实上细菌的繁殖不可能总保持这种速度。经过一段时间后，细菌繁殖速度渐减，死亡菌数增多，活菌增长率随之下降并趋于停滞。如将一定数量细菌接种于适宜的液体培养基后，连续定时取样检查活菌数，可发现其生长过程的规律性。以培养时间为横坐标，培养物中细菌数的对数为纵坐标，可绘出一条生长曲线（growth curve）（图5-2-2），分为四个时期。

（1）迟缓期（lag phase）：

为最初培养的1~4小时。此时是细菌适应新环境的过程，菌体增大，代谢活跃，但分裂迟缓。

（2）对数期（logarithmic phase）：

此期细菌以恒定的几何级数迅速增长，活菌数目呈对数直线上升，可持续数小时至数天不等，一般细菌为8~10小时。此期细菌的大小、形态、染色性、生物活性等都较典型，对外界环境因素（如抗生素等）的作用比较敏感，研究细菌的生物学性状，最好选用此期。

（3）稳定期（stationary phase）：

对数期后，由于培养基中营养物质耗尽，有害代谢产物的蓄积及pH下降等，使细菌繁殖速度渐趋下降，而死亡菌数逐渐上升，细菌繁殖数与死亡数接近，使活菌保持相对稳定。此期细菌的性状可发生变化，如外毒素、抗生素等合成产物在此期内产生，芽胞在此期形成。生产上往往采取一些措施，不断调整培养液的pH、向培养系统中补充新鲜营养物质、对需氧菌进行通气、搅拌等可延长稳定期。

（4）衰亡期（decline phase）：

细菌的繁殖速度从减慢至停止，死菌数迅速超过活菌数。此期菌体变形、肿胀、出现多形态的衰退型，甚至菌体自溶，不易辨认。

生长曲线是反映体外群体细菌的生长规律，对研究工作和生产实践都有指导意义。掌握细菌的生长规律，可以人为地改变培养条件，调整细菌的生长繁殖阶段，更为有效地利用对人类有益的细菌。

3.细菌生物被膜

在自然界中，大多数细菌并非以浮游状态生长，而是以细菌生物被膜（bacterial biofilm，BBF）形式广泛存在于各种物体表面上，如自来水管道、工业管道、通风设备、医疗器械以及人体组织器官表面等。细菌生物被膜是细菌附着在生物或非生物体表面后，由细菌及其所分泌的胞外多聚物（主要是胞外多糖）共同组成肉眼看不见的膜状多细胞结构（图5-2-3）。生物被膜是细菌在生长过程中为了适应周围环境而形成的一种保护性生存状态。细菌生物被膜的形成是一个动态的过程，主要可分为四个阶段：细菌可逆性黏附的定植阶段、不可逆性黏附的集聚阶段、生物被膜的成熟阶段和细菌的脱落与再定植阶段。组成生物被膜的细菌可以是一种或多种。根据细菌在生物被膜内位置可分为：游离菌、表层菌和里层菌。游离菌与表层菌比较相似，它们相对容易获得营养和氧气，代谢通常比较活跃，菌体较大；而里层菌被包裹于多聚糖中，其养料的获取及代谢只能通过周围的间质水道进行，代谢率较低，多处于休眠状态，一般不进行频繁地分裂，菌体较小。

几乎所有的细菌在一定条件下都可以形成生物被膜。铜绿假单胞菌、葡萄球菌、肠球菌、大肠埃希菌及流感嗜血杆菌等细菌更容易形成生物被膜。生物被膜与细菌的耐药、致病、医院感染等关系密切。

三、细菌的新陈代谢

（一）细菌的能量代谢

细菌的新陈代谢是细菌生命活动的中心环节，包括合成代谢和分解代谢。这些反应都是在一系列酶的控制与催化下进行的。细菌利用吸收的物质，在生物体内进行氧化分解，释放能量的过程叫生物氧化，即物质在生物体内的氧化还原反应。需氧呼吸在有氧条件下进行，厌氧呼吸和发酵必须在无氧条件下进行。大多数病原菌只进行需氧呼吸和发酵，没有厌氧呼吸。现以葡萄糖为例，简述细菌的能量代谢。

