第二篇 ARDS的发病机制
第三章 ARDS的病因
第一节 ARDS的常见病因
ARDS本身异质性很大，其病因分类方法尚不确定。按照肺损伤发生途径，ARDS病因常被分为肺内因素(直接)与肺外因素(间接)两类。肺内因素包括：肺部感染、胃内容物误吸、肺挫伤、淹溺和有毒物质吸入；肺外因素包括：脓毒症、严重多发伤(多发骨折、连枷胸、严重脑外伤和烧伤)、休克、高危手术(心脏手术、大动脉手术等)、多次输血、药物中毒、胰腺炎和心肺转流术后等。这种分类方法多被临床采用，也能利用肺损伤预测评分(lung injury prediction score，LIPS)进行量化(1～3.5分)。然而，这种分类方法对于肺损伤机制的阐明却有不利之处，其中的异质性会阻碍对ARDS认识的进一步推进。
从肺损伤发病机制角度来看，ARDS病因可以分为生物致病原和非生物致病原，其中生物致病原包括多种病原体(细菌、病毒、真菌、非典型病原体等)以及损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)等；非生物致病原主要包括酸性物质、药物、有毒气体、呼吸机机械损伤等。
一、生物致病原
（一）常见的病原体种类
感染是ARDS的首位危险因素，引起ARDS的感染性疾病主要包括重症肺部感染和全身感染等，后者包括脓毒症等。常见的病原体有细菌、病毒、真菌、非典型病原体等。
1.ARDS大型研究中病原体分布
脓毒症被认为是ARDS的重要病因之一。2009年，PROGRESS(promoting global research excellence in severe sepsis，PROGRESS)这项前瞻性、观察性研究共连续纳入来自37个国家的14 543名严重脓毒症病人，其中12 492名数据完整的病人被纳入最终的分析中，其结果显示：12 492名严重脓毒症病人中，5187(57.3%)名病人为革兰氏阳性菌感染，4039(44.5%)名病人为革兰氏阴性菌感染，1089(11.6%)名病人为真菌感染；46.4%病人的原发感染为肺，其次为腹盆腔感染(23.6%)和尿路感染(7.9%)；值得注意的是，81.6%的病人出现了呼吸衰竭。
Deen等人于2012年发表的系统评价与上述研究有较大出入。该研究纳入了东南亚发展中国家1990—2010年关于社区获得性菌血症的17项前瞻性研究，共计40 644名病人(14 386名成年人与26 258名未成年人)。3506名病人外周血中检出了病原体，其中革兰氏阴性菌为60.6%，革兰氏阳性菌为17.8%，分枝杆菌为1.6%，真菌为1.2%。革兰氏阴性菌中，沙门菌属(32.2%)最为常见，其次为大肠埃希菌(6.8%)、克雷伯菌(4.4%)和嗜血杆菌(4.1%)；革兰阳性菌以金黄色葡萄球菌(8.5%)和肺炎链球菌(6.7%)为主。但是，沙门菌属感染导致ARDS鲜有报道，近10年来共计仅有4例病人的个案报道。这些研究中病原体比例的差异，一方面与疾病的种类及严重程度有关，另一方面也与地区、研究对象相关；同时提示不同病原体感染诱发ARDS的能力存在差异，但目前缺乏确切的数据对比。
2012年，梅奥医学中心一项回顾性研究显示，与病毒、真菌和混合感染所致的肺部感染相比，细菌性肺炎病人ARDS的发生率显著降低，革兰阳性细菌感染和革兰氏阴性细菌感染之间无显著差异。与其他病原体相比，肺囊虫病和芽生菌感染诱发ARDS的发生率显著升高，可达50%左右。这些研究结果提示，随着诊断水平的提高，一些少见病原体诱发的ARDS得以识别。
Leligdowicz等人发表于2014年的一项大样本、回顾性研究中关于脓毒症休克的结果与PROGRESS有一定的相似。该研究纳入了加拿大、美国和沙特阿拉伯的29个ICU中1989—2008年共计8670名脓毒症休克病人，其中7974名病人被纳入最后的分析。结果显示，革兰氏阳性菌(34.2%)和革兰氏阴性菌(25.7%)分别占病原体的前两位，肺(40.1%)同样是最主要的原发感染器官。
综上所述，细菌感染仍是导致ARDS、增加ARDS易感性的主要病原体，其他病原体比例相对较低，不同病原体感染导致ARDS的概率有所差异。
2.细菌与ARDS
细菌感染相关ARDS中，多种细菌均可参与其中，部分甚至可以合并多种细菌、多部位的感染，本文仅就代表性和研究相对集中的几种细菌进行介绍。
(1)金黄色葡萄球菌：
金黄色葡萄球菌是唯一能产生血浆凝固酶的葡萄球菌，主要致病物质包括：凝固酶、葡萄球菌溶素、杀白细胞素、肠毒素、剥脱毒素和毒性休克综合征毒素-1等。
金黄色葡萄球菌感染后，其分泌的PVL、肠毒素等均可诱导肺组织发生炎症反应和肺损伤，其中线粒体功能紊乱和氧化应激损伤可能起到了关键的作用。Genestier等人研究结果显示，体外实验中PVL可与中性粒细胞线粒体外膜结合，形成相应孔道，迅速引起中性粒细胞线粒体损伤和线粒体平衡失调，导致线粒体释放细胞色素C和促凋亡因子Smac/DIABLO(second mitochondria-derived activator of caspases/direct IAP binding protein with low Pl)，促进caspase-9和caspase-3活化，导致中性粒细胞凋亡。Athale等人研究证实，经鼻给予金黄色葡萄球菌可迅速导致肺组织水肿、中性粒细胞浸润和肺泡毛细血管屏障破坏。近年来，该团队研究显示，金黄色葡萄球菌可通过氧化和化学应激相关的关键防御性转录因子之一的NF-E2相关因子2(NF-E2-related factor 2，Nrf2)促进线粒体的合成。与野生型小鼠相比，Nrf2基因敲除型小鼠的肺组织损伤、肺泡毛细血管屏障功能损伤、肺组织氧化应激损伤和促炎症细胞因子转录、释放水平均有显著降低，提示线粒体可能是金黄色葡萄球菌相关ARDS的重要靶点。
Chang等人研究表明，金黄色葡萄球菌腹膜炎导致的脓毒症模型小鼠中，肺泡上皮细胞凋亡显著增加，肺组织白细胞介素(interleukin，IL)-1β和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α的转录显著增加，同时肺组织氧化应激水平也显著升高。金黄色葡萄球菌导致的肺泡细胞线粒体损伤可通过氧化还原途径介导线粒体相关自噬，后者是进一步调节线粒体合成和线粒体数量平衡的重要途径。此外，肺组织还可通过上调超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、血红素加氧酶(heme oxygenase-1，HO-1)的水平发挥抗氧化作用。
以上这些研究结果表明，在金黄色葡萄球菌介导的肺损伤中，线粒体损伤和氧化应激起到了重要的作用，它们既与早期的过度炎症、肺组织损伤相关，同时也是肺组织重要的自我调节途径。但以上研究中，动物模型肺部感染程度普遍较轻，在严重金黄色葡萄球菌感染的情况下，这种自我调节机制是否仍能起到减轻肺组织损伤的作用还有待进一步研究。
(2)链球菌：
链球菌，尤其是化脓性链球菌(又称A群链球菌)占链球菌属90%以上，是致病力最强的链球菌，与其相关的致病物质主要包括：黏附素、链球菌溶血素、致热外毒素和侵袭性酶(如透明质酸酶、链激酶、链道酶等)等。肺炎链球菌也是导致ARDS的常见病原体，其主要致病物质为荚膜和肺炎链球菌溶血素。
链球菌导致ARDS的相关机制研究相对较少，除与革兰氏阳性细菌共有的致炎、致损伤机制外，M1型酿脓链球菌的M1蛋白、肺炎链球菌溶血素等也参与了链球菌性ARDS的发生。严重情况下，M1型酿脓链球菌、缓症链球菌或草绿色链球菌等可导致链球菌中毒性休克综合征(streptococcal toxic shock syndrome，STSS)，常可发展为ALI或ARDS。Mehta等人研究显示，入住ICU且合并侵袭性A型链球菌感染的病人中，ARDS的发生率可达34%。
研究发现M1蛋白可与纤维蛋白原形成复合物，并与中性粒细胞表面β2-整合素结合，促进中性粒细胞的脱颗粒和在肺组织聚集，小鼠静脉注射M1蛋白可出现肺组织中性粒细胞浸润、肺血管通透性增加和肺组织的破坏，这可能与p38分裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)激活、Mac-1表达增加和CXC细胞因子的释放等因素相关，其中肺泡巨噬细胞和中性粒细胞可能在M1蛋白介导的肺损伤中起到关键作用。
(3)大肠埃希菌：
革兰氏阴性菌诱导的ALI/ARDS中，以大肠埃希菌的致病机制研究最为清楚。大肠埃希菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是其最主要的导致肺组织过度炎症反应和细胞损伤的物质之一。目前关于LPS的研究十分广泛，既包括体外的多种细胞、多种动物模型的研究，也包括采用健康志愿者和离体人肺的相关研究。
LPS是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分，也是革兰氏阴性菌内毒素的主要成分。LPS的受体主要是Toll样受体(toll-like receptor，TLR)4，LPS与TLR4的相互作用除了可以激活下游MAPK等信号通路，促进活性氧(reactive oxygen species，ROS)产生，诱导多种炎症相关基因转录增加外，还参与促进其他模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)的激活，如NOD样受体(NOD-like receptor，NLR)中的NLRP3等。NLRP3激活可形成NLRP3-ASC-procaspase-1的复合物，即炎性体(inflammasome)，后者可进一步促进IL-1家族相关前体水解，形成具有活性的细胞因子释放入细胞外，如IL-1β、IL-18等。Grailer等人研究证实，在LPS气管滴注诱导的ALI模型中，LPS可通过NLRP3和caspase-1途径导致肺组织的通透性升高、中性粒细胞浸润、肺泡上皮细胞损伤和IL-1β产生等，LPS可增加NLRP3炎性体相关分子转录和表达。Nature新发表的研究也证实NLRP3炎性体的活化不仅发生在细胞内，被释放入细胞外的炎性体相关组件同样可以不依赖原发性刺激而直接诱导其他静息状态下的细胞分泌IL-1β。可以推测，这种类似于旁分泌的作用可能在肺损伤的失控性炎症反应和局部级联放大反应中起到了重要的作用，但还需进一步研究予以证实。
此外，LPS介导ARDS还可以通过促进相关DAMP的释放，间接地加重肺组织损伤，如高迁移组蛋白-1(high mobility group-1 protein，HMGB-1)等。Ueno等人研究证实，脓毒症ARDS病人与脓毒症正常肺功能病人相比，ARDS病人血浆和肺上皮细胞衬液(epithelial lining fluid，ELF)中HMGB-1的浓度均显著高于正常肺功能病人；LPS气管滴注和HMGB-1气管滴注诱导的ALI小鼠模型实验也发现了类似结果。
近年来，对于单核细胞在LPS介导ARDS中的作用是一个新的方向。Dhaliwal等人研究发现，在LPS介导的小鼠肺损伤中，外周血单核细胞中Gr1hi(CCR2hi)和Gr1lo亚群是中性粒细胞向肺组织迁移的重要调控因子。与对照组相比，单核细胞耗竭的小鼠肺血管通透性显著改善、肺组织损伤显著减轻；予以单核细胞耗竭的小鼠补充新的单核细胞后，LPS气管滴注小鼠肺损伤程度明显加重。但最近的一项纳入30名健康志愿者的随机对照试验研究显示，单核细胞耗竭并不能够改善LPS吸入介导的肺损伤，与对照组相比，单核细胞耗竭组LPS吸入者无论外周血中性粒细胞数量，还是肺组织通透性和炎症反应等指标均无显著差异。由于该研究病例数较少、LPS剂量较低、时间点设计相对靠前，因此对于单核细胞在ARDS中的作用尚需进一步研究。
3.真菌感染与ARDS
真菌感染所致ARDS的发病率相对较低，多见于使用免疫抑制剂的病人，如器官移植等。肺组织清除真菌的过程可伴随过度炎症反应，其中病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)与模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)，如多种TLRs和dectin-1等的相互作用是其中的关键，尤其是多种PRRs下游共同的MyD88(myeloid differentiation primary response gene 88，MyD88)分子，其作用尤为突出。研究发现，MyD88敲除小鼠的肺组织清除烟曲霉、毛霉菌的能力显著下降，同时肺组织IL-1β、IL-6、KC、γ-干扰素、TNF-α和巨噬细胞炎症蛋白(macrophage inflammation protein，MIP)-1α也显著下降。总体而言，目前关于真菌导致ARDS的研究相对较少。
4.病毒感染与ARDS
严重呼吸窘迫综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)病毒和H5N1、H1N1、H7N9等病毒感染所致ARDS的发病率很高，由于具备呼吸道传播的特点，已受到全球广泛关注。
(1)病毒导致ARDS的机制研究：
高致病性呼吸道病毒可以感染肺泡上皮细胞，导致细胞钠离子泵功能下降、细胞紧密连接损伤、细胞死亡和炎症因子释放。这些病理改变进一步可活化肺泡巨噬细胞和募集中性粒细胞，同时激活未被感染的上皮细胞。活化的巨噬细胞可进一步导致肺泡上皮细胞损伤和中性粒细胞趋化、激活、肺组织浸润和呼吸链爆发导致肺组织过度炎症反应和损伤，并诱导瀑布式级联放大作用。对于严重呼吸道病毒导致的ARDS，趋化因子CXCL10及其受体CXCR3轴是肺组织损伤和ARDS进行性加重的关键，它通过自分泌的方式促进肺组织浸润的中性粒细胞呼吸链爆发，从而导致肺部炎症的急剧加重。
(2)病毒导致ARDS的临床研究或流行病学调查：