1.需氧呼吸

需氧呼吸中，葡萄糖经过EMP(embden-meyerhof-parnas)途径生成丙酮酸，后者脱羧产生乙酰辅酶A后进入三羧酸循环彻底氧化。然后将脱出的氢进入电子传递链进行氧化磷酸化，最终以分子氧作为受氢体。1分子葡萄糖在有氧条件下彻底氧化，生成CO2、H2O，并产生38分子ATP。需氧菌和兼性厌氧菌进行这种需氧呼吸。

2.发酵

（1）EMP途径：

又称糖酵解。这是大多数细菌共有的基本代谢途径，专性厌氧菌产能的唯一途径。反应最终的受氢体是未彻底氧化的中间代谢产物，产生能量远比需氧呼吸少。1分子葡萄糖可生成2分子丙酮酸，产生2分子ATP和2分子NADH+H+。丙酮酸以后的代谢随细菌的种类不同而异。

（2）磷酸戊糖途径：

又称己糖磷酸(hexose monophosphate，HMP)途径，是EMP途径的分支，由己糖生成戊糖的循环途径。其主要功能是为生物合成提供前体和还原能，反应获得12分子的NADH+H+可供进一步利用，产能效果仅为EMP途径的一半。

（3）厌氧呼吸：

专性厌氧菌没有需氧电子传递链和完整的三羧酸循环，1分子葡萄糖经厌氧酵解，只能产生2分子ATP，最终以外源的无机氧化物(CO2、、)作为受氢体的一类产能效率低的特殊呼吸。

（二）细菌的代谢产物

1.细菌的分解代谢产物和生化反应

各种细菌所具有的酶不完全相同，对营养物质的分解能力亦不一致，因而其代谢产物不同。根据此特点，利用生物化学方法来鉴别不同细菌称为细菌的生化反应试验。常见的有：

（1）糖发酵试验：

不同细菌分解糖类的能力和代谢产物不同。例如大肠埃希菌能发酵葡萄糖和乳糖；而伤寒沙门菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖。即使两种细菌均可发酵同一糖类，其结果也不尽相同，如大肠埃希菌有甲酸脱氢酶，能将葡萄糖发酵生成的甲酸进一步分解为 CO2和 H2 ，故产酸并产气，以“⊕”表示；而伤寒沙门菌缺乏该酶，发酵葡萄糖仅产酸不产气，以“ +”表示，不分解乳糖，以“－”表示。

（2）VP试验：

由Voges和Proskauer两位学者创建，故名。大肠埃希菌和产气肠杆菌均能发酵葡萄糖，产酸产气，两者不能区别。但产气肠杆菌能使丙酮酸脱羧生成中性的乙酰甲基甲醇，后者在碱性溶液中被氧化生成二乙酰，二乙酰与含胍基化合物反应生成红色化合物，是为VP试验阳性，大肠埃希菌不能生成乙酰甲基甲醇，故VP试验阴性。

（3）甲基红试验：

产气肠杆菌分解葡萄糖产生丙酮酸，后者经脱羧后生成中性的乙酰甲基甲醇，故培养液pH>5.4，以甲基红(methyl red)作为指示剂时溶液呈橘黄色，是为甲基红试验阴性。大肠埃希菌分解葡萄糖产生丙酮酸，培养液pH≤4.5，甲基红指示剂呈红色，则为甲基红试验阳性。

（4）枸橼酸盐利用（citrate utilization）试验：

当某些细菌(如产气肠杆菌)利用铵盐作为唯一氮源，并利用枸橼酸盐作为唯一碳源时，可在枸橼酸盐培养基上生长，分解枸橼酸盐生成碳酸盐，并分解铵盐生成氨，使培养基变为碱性，是为该试验阳性。大肠埃希菌不能利用枸橼酸盐为唯一碳源，故在该培养基上不能生长，是为枸橼酸盐试验阴性。