2008年，由中国疾病预防控制中心牵头的、全国多个省份疾病预防控制中心参与的一项回顾性研究显示，在26名H5N1感染病人中，21人(80.8%)符合ARDS的诊断。2009年暴发的H1N1中，由澳大利亚和新西兰完成的多中心、大样本量研究显示，在纳入的722名确诊H1N1感染病人中，336人出现病毒性肺炎和(或)ARDS(48.8%)。浙江大学附属第一医院李兰娟院士和广州医科大学附属第一医院钟南山院士发表于2013年的一项研究则显示，111名H7N9感染病人中，71.2%病人达到ARDS诊断标准。
5.非典型病原体与ARDS
非典型病原体感染也是ARDS的病因之一，主要包括肺炎支原体、肺炎衣原体、嗜肺军团菌等。其中对嗜肺军团菌致ARDS的研究相对较多，其侵袭肺泡上皮、诱导肺泡上皮细胞凋亡可能是最主要的病理生理学改变。嗜肺军团菌与肺泡上皮细胞黏附和肺泡上皮细胞的凋亡可进一步促进嗜肺军团菌肺内和全身播散，并导致肺泡上皮细胞释放HMGB-1等分子，形成级联性放大，最终导致持续性低氧血症。
（二）DAMPs与ARDS
除感染外，组织损伤释放的DAMPs和其他生物分子也参与了ARDS的发生，比较多见于严重多发伤、多次输血等原因导致的ARDS。目前对ARDS相关DAMPs研究比较多的包括细胞外基质成分(如纤连蛋白、透明质酸等)、应激反应相关分子(如热休克蛋白、HMGB-1等)、免疫调节分子(如部分防御素家族分子、表面活性蛋白A等)、线粒体相关DAMPs(mitochondrial DAMPs，MTDs)和尿酸等。
HMGB-1和MTDs是目前研究相对集中的部分。研究显示，HMGB-1在失血性休克病人外周血中显著增加；HMGB-1气管滴入可导致ARDS发生，该过程主要依赖于TLR2/TLR4相关通路，导致NF-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)核转运增加、ROS产生和多种细胞因子分泌增加。此外，HMGB-1可能与糖化终末产物受体(receptor for advanced glycation end product，RAGE)存在相互作用，促进肺通透性增加。
MTDs主要包括线粒体DNA(mitochondrial DNAs，mtDNAs)、线粒体甲酰肽(formyl peptides，fMLPs)、细胞色素C和线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A，TFAM)等。Zhang等人研究证实，MTDs在创伤病人外周血中显著增加，尾静脉注射MTDs可导致肺组织和全身炎症反应以及肺损伤的发生。最近的一项研究则显示，长期保存的血液制品中mtDNAs和细胞色素C的含量显著增加，这可能是输血相关ARDS的发病机制之一。
二、ARDS生物致病原与机体免疫防御
机体的免疫防御功能包括固有免疫和适应性免疫。固有免疫是非特异性免疫，在微生物感染的早期可以快速、广泛启动；适应性免疫包括以抗体为核心的体液免疫和以T细胞为核心的细胞免疫，为特异性免疫，可以识别不同病原体的特异性抗原，具有记忆性。固有免疫是适应性免疫的基础，同时对各种病原体导致的过度炎症反应有一定的相关性。肺组织的固有免疫机制十分健全，支气管杯状细胞分泌的黏液和上皮细胞的纤毛是清除颗粒和致病原的重要物质，其中还含有β-防御素、溶菌酶等物质。部分到达下呼吸道和肺泡的微生物可以被肺泡巨噬细胞识别和吞噬。在严重的肺部感染中，呼吸道上皮细胞和肺泡上皮细胞的屏障功能可以抑制感染的扩散，肺泡巨噬细胞和中性粒细胞等吞噬细胞、活化的树突状细胞、体液中补体、溶菌酶和防御素等成分、特异性免疫的抗体和T细胞免疫等均参与病原体的清除；此外，对于肺炎军团菌等胞内寄生菌，T细胞免疫是主要的防御机制。其中非特异性免疫开始时间早，并且与肺组织过度炎症反应相关。
PRRs介导的病原体识别在固有免疫中起到了关键的作用。PRRs主要包括3类，即TLRs、NLRs和RI革兰氏阴性I样受体(RIgram-negative I-like receptors，RLRs)，此外还有一类细胞质中识别DNA的分子也具有PRRs类似的功能。这些PRRs在肺泡巨噬细胞、肺内多种上皮细胞、肺间质的树突状细胞、中性粒细胞和内皮细胞等中均有表达，它们是识别生物致病原的第一道防线，同时可进一步募集其他免疫细胞。PRRs识别的主要是感染相关的PAMPs和细胞损伤相关的DAMPs。在ARDS中研究得最为透彻的是TLRs及其相关配体，NLRs和RLRs的研究相对较少。
目前在人类中主要发现了 10种 TLR亚型，TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TLR10主要定位于细胞膜，TLR3、TLR7、TLR8、TLR9主要位于细胞质中，其中关于TLR10的研究相对匮乏。细胞膜上TLRs在细胞外细菌的识别中尤其重要，对细胞内细菌的清除也有一定的作用；定位于细胞质的TLRs在病毒感染中起到关键作用，同时对细胞内细菌的清除也有重要作用。
TLRs主要包括3个结构域，分别为细胞外的富含亮氨酸重复序列(leucine-rich repeat，LRR)、跨膜区和细胞内的Tool/IL-1受体同源序列(toll/IL-1 receptor homology，TIR)，LRR主要识别相应的配体，可以形成同源或异源二聚体；TIR主要通过与其他蛋白质分子相互作用，将信号向下传导。TLR3和部分内涵体上的TLR4主要通过TRIF(TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β，TRIF)向下传导信号，而其他的TLRs主要通过MyD88向下传导信号，其中部分需要TIRAP[toll-interleukinⅠ receptor(TIR)domain containing adaptor protein，TIRAP]介导。TLRs及其下游某些分子在病原体识别、清除和炎症反应中起到重要作用。
NLRs可识别的配体范围广泛，某些PAMPs可通过NOD或TLRs促进炎性体相关组分的转录增加，促进炎性体的激活和IL-1家族的产生。RLRs主要识别病毒RNA，进一步促进细胞对病毒的清除。巨噬细胞识别相应PAMPs被激活后，细胞内一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase，NOS)表达和活性均增加，导致细胞NO-2和NO-3产生增加，一方面捕获、吞噬和杀伤细胞外细菌；另一方面产生和释放TNF、IL-1、IL-6、IL-8等炎症因子和多种趋化因子，诱导中性粒细胞向肺组织趋化，同时处理相关抗原后呈递给淋巴细胞，促进适应性免疫反应。但是，上述炎症反应失控和过度中性粒细胞趋化又可加重肺组织损伤。
中性粒细胞溶酶体内含有髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、蛋白酶、弹性蛋白酶等，具有极强的吞噬功能，吞噬相应病原体形成的内体与溶酶体结合，形成次级溶酶体消化和清除病原体。在感染导致的ARDS中，中性粒细胞还可释放中性粒细胞诱捕网络(neutrophil extracellular traps，NETs)，进一步增加对病原体的捕获和杀伤，其主要成分包括网状的DNA骨架、多种组蛋白组分、弹性蛋白酶、MPO、组织蛋白酶G和杀菌/通透性增强蛋白(bacteriacidal/permeability-increasing protein，BPI)等多肽类物质，在体外仍具有病原体捕获的功能。除此之外，NETs又可进一步促进中性粒细胞与血小板、内皮细胞相互作用，促进内皮细胞损伤，导致肺损伤和肺组织通透性增加，促进ARDS发生。
最近关于肺组织免疫和炎症调控的研究显示，IL-17在肺组织固有免疫调节中起到关键的作用，是感染转归的关键因素。IL-17可由多种免疫相关细胞分泌，其中既包括固有免疫细胞(γδT细胞、自然杀伤T细胞等)，也包括适应性免疫细胞(部分CD4+T细胞，即Th17细胞)。肺组织细胞识别病原体后，可趋化多种IL-17合成细胞，后者聚集到肺组织后合成和释放IL-17，促进中性粒细胞向肺组织趋化。多项关于哮喘和肺纤维化的研究显示，NLRs炎性体的活化可以促进IL-17合成增加，而甲型流感病毒介导的RLRs受体激活可抑制IL-17的合成，增加小鼠继发性细菌感染的风险。ARDS临床研究也显示，与病毒感染诱导的ARDS相比，细菌感染导致的ARDS病人外周血中IL-17浓度更高，这表明IL-17在细菌感染的免疫防御和炎症反应中起到重要的调控作用。
对于不同的生物致病原，机体的免疫防御机制不同，目前对于调控肺组织免疫反应和过度炎症反应的机制尚不十分清楚，对其中的关键调控分子仍需进一步的研究。
三、非生物病因
导致ARDS的非生物病因主要包括机械通气(不当)、酸或毒性气体吸入、烟雾吸入、过量摄入药物、淹溺损伤等。非生物因素除了直接导致肺损伤外，还可间接通过相关生物因素导致ARDS的发生和加重。
呼吸机相关急性肺损伤(ventilator-associated lung injury，VALI)是机械通气的并发症之一，由呼吸机相关物理作用导致的肺组织损伤是ARDS的重要原因，部分学者也将VALI视为重症病人ARDS二次打击模型中的第二次打击。高潮气量和高通气压力导致的肺组织损伤(容量伤和气压伤)与其他原因导致的肺损伤非常类似，对正常肺组织机械通气可以增加其通透性，对于已经存在损伤的肺组织，机械通气可显著增加肺组织损伤的程度。VALI中，肺泡过度膨胀可导致肺组织损伤，同时机械通气下肺泡反复开放和关闭导致的剪切力也是VALI的重要原因之一。
有毒气体一般按照其化学性质分为两大类：高水溶性刺激性气体(如氯气、氨气、二氧化硫等)和低水溶性刺激性气体(氮氧化物、光气、硫酸二甲酯等)。有毒气体吸入导致ARDS的病程一般包括刺激期、潜伏期、肺水肿期和恢复期。一般吸入高水溶性气体者起病比较迅速，吸入低水溶性刺激性气体者起病相对较慢。这些有毒气体一般可以直接损伤肺泡组织，使其产生大量分泌物并诱导继发性的过度炎症反应，进而影响氧气的吸入和弥散，造成呼吸功能障碍，出现低氧血症，形成ARDS。部分气体与水结合后，可形成多种酸性物质和过氧化类物质，这些物质也可导致肺泡表面活性物质破坏、肺泡上皮细胞损伤和进一步的炎症反应。以氯气为例，氯气与水结合后可产生次氯酸和氯酸，次氯酸和氯酸可以导致肺泡表面活性物质的破坏；此外，氯气还可导致肺泡上皮细胞ROS产生增加，进一步加重细胞损伤和炎症反应。同时，氯气暴露还可增加肺组织继发性真菌感染的风险。
烟雾吸入相关急性肺损伤(smoke inhalation-associated acute lung injury，SI-ALI)在火灾等情况下比较常见。烟雾吸入导致ARDS病人可伴/不伴重度烧伤，我国大约8%烧伤病人伴有吸入性肺损伤。吸入烟雾后，受损支气管血流量可增加20倍以上，同时由于组织通透性增加，大量血浆渗透入肺组织导致纤维素沉积，与肺组织细胞碎片和黏蛋白等结合，形成纤维性假膜，阻塞部分气道，导致通气/血流比例失调，促进远端气道和肺泡上皮细胞的损伤，而机械通气可能会进一步加重这种损伤。此外，烟雾中毒性气体和直径<5μm的颗粒也可直接损伤远端气道和肺泡上皮细胞。
过量药物、饮酒、全身麻醉、脑卒中等情况下，误吸胃酸至肺组织形成吸入性肺炎，严重者最终会导致ARDS的发生，胃酸误吸可占全部ALI病因的10%左右。胃酸误吸可迅速导致肺泡上皮的破坏和肺泡上皮-毛细血管屏障通透性的增加，局部可发生凝固性坏死，随后中性粒细胞浸润显著增加，肺泡腔和间质中均可见大量中性粒细胞浸润，肺组织出现出血和透明膜形成，部分病人可发生继发性肺部感染。近年研究显示，血小板在胃酸误吸和脓毒症ARDS的中性粒细胞浸润中起到关键作用。Zarbock在动物模型中观察到，肺组织和外周血中血小板通过P-选择素依赖途径与中性粒细胞结合，促进内皮细胞合成细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)，促进中性粒细胞与内皮细胞的黏附和肺组织通透性的增加。这种相互作用还伴随局部血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)合成和释放增加，促进微血栓的形成。同时，研究人员也发现，如果抑制血小板和中性粒细胞的结合，肺损伤几乎可被完全消除。这些结果提示，在脓毒症和胃酸误吸导致ARDS中，血小板和中性粒细胞的激活可能是关键的发病机制，具有较大的转化意义。
四、病因模拟的实验室造模
常用动物包括小鼠、大鼠、兔、犬、猪等，由于特性不同，使用范围略有不同。小鼠和大鼠繁殖快、来源容易、便于操作、价格低廉、抗体等试剂来源充足，是在大样本实验、需要进行多样本重复实验和分子机制研究时的常用选择。兔性格温顺、便于操作，但体质较弱。犬和猪属于大型动物，对手术的耐受性好且更接近于人体，可适用于多种ALI/ARDS模型，但价格较高、使用药物剂量较大、相关试剂相对匮乏等。
ARDS病因分为肺内因素(直接)和肺外因素(间接)两大类，为模拟ARDS的发病机制，常用的动物模型也可分为原发性ALI动物模型(肺内因素)和继发性ALI动物模型(肺外因素)。原发性ALI动物模型包括：LPS气管滴入/雾化吸入、病原体气管滴入/雾化吸入、盐酸气管滴入、整肺灌洗、磷脂酶 A2(phospholipase A2，PLA2)气管滴入和TNF-α/IL-1β气管滴入等。继发性ALI动物模型主要包括：腹腔注射或静脉注射LPS、盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)、急性胰腺炎模型、缺血再灌注模型(肠、肺等)、油酸/脂肪静脉注射、佛波醇十四酸乙酸盐(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)静脉注射等。此外根据实验设计不同，常用的ALI/ARDS动物模型一般包括 “一次打击”和 “两次打击”，其中以 “一次打击”模型最常见。
（一）动物模型
1.原发性动物模型
(1)LPS气管滴入/雾化吸入：
常用的动物是大鼠和小鼠。气管滴注由于不需要相应的雾化仪器，相比雾化吸入更为常用，但滴入液体一般难以达到均匀分布。依据是否暴露气管，气管滴注法具体分为非暴露式和暴露式两种。