（5）靛基质试验：

有些细菌如大肠埃希菌、变形杆菌、霍乱弧菌等能分解培养基中的色氨酸，生成无色的靛基质（又称吲哚），与试剂中的对二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈红色，是为靛基质试验阳性。

（6）硫化氢试验：

有些细菌如乙型副伤寒沙门菌、变形杆菌等能分解培养基中的含硫氨基酸（如胱氨酸、甲硫氨酸）生成硫化氢，硫化氢遇铅或铁离子生成肉眼可见的黑色硫化铅或硫化亚铁沉淀物，为硫化氢试验阳性。

（7）尿素酶试验：

变形杆菌有尿素酶，能分解培养基中的尿素产生氨，使培养基变碱，以酚红为指示剂检测为红色，是为尿素酶试验阳性。

细菌的生化反应用于鉴别细菌，尤其对形态、革兰氏染色反应和培养特性相同或相似的细菌更为重要。吲哚（I）、甲基红（M）、VP（V）、枸橼酸盐利用（C）四种试验常用于鉴定肠道杆菌，合称为IMViC试验。例如大肠埃希菌这四种试验的结果是“＋＋--”，产气肠杆菌则为“--＋＋”。

2.细菌的合成代谢产物及其在医学上的意义

细菌在合成代谢中除了合成菌体自身成分外，还可合成一些与医学有关的特殊产物，有的与细菌的致病性有关，有的可用于鉴别细菌或防治疾病。

（1）热原质（pyrogen）：

又称致热原。是细菌在合成代谢中的产物，注入人体或动物体内能引起发热反应，称热原质。产生热原质的细菌大多是革兰氏阴性菌，热原质的本质是细菌细胞壁中的脂多糖。热原质耐高温，不被高压蒸气灭菌（121℃、20分钟）所破坏。250℃高温干烤才能破坏热原质。注射用液、生物制品、抗生素及输液用的蒸馏水均不能含有热原质。因此，在制备和使用注射制剂的过程中，需要严格的无菌操作，以防止被细菌污染。对液体中可能存在的热原质可用吸附剂吸附、特殊石棉滤板过滤或通过蒸馏方法除去。输液用的玻璃容器要经250℃ 2小时或180℃ 4小时的高温处理，以彻底破坏热原质。

（2）毒素和侵袭性酶：

细菌产生的毒素有内毒素（endotoxin）和外毒素（exotoxin）两种。内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁中的脂多糖，菌体死亡或裂解后才能释放出来。外毒素是由革兰氏阳性菌及少数革兰氏阴性菌产生的一种蛋白质，在代谢过程中可分泌到菌体外，毒性极强。有些细菌还能合成一些胞外酶，促使细菌扩散，增强病原菌的侵袭力，如链球菌的透明质酸酶、链激酶，产气荚膜梭菌的卵磷脂酶等。

（3）色素：

某些细菌（和真菌）在一定条件下（氧气、适宜温度等），能产生各种颜色的色素，细菌合成的色素分为水溶性和脂溶性两种，前者如铜绿假单胞菌产生的水溶性绿色色素，使伤口脓汁和敷料染成绿色；后者如金黄色葡萄球菌合成脂溶性金黄色色素，色素仅见于菌落上，培养基不显色。细菌的色素有助于细菌的鉴别。

（4）细菌素：

某些菌株产生的一类具有抗菌作用的蛋白质称细菌素（bactericin）。细菌素仅对与产生菌株有亲缘关系的细菌有杀伤作用。细菌素的合成受菌体内质粒控制，如大肠埃希菌的col质粒控制大肠菌素的合成。现已知有十几种细菌素，如葡萄球菌素、绿脓菌素、弧菌素等。细菌素具有种和型的特异性，因此可用于细菌分型的流行病学调查等。