具体方法：非暴露式气管滴注法是将滴注用的导管通过喉部插入气管内进行滴注；暴露式气管滴注法是指在实验动物的颈腹面切个小口暴露出气管，用针头直接刺入气管进行滴注。气管滴注一般按3～10mg/kg滴注，滴注体积不超过1ml/kg(小鼠)和3ml/kg(大鼠)，按需要配制相应浓度的LPS溶液。部分研究可能采用单侧肺组织滴注，可采用0.4mg/kg LPS。雾化吸入需要相应的雾化器，剂量同前，经气管插管，将雾化的内毒素吸入大鼠肺内。
(2)病原体气管滴入/雾化吸入：
常用的细菌为大肠埃希菌，基本操作同前。
具体方法：气管内滴入大肠埃希菌标准菌株悬液或者嗜肺军团菌悬液。
(3)盐酸气管滴入：
该模型能够较好地模拟胃内容物反流误吸所致的ARDS。盐酸吸入后既可直接损伤支气管肺组织、肺泡-毛细血管膜，还可诱发肺内化学性炎症，从而导致肺水肿和中性粒细胞浸润。
具体方法：采用大鼠气管滴入0.1ml盐酸(1ml/kg)构建ARDS模型。
(4)整肺灌洗：
该模型主要用于模拟溺水后ARDS的发病，也可作为评估肺表面活性物质替代等治疗方法的ARDS动物模型。反复的整肺灌洗可造成肺表面活性物质缺乏，能够有效模拟溺水后由于表面活性物质缺乏所导致的急性肺部损伤。
具体方法：采用37℃生理盐水，按10～25ml/kg(猪、兔等大型动物)或1ml/kg(鼠等小型动物)灌洗整肺，约1分钟后回收，每间隔1～10分钟灌洗一次，一般灌洗5～8次后检PaO2/FiO2可满足ARDS诊断标准。
(5)呼吸机相关ALI：
一般采用大潮气量机械通气诱导肺组织损伤。
具体方法：对于小鼠采用V T 40～44ml/kg，PEEP 0cmH2O，RR 30～35次/分，FiO2 0.21参数，通气时间3小时。
2.继发性ARDS动物模型
(1)静脉/腹腔注射LPS：
可以用于模拟非肺源性脓毒症、腹腔感染导致的ARDS，也是目前常用的ARDS动物模型之一。大鼠、小鼠、兔、犬、羊和猪等动物均可使用。
具体方法：一般注射剂量：大鼠(250g左右)用内毒素1.5mg/kg；家兔(2.5kg左右)用内毒素0.6～0.8mg/kg；犬(18～23kg)用内毒素1.5mg/kg。
(2)盲肠结扎穿刺(CLP)动物模型：
这是脓毒症的经典动物模型之一和 “金标准”，也常用于ARDS的建模，可用大鼠或小鼠等实验动物。
具体方法：术前禁食8～12小时，腹腔内注射1%氯胺酮10ml/kg，麻醉成功后，取腹部正中2cm切口，将盲肠远端与大肠系膜分离，游离盲肠，结扎盲肠游离端2/3长度，12号针头在结扎端贯通穿刺，可挤出少许肠内容物，置回腹腔，逐层缝合腹壁切口，术后立即皮下注射生理盐水1ml(小鼠)或10ml(大鼠)，补充术中液体丢失；同时肌注青霉素2万单位/只，预防切口感染。CLP动物平均生存时间约为3天；术后24小时病死率约为20%，动物术后24～48小时为死亡高峰期，至7天病死率为80%～90%。假手术组动物应在7天内无死亡。
(3)急性胰腺炎ARDS：
ARDS是急性胰腺炎的常见并发症之一，胰腺、炎症细胞以及胰腺外其他器官可以产生炎症介质进入血液系统，激活血液中的白细胞，诱发肺内炎症反应，最终导致ARDS的发生。
具体方法：给大鼠胰管内注射4%的牛磺胆酸钠0.5ml或给兔静脉注射1000U/(kg·h)PLA2和5000U/(kg·h)胰蛋白酶，诱导胰腺炎发生。
(4)其他：
如失血性休克(hematogenic shock，HS)ARDS、脂肪栓塞ARDS等也是研究中常用的动物模型，失血性休克模型一般采用心脏穿刺方法，脂肪栓塞模型一般采用油酸，在此不做赘述。
除以上介绍的几个动物模型外，还有其他的ARDS动物模型分别用于模拟不同的病因，常用的 “两次打击模型”为HS+CLP/LPS、CLP/LPS+机械通气、LPS+LPS等，根据不同的实验设计可采用不同的方法，对于采用 “两次打击”ARDS模型的操作不做进一步介绍。此外，目前关于造模方法的细节方面，不同的研究之间可能有部分出入，如给药剂量和方式、动物体重等，研究者还需一定的预实验进行摸索。
（二）细胞模型
ARDS常用的细胞模型包括肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cells，PMVEC)、人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)、人单核-巨噬细胞(THP-1)、人肺泡Ⅱ型细胞(A549细胞)、骨髓来源巨噬细胞(bonemarrow-derived macrophages，BMDM)、中性粒细胞、小气道上皮细胞(small airway epithelial cells，SAEC)和人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial cells，HBE)等。按照不同的实验设计，可以采用相应的处理，如LPS刺激、缺氧处理、多种DAMPs处理等。
1.肺微血管内皮细胞(PMVEC)
培养难度较大、研究成本较高，目前使用有一定的限制。常用细胞来源包括人源、鼠源和兔源，用于研究ARDS中肺血管内皮细胞在肺组织通透性和损伤、肺部炎症反应、中性粒细胞浸润等病理过程中的作用。在研究内皮细胞通透性时，常要用到不同孔径的Transwell，然后分别在上室和下室中加入培养基继续培养，待细胞融合成致密单层后再进行下一步实验。
2.人脐静脉内皮细胞(HUVEC)
常用于模拟脓毒症中内皮细胞和ARDS中的肺血管内皮细胞。HUVEC相对比较难培养，一般推荐在培养基中加内皮细胞生长补充物(endothelial cell growth supplements，ECGS)及肝素，传代一般不超过10代，否则细胞容易发生变性。
3.人单核-巨噬细胞(THP-1)
常将THP-1采用PMA诱导分化为巨噬细胞，模拟肺泡巨噬细胞进行相关研究。一般采用PMA处理方法：将正常培养的THP-1细胞离心后，将沉淀以含100nmol/L PMA的1640培养基重悬，计算细胞浓度为106 cells/ml，将细胞接种于6孔板中，每孔2ml，一般12～24小时后细胞可贴壁生长，分化为巨噬细胞，再吸出上清液体，以1640培养基轻轻冲洗2遍，更换为含10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的1640培养基，置于37℃和5%CO2气体浓度适度的培养箱中培养24小时，可用于后续实验。
4.A549人肺泡Ⅱ型细胞
A549属于传代细胞系，可稳定地传代培养，一般用于模拟ARDS中肺泡上皮细胞。一般实验用细胞密度为105 cells/ml，培养至细胞交汇后(大约铺满80%培养皿面积)做进一步处理。
5.骨髓来源巨噬细胞(BMDM)
一般为鼠源的原代细胞，从小鼠骨髓提取。提取方法：脱颈处死小鼠，将小鼠后肢的皮毛剥至足部，连同褪下的皮毛剪去足部，剪下后腿，放入盛有无菌磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)的培养皿中，镊子夹住腿骨一端后，用剪刀剔除肌肉，在关节处剪断腿骨，用2ml注射器吸取无血清的1640培养基，将针头刺入骨髓腔，反复冲洗骨髓至骨髓变白，将骨髓冲洗液加入到50ml离心管中，1000r/min离心5分钟，将离心得到的骨髓细胞用10ml含巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，MCSF) (50ng/ml)和血清的1640培养基重悬，然后分装到两个25cm2的细胞培养瓶中，置于37℃和5%CO2气体浓度适度的培养箱中培养3天，弃上清，换5ml含MCSF(50ng/ml)和血清的1640培养基继续培养4天。
6.中性粒细胞
一般中性粒细胞需要由外周血中提取，目前有商品化中性粒细胞分离试剂盒，也可采用传统的Percoll法、Ficoll-Hypaque法等，其中Percoll法最常用，其分离中性粒细胞效率和所得细胞的存活率均较好。需要注意的是，分离所得的中性粒细胞一般保存于4℃冰箱内，2小时以内进行下一步实验。如果来自不同的动物模型或临床疾病标本，则可置于培养箱中进一步培养。
（吴冠楠 胥武剑）
第二节 ARDS遗传分析与易感性评价
流行病学研究显示，美国每年有190 000例新发ARDS病例。既往的流行病学研究还发现，即使是相同生理状态下的病人，其发生ARDS的风险、疾病严重程度和预后均存在很大差异。尽管ARDS不属于遗传性疾病的范畴，目前主流观点认为基因异质性、多态性是导致上述差异的重要因素。
现有的研究已经对那些可能与ARDS发病、预后相关的基因多态性展开筛选，并设计队列研究、病例对照研究等在人群中对其中部分基因多态性的作用进行初步验证。目前研究较多的与ARDS相关的多态性基因包括：表面蛋白(surfactant proteins，SPs)、血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)、 促炎细胞因子(TNF-α/β)、IL-6、IL-8、前B细胞集落增长因子(pre-B cell colony-enhancing factor，PBEF1)、巨噬细胞游走抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、抗炎细胞因子(IL-10)。此外，亦有一些少量的研究报道肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase gene，MYLK)、固有免疫受体(CD14)、甘露糖结合凝集素(mannose-binding lectin，MBL)、核转录因子、转录抑制因子等相关的编码基因多态性与ARDS风险或预后相关。众所周知，ARDS发病机制与内皮损伤、上皮损伤、细胞因子介导的炎症及损伤、中性粒细胞介导的损伤、氧化性损伤、机械通气相关损伤、凝血与纤溶通路等相关，因此，不难理解目前报道的ARDS相关候选基因也大多集中于上述通路。
一、炎症细胞因子基因多态性
细胞因子系由包括免疫细胞、内皮细胞、神经细胞等在内的不同种类细胞产生的肽类物质，可调节多种不同的病理生理过程，如免疫、炎症、不同生理状态下的细胞应答，充当细胞-细胞间相互作用的信使。既往研究显示，包括TNF、IL-6等促炎细胞因子以及抑炎细胞因子IL-10在内的多种经典的炎症相关细胞因子的基因多态性与ALI/ARDS发病风险、预后相关。
TNF为促炎细胞因子，通过促进其他炎症细胞因子的释放，参与ALI/ARDS的病理生理过程。Gong等人研究报道，TNF-308GA杂合子的检出率在高加索ARDS病人中显著升高，且与年轻病人60天死亡风险升高呈正相关；此外，Li等人报道，在重庆地区汉族人中，ALI病例组TNF-α(-308A)等位基因频率显著高于健康对照组。Azevedo等人在巴西儿童病人中展开的基因多态性研究则显示，TNF-308GA基因型、TNF-308A等位基因携带对脓毒症性ARDS具有保护性抵抗作用，TNF-863CA基因型、TNF-863A携带人群其发生ARDS风险升高。
IL-6可激活T、B淋巴细胞，在炎症反应中发挥重要的促炎介质作用。关于IL-6基因多态性与ARDS风险、预后间相关性的研究结果还存在争议。Martín-Loeches等人的研究提示，在西班牙白种人CAP病人中，IL-6-174GG基因型携带对ARDS具有保护性抵抗作用；而Marshall等人在高加索人群中展开的研究则显示，在ARDS病人中，IL-6-174C等位基因、IL-6-174CC基因型的检出率均较对照组显著降低，P值分别为0.023和0.035，这似乎又提示IL-6-174GG基因型与ARDS发病风险升高相关；而另外的两项研究则提示IL-6-174SNP与ARDS易感性之间无显著相关性。因此，这也表明IL-6基因多态性在ALI/ARDS的发生、发展中起非常复杂的作用，还需要进一步研究。
IL-10可抑制多种促炎细胞因子表达，该基因5'侧翼区存在多个基因多态性位点，其中-1082GG基因型与IL-10高表达显著相关。进一步的遗传易感性分析显示，中国人群中携带IL-10-1082GG基因型亚组人群发生ARDS风险、病死率均低于其他基因型病人；而该基因多态性与高加索人群ARDS风险之间的相关性目前还存在争议。
此外，新近的研究还发现：炎症刺激固有免疫细胞(特别是中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞)，可显著诱导PBEF1的表达。PBEF1通过炎症免疫、氧化应激以及细胞凋亡等多种途径参与ARDS的病理生理过程，关于该基因启动子区单核苷酸多态性与ALI/ARDS的相关性研究显示，在高加索人群中，携带GC(SNPs T-1001G、C-1543T)单倍体的个体发生ALI风险显著升高，而TT单倍体则具有保护性作用；在中国东北部汉族人群中，PBEF-1543T等位基因、TT基因型的检出率在ALI病人组均显著低于健康对照人群组，提示-1543T等位基因可能是一个抵抗ALI/ARDS的保护性因素。
IL-8是一个重要的趋化因子，研究显示该基因启动子区-251位点存在功能性的单核苷酸多态性，即IL-8-251A/T多态性，其中-251AA基因型与IL-8高表达显著相关。而在高加索严重创伤、脓毒症休克以及体外循环手术(cardiopulmonary bypass，CPB)病人遗传易感性分析显示，-251AA基因型亚组病人其 PaO2/FiO2<200的发生率显著高于-251AT、TT亚组人群；A/A基因型亚组病人的机械通气持续时间显著高于T/T基因型亚组病人。这似乎提示IL-8-251AA基因型与ARDS严重程度呈正相关。