（5）抗生素：

某些细菌在代谢过程中可产生一种能抑制和杀灭其他细菌或癌细胞的物质，称抗生素（antibiotics）。如多黏菌素和短杆菌肽等。

（6）维生素：

某些细菌能合成一些维生素，除供作自身的生长因子外，也能分泌至菌体外，如大肠埃希菌在肠道内能合成B族维生素和维生素K等，可被人体吸收利用，对维持肠道的生理环境起重要作用。

（三）细菌的分泌系统

细菌在生长代谢过程中，为了适应其生存环境，在宿主体内生存、繁殖和扩散会产生一些毒素、蛋白酶等毒力物质，参与细菌的致病及其他重要生命活动。细菌合成的这些毒力蛋白，革兰氏阳性菌可以直接将其分泌到胞外，革兰氏阴性菌则需要通过细菌的分泌系统进行蛋白质的跨胞质膜转运。细菌的分泌系统是一种贯穿细胞膜的特殊结构，由不同膜镶嵌蛋白构成，目前已经发现了7型细菌分泌系统，其中Ⅰ-Ⅵ为革兰氏阴性菌分泌系统，Ⅶ为分枝杆菌及少数革兰氏阳性菌的分泌系统。按其分泌是否利用Sec转位酶可分为两大类：一类是利用Sec转位酶（translocase）和N末端信号序列进行蛋白转运的，包括Ⅱ型（T2SS）和Ⅴ型分泌系统（T5SS）；另一类则不依赖Sec转位酶，如Ⅰ型（T1SS）、Ⅲ型（T3SS）、Ⅳ型（T4SS）和Ⅵ型分泌系统（T6SS）。细菌分泌系统的发现是近年来细菌致病机制研究的重要进展。

四、细菌的人工培养

根据细菌的生理需要和繁殖规律，可用人工方法为细菌提供必需的营养及适宜的生长环境，使其在体外生长繁殖，即人工培养法。目前除极少数细菌外，绝大多数细菌都可在体外进行人工培养。

（一）培养基

培养基（culture medium）是人工配制的适合细菌生长繁殖的营养基质，调整合适的pH（通常为7.2~7.6），经灭菌后即可使用。根据培养基的性质和用途可分为以下几种。

1.基础培养基

能满足一般细菌生长繁殖的营养需要，可供大多数细菌生长，如肉汤（包括肉浸液、蛋白胨、氯化钠、磷酸盐等）、蛋白胨水等。若在肉汤中加入适当琼脂，可将液体培养基制成半固体或固体培养基。

2.营养培养基

在基础培养基中加入葡萄糖、血液、血清、酵母浸膏等，可供营养要求较高的细菌生长，如血平板或血清肉汤等。

3.选择培养基

利用不同种类细菌对某种化学物质敏感性不同的特性，制成有利于选择欲分离的目的菌生长，而抑制其他杂菌生长的培养基。如SS琼脂培养基含有胆盐、煌绿等，能抑制革兰氏阳性菌及大肠埃希菌生长，利于选择肠道致病菌中的沙门菌和志贺菌生长。

4.鉴别培养基

可供细菌生化反应试验，借以鉴定细菌的培养基。在培养基中加入不同的单糖或氨基酸，观察细菌在此培养基中是否分解这些糖或氨基酸产生不同物质，用生化方法检测，如各种单糖发酵管、双糖铁培养基等。

5.厌氧培养基

厌氧培养基营养成分丰富，含有特殊生长因子，氧化还原电势低，并加入亚甲蓝作为氧化还原指示剂。其中，心、脑浸液和肝块、肉渣含有不饱和脂肪酸，能吸收培养基中的氧；硫乙醇酸盐和半胱氨酸是较强的还原剂；维生素K1、氯化血红素可以促进某些类杆菌的生长。常用的有庖肉培养基（cooked meat medium）、硫乙醇酸盐肉汤等，并在培养基表面加入凡士林或液体石蜡以隔绝空气。