关于细胞因子受体多态性与ALI/ARDS之间的相关性亦受到众多关注。Song等人在中国汉族人群中展开的研究显示，肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNF receptor-associated factor 6 gene，TRAF6)基因多肽性TRAF6 rs4755453中C等位基因携带率在脓毒性ALI病人组中显著升高，提示TRAF6 rs4755453C等位基因与脓毒性ALI高发生风险相关。Pino-Yanes等人在西班牙人群中开展的病例对照研究则显示，IL-1受体相关激酶3基因(interleukin-1 receptor associated kinase3，IRAK3)多态性rs10506481与脓毒症病人ALI发生相关。此外，有研究者关注IL-1受体拮抗因子(IL-1 receptor antagonist，IL-1RA)基因多态性对ALI/ARDS易感性的影响。Patwari等人在社区获得性肺炎(community-acquired pneumonia，CAP)患儿中开展的前瞻性队列研究中，共纳入850名CAP患儿，其中有44名病人被诊断为ALI/ARDS，统计结果显示，IL-1RA基因内含子2区A1等位基因缺失，与CAP诱导ALI/ARDS的发生相关。Meyer等人在欧洲高加索人群中的研究显示，IL-1RA基因SNPrs315952与低ARDS发病风险相关。
二、内皮细胞、上皮细胞介导ARDS相关基因多态性
众多体内、体外研究均证实，肺内皮细胞屏障功能障碍在ALI/ARDS的发病机制中发挥重要作用。
由MYLK基因编码的非肌内皮细胞肌球蛋白轻链激酶(nonmuscle endothelial cellmyosin light chain kinase，ECMLCK)与细胞骨架重排密切相关，参与细胞凋亡、炎症、细胞转移、细胞分布以及血管生成等多种生理、病理过程。而在ALI/ARDS时，肺组织微血管内皮的损伤会直接导致肺水肿的形成，该病理过程与MLCK依赖的细胞骨架重排相关。Gao等人通过检测脓毒症病人、脓毒症性ALI病人以及健康人群的MYLK基因，发现51位点具有单核苷酸多态性，并且-rs820336基因G/A多态性与ALI/ARDS发生风险显著相关，在欧洲裔病人人群中，-rs820336GG基因型携带者其发生 ALI/ARDS的风险较-rs820336AA型基因携带者高5倍；而在非洲裔病人人群中，-rs820336AA基因型携带者发生ALI/ARDS的风险较-rs820336GG型基因携带者高18倍。Christie等人在创伤病人中发现，MYLK基因多态性与ALI/ARDS的发生显著相关。
VEGF具有丝裂原作用，可促进血管内皮细胞的增殖；另一方面，又作为内皮祖细胞的趋化因子，在内皮祖细胞的移行过程中发挥重要作用，从而在ALI/ARDS的修复期病程中发挥重要作用。关于VEGF基因多态性研究显示，VEGF+936C/T SNP与高ARDS易感性相关，VEGF+936TT、+936CT+TT基因型均与高ARDS病死率相关。
肾素-血管紧张素系统激活可影响肺血管紧张度和通透性，影响成纤维细胞、肺泡上皮细胞及血管内皮细胞的生存，故在ARDS病理生理过程中发挥重要作用。ACE是该系统的关键酶，人类ACE编码基因位于17g23染色体上，包含有一个287bp的alu重复序列，依据此序列的存在与否将ACE基因分为插入型(D)和缺失型(I)。ACE基因I/D多态性与机体外周血液循环中ACE表达水平、ACE酶活性显著相关，对ALI/ARDS患病风险、疾病严重程度及预后均有显著影响。HU等人针对6项关于ACE基因I/D多态性与ARDS患病风险之间关系进行meta分析(共514名ARDS病人，2619名对照人群)，合并数据meta分析显示，ARDS病人组ACE D/D基因型的检出率显著高于对照人群；根据人群种族进行的亚组分析提示，在高加索ARDS病人中，ACE D/D基因型检出率显著高于对照人群；而在其他人群(亚洲人群)亚组分析中，ACE I/D基因多态性检出率无显著差异性。ACE I/D多态性对ALI/ARDS发病风险的影响可能与人群种族、遗传背景不同相关。Matsuda等人针对ACE I/D多态性对ALI/ARDS病人预后的meta分析总共纳入7项相关研究，包括532名ALI/ARDS病人、3032名健康对照、1432名非ALI/ARDS病人，结果显示，在亚洲人群中ACE I/D多态性与ALI/ARDS病人死亡风险相关，而在高加索人群中该基因多态性与ALI/ARDS预后无显著相关性。
相关研究关注血管紧张素2编码基因多态性与ARDS风险之间的相关性。Su等人在一项纳入了1529名具有ARDS危险因素的美国危重症病人的病例对照研究中显示，Ang-2编码基因tSNP(rs2515475)中的T等位基因与高ARDS发生风险相关；携带Ang-2基因tSNP(rs2515475)TT单体型的病人其发生ARDS风险较对照组显著升高。由此可见，Ang-2基因多态性与高ARDS风险显著相关。
由Ⅱ型肺泡上皮细胞合成的肺泡SP-B，可降低肺泡表面张力，防止肺泡塌陷，在ALI/ARDS病程中起到保护性抵抗疾病进展的作用。SP-B编码基因外显子4的第1580个核苷酸多态性(C/T)可导致 SP-B蛋白第 131个氨基酸从苏氨酸变成异亮氨酸(Thr131Ile)。关于SP-B基因多态性与ALI/ARDS遗传易感性的研究则提示，在具有ARDS危险因素的女性病人中，携带变异性SP-B基因亚组病人发生ARDS的风险显著高于野生型SP-B基因携带亚组人群；此外，Currier等人在214名高加索ARDS病人人群中开展的一项前瞻性队列研究亦提示，携带变异性SP-B基因亚组ARDS病人其60天死亡风险显著高于野生型SP-B基因携带亚组；而在成人CAP病人人群中，SP-B+1580CC、TC、TT基因型亚组中ARDS的发生率分别为8.5%、3.8%、0.5%，三组之间具有统计学差异，提示SP-B+1580CC等位基因与成人CAP病人高ARDS发病风险相关。
三、Toll样固有免疫受体及信号分子基因多态性
Toll样受体是机体识别病原微生物的重要模式识别受体，其基因多态性将影响个体对感染性疾病的易感性。TLR1基因多态性与机体应答病原体相关分子时所表现出的全身过度激活的炎症反应相关，并且与脓毒症性多器官功能障碍、ALI/ARDS发生风险相关。Wurfel等人在一项纳入1183名脓毒症、脓毒症休克病人的研究中发现，TLR1-7202GG基因型携带者其发生ALI风险较TLR1-7202AA、AG基因型携带者高3.4倍；Pino-Yanes等人在欧美高加索人群中展开的研究亦显示，TLR1-7202GG基因型与脓毒症病人ALI发病率高相关，还与脓毒症病人病死率高相关。
此外，编码Toll样受体通路衔接蛋白基因多态性亦颇受关注。Song等人研究发现，编码衔接蛋白Mal的基因TIRAP多态性与中国汉族人群发生ALI的风险显著相关，该基因多态性rs595209和rs8177375在ALI病人人群中的检出率显著高于健康对照组及单纯脓毒症者组。单元型haplotype AG(rs595209A，rs8177375G)在ALI病人中的检出率也显著高于健康对照组和单纯脓毒症病人组。与健康对照组和单纯脓毒症病人组对比，单元型haplotype CA(rs595209C，rs8177375A)携带者其发生ALI的风险较低。由此可见，TIRAP基因多态性可能与中国汉族人群中脓毒症诱导ALI的易感性相关。