（二）细菌在培养基中的生长现象

从临床标本中培养病原菌一般分三步进行。①增菌培养：某些标本如血液等，因含致病菌量少，可先将标本接种到增菌肉汤中培养；②分离培养：将增菌培养物或含菌量多的标本（如粪便、脓汁等）直接在平板上划线分离，将其中目的菌分离出来；③纯培养：将分离出来的可疑目的菌接种于斜面上，以获取大量纯种细菌，进一步作形态学、生化学及血清学鉴定，同时作抗生素敏感试验，为提供临床病原学诊断及指导治疗作参考。

按培养基物理性状可分为液体、半固体和固体三大类，细菌在其上生长的情况各异。

1.在液体培养基中的生长情况

不同细菌的生长情况不同，在液体中可出现：①均匀混浊生长，多数细菌呈此现象，多属兼性厌氧菌；②沉淀生长，少数呈链状的细菌沉积于管底；③菌膜生长，需氧菌可浮在液体表面生长，形成菌膜。

2.在半固体培养基中生长情况

用接种针将细菌穿刺接种于半固体培养基中，若细菌无动力（无鞭毛），则细菌沿穿刺线生长，而周围培养基清澈透明；若细菌有鞭毛能运动，可由穿刺线向四周扩散呈云雾状生长，此法可用来检测细菌的动力。

3.在固体培养基上的生长情况

固体培养基分平板与斜面等。细菌在平板上因划线的分散作用，使许多原混杂的细菌在固体培养基表面上散开，称之为分离培养。一般经过18~24小时培养后，单个细菌分裂繁殖成一堆肉眼可见的细菌集团，称为菌落（colony）。当进行样品活菌计数时，以在平板培养基上形成的菌落数来间接确定其活菌数，以菌落形成单位（colony forming unit，CFU）来表示。一个菌落是由一个细菌繁殖的后代堆积而成。挑取单个菌落，移种到另一培养基上，生长出来的细菌均为纯种，称为纯培养（pure culture）。各种细菌在固体培养基上形成的菌落，在大小、形状、颜色、边缘、表面光滑度、湿润度、透明度及在血平板上的溶血情况等均有不同表现，可因细菌的种类和所用的培养基不同而有差异，这些有助于识别和鉴定细菌。若菌落融合成片，称为菌苔（mossy）。

（三）人工培养细菌的用途及意义

1.传染性疾病的诊断

从患者的病灶中分离培养出病原菌是诊断传染性疾病最可靠的依据，同时进行药敏试验又可指导对疾病的治疗。

2.细菌的鉴定与研究

研究细菌的生物学性状、基因与抗原的结构、致病性与疾病的相关性等，均需人工培养法，而且分离培养细菌也是发现新病原的先决条件。

3.生物制品的制备

经人工培养细菌可制备菌苗、类毒素、诊断用菌液等生物制品，也可用菌苗及类毒素等进一步去制备其他免疫制剂，如免疫血清，诊断用血清及抗毒素等。

4.细菌毒力分析及卫生学指标的检测

利用免疫学和其他方法可检测人工培养细菌的毒力因子，配合动物实验可鉴定细菌的侵袭力并进行毒力分析，也可通过定量培养计数等，对饮水、食品等的微生物学卫生指标进行检测。

5.基因工程中的应用

由于细菌具有繁殖快、易培养的特点，故大多数基因工程的实验和生产是先在细菌中进行的，如细菌DNA包括质粒DNA的提取，原生质体融合，DNA的转移与重组，基因在细胞内的表达等。

五、细菌的分类与命名

细菌分类（taxonomy of bacteria）是一个古老的、传统的学科，又是一个现代化的、发展的学科。随着生物科学的发展，细菌分类已从一般表型指征的鉴别深入到基因型特征的鉴定，即形成了现代的细菌分类学。

（一）分类原则

细菌的分类原则上可分为传统分类和种系分类两种。

1.传统分类

主要以细菌较稳定的生物学性状作为依据，如细菌的形态与结构、染色性、培养特性、生化反应、抗原特性等作为分类的标记。由于对分类性状的选择有一定的主观性，所以传统分类也称为人为分类。传统分类是建立在表型基础上的，故也称为表型分类。20世纪60年代开始借助计算机建立了数值分类法，该方法将细菌的各种生物学性状分别赋予数字，再进行数学统计和聚类分析，然后按照相似程度进行归类（一般种的水平相似度>80%），以此划分种和属。近年来人们应用电泳、色谱、质谱等方法，对菌体组分、代谢产物等进行分析，如细胞壁脂肪酸分析、全细胞脂类和蛋白质的分析、多点酶电泳分析等，从而建立了分析分类法。这种分类方法本质上仍属于传统分类，为揭示细菌表型差异提供了有力的手段。

2.种系分类

主要依据细菌组分（核酸、蛋白质等）的同源程度进行分类。这种以细菌发育关系为基础，以细菌的遗传型特征为依据的细菌分类，反映物种之间在遗传与进化上的相互关系，揭示细菌进化的信息，称为系统分类或种系分类，又称为自然分类。目前常用的方法有：细菌DNA碱基组成[（G＋C）mol%]测定、核酸分子杂交（DNA-DNA同源性、DNA-rRNA同源性）以及16S rRNA寡核苷酸的碱基序列同源性分析。其中16S rRNA因其在进化过程中保守、稳定、很少发生变异，是种系分类的重要依据。近年来，随着微生物基因组测序的发展，又出现了“基于序列的分类（sequence-based classification）”，成为分类学的发展方向。

国际上最具权威性的细菌分类专著《伯杰系统细菌学手册》（1984）和《伯杰鉴定细菌学手册》（第9版，1994），都反映了细菌种系分类的研究进展。《伯杰系统细菌学手册》（第2版，2004）又收集了4000余种菌株的16S rRNA，将原核生物分为2个域，即古生菌域（archaea）和细菌域（bacteria），前者分为2个门，后者分为24个门。

（二）细菌的分类层次

细菌分类的层次与其他生物相同，也是界、门、纲、目、科、属、种。细菌分类最基本的单位是“种”（species）。生物学性状基本相同的细菌群体构成一个菌种；性状相近关系密切的若干菌种组成一个“属”（genus）；有时在两个主要分类单位间还添加次级分类单位。如化脓链球菌按细胞壁多糖（C）抗原分为A~V等20个族（group）；在沙门菌的属与种之间加有组的单位，如志贺菌在属之下又分为A、B、C和D四个群（group）。同一菌种的各个细菌，虽然性状基本相同，但在某些方面仍有一定差异，差异较明显的称亚种（subspecies）或变种，差异小的则为型（type）。按抗原结构分为不同血清型；按噬菌体和细菌素的敏感性不同而分噬菌体型和细菌素型；按生化反应和其他某些生物学性状不同而分生物型。此外，还有亚型（subtype）等次级单位。

对不同来源的同一菌种的细菌称为该菌的不同菌株（strain）。经国际细菌分类命名委员会确定的具有典型性状的菌株称标准菌株（standard strain）或模式菌株（type strain）。

（三）细菌的命名

目前国际通用的细菌命名采用拉丁文双名法，由两个拉丁字组成，前一字为属名，用名词，首字母大写；后一字为种名，用形容词，首字母小写，印刷时用斜体字。如Escherichia coli、Bacillus subtilis。属名也可用第一个字母代表，如M.tuberculosis、S.typhi等。

中文译名则是以种名放在前面，属名放在后面。例如，Mycobacterium tuberculosis（结核分枝杆菌），Salmonella typhi（伤寒沙门菌）等。有时某些常见的细菌也可用习惯通用的俗名，如Tubercle bacillus（结核杆菌）、Typhoid bacillus（伤寒杆菌）等。有时泛指某一属细菌、不特指其中某个菌种，则可在属名后加sp.（单数）或spp.（复数），如Salmonella sp.表示沙门菌属中的细菌。

（强　华）

学习小结

复习参考题