NF-κB信号转导通路作为多种模式识别受体下游的共同通路，介导多种促炎细胞因子基因转录，在ARDS的发病机制中发挥重要作用。Bajwa等人在高加索ICU病人中进行的病例对照研究显示，在年龄小于65岁的ICU病人组中，NF-κB启动子区-94位点的ATGG碱基对缺失与高ARDS发病风险相关。Adamzik等人的研究亦证实，NF-κB缺失与德国白种人ARDS病人疾病严重程度相关。然而值得关注的是，Wang等人在一项纳入了284名接受体外循环手术(CPB)的中国汉族病人的研究结果提示，NF-κB-94位点基因多态性与CPB术后病人发生ALI/ARDS风险之间无显著相关性。由此可见，NF-κB启动子区-94位点基因多态性对ALI/ARDS发病风险的影响可能还与病人种族相关。
四、氧化因子介导损伤相关基因多态性
转录因子Nrf2是机体应答氧化性损伤病理生理过程中极为重要的调节因子。Marzec等人研究显示，在Nrf2基因启动子区-617 A/C单核苷酸多态性与严重创伤后ALI发生风险显著相关，其中携带Nrf2-617A等位基因的严重创伤病人其发生ALI风险显著升高。NAD(P)H：苯醌氧化还原酶1(NAD(P)H：quinone oxidoreductase 1，NQO1)具有抗氧化酶活性，通过催化多种苯醌类物质的还原反应，抑制氧自由基和ROS的产生，从而保护细胞避免氧化损伤。Reddy等人在264名严重创伤病人中进行的前瞻性队列研究显示，NQO1-1221CA杂合子基因型亚组人群其发生创伤后ALI风险显著低于NQO1-1221CC纯合子基因型人群，提示NQO1-1221C单核苷酸多态性与创伤性ALI高风险相关。
细胞外超氧化物歧化酶(extracellular superoxide dismutase，EC-SOD)亦是一种强有力的抗氧化物质，在调控氧化应激、炎症等病理生理过程中发挥重要作用。Arcaroli等人的研究显示，携带EC-SOD3基因多GCCT单倍体的感染性ALI病人，其需要呼吸机辅助通气以及死亡的风险较低。
五、凝血通路基因多态性
编码凝血通路相关蛋白 [比如蛋白C、纤溶酶原激活物抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)等]的基因多态性与凝血功能紊乱失调相关。Tsangaris等人的研究总共纳入52名ALI/ARDS病人，其中17名病人为PAI-1 4G/4G纯合子，PAI-1 4G-4G纯合子基因型病人28天死亡风险显著高于不携带PAI-1 4G/4G纯合子基因型病人，提示PAI-1基因多态性与ALI/ARDS病人预后相关。
尿激酶基因编码丝氨酸蛋白水解酶PLAU(plasminogen activator urokinase，PLAU)，其可使纤维蛋白溶酶原水解产生纤溶酶，从而在凝血-纤溶平衡中发挥重要作用。Arcaroli等人的研究显示，PLAU基因CGCCCC单倍体与ALI病人60天病死率、无机械通气时间显著相关。
目前关于ARDS遗传分析与易感性评价的候选基因除涉及上述罗列的相关基因之外，亦有少量文献报道，Fas基因、ICAM-1、MIF、控制中性粒细胞弹性蛋白酶活性的肽酶抑制剂3、与肺炎症反应和血管屏障调节相关的鞘氨醇-1-磷酸受体3(sphingosine 1-phosphate receptor 3，S1PR3)等基因多态性与ALI/ARDS疾病易感性、严重程度及预后相关。
虽然目前关于ALI/ARDS基因多态性的研究仍处于前临床阶段，已有的研究结果并不完全一致，我们在分析这些基因多态性与ALI/ARDS之间关系时需特别关注研究对象的筛选标准、种族、对照组的设置及样本量大小等细节。基因信息技术的不断发展将有助于科研工作者不断拓宽ALI/ARDS遗传易感性相关候选基因网络，这将在探讨新的病因学、病理生理机制和优化治疗措施等方面发挥重要作用。
（顾晓凌 胡明冬）
第三节 “不明原因”所致ARDS的病因学研究方法
肺内外感染引起ARDS时，由于涉及病原体种类多，机体对病原体反应多样，不同病原体作用的靶器官不同，临床表现多样，病原体尤其是病毒的分离、培养及鉴定困难等，使得ARDS有时在病因确定上比较困难，甚至有些病人不能明确病因，进而无法对原发病进行针对而有效的治疗，极大影响了ARDS病人的预后。因此，对此类不明原因所致ARDS，找到可靠的病因学研究方法显得十分重要，下述将主要以SARS为例进行阐述。
SARS病人在发病开始时病因不明确，因此治疗也存在极大困难。对其病因，研究之初，全球各地的研究组曾存在过多种推断。最初我国科研人员应用电子显微镜在SARS死亡病人体内发现了衣原体样颗粒，宣布为SARS的病原体。尽管当时国内著名专家钟南山院士并不同意典型衣原体是其病因的观点，但在一段时间内，衣原体观点仍被国内大多数研究者普遍接受。之后，钟南山院士与香港大学微生物系积极合作，从一个感染者的肺组织中分离到一种未知病毒，推测其很可能即为致病原，并于3月25日宣布SARS是来自猪的 “冠状病毒”。WHO的研究网络随即集中对该病毒进行了分析，提到SARS病原体可能是变异的冠状病毒。此后，该研究网络的多个实验室对SARS进行了临床标本、影像学、病理组织、病毒分离培养、血清免疫学诊断、分子生物学与遗传同源性等多方面的深入研究与鉴定；加拿大基因组科学研究中心也完成了该病毒的全基因组测序。最终，WHO在综合分析各个研究成果的基础上，正式宣布一种以前未知的冠状病毒为导致SARS的病原体，并命名为SARS冠状病毒(SARS coronavirus，SARS-CoV)。自此SARS-CoV作为SARS的病原体已经确证无疑，但仍历经几个月的过程，且在最初因忽视临床特征与病因之间的联系，加上采集样本量少，重复率低，对病因发生误判，造成疾病治疗的延误。因此，从SARS病原体的发现过程，可以总结经验，推导出一种病因研究模式。
依据当地流行病学、病人可能的暴露史和临床表现，提出相应的病因假设，并通过以下方面进行取证。
一、临床表现
从临床病史询问、检查和基本化验检查中总结出ARDS病人表现特征，分析确定累及的组织器官及引起的病理改变类型及严重程度。这方面的证据能够明确发生及起始时间、暴露病因种类和方式，为病因调查提供线索。
在病史询问中需进行：①流行病学史的询问：有无聚集性发病；发病前有无与相似病人的接触史；有无动物接触史；发病前所到地域是否有相关的传染性疾病；发病后与之接触的病人是否有类似发病。应注意是否存在特殊职业暴露，如厨师及从事动物饲养、屠宰、销售或加工等工作者；是否在进行病原学检测或研究的单位工作等。②临床特征的询问：应注意起病快慢、病程的长短、热型、病情严重程度、进展速度以及药物疗效。应特别关注呼吸系统的症状，如咳嗽、咳痰、胸痛、咯血、呼吸困难等；注意痰量以及痰液的性状、相关的伴随症状。如果卡他症状明显，则提示为流感等病毒感染；如果出现明显的呼吸系统外症状，如腹泻、腹痛、肌肉酸痛、关节痛、头痛等，则以非典型病原体及病毒可能性大。
体格检查：注意肺内啰音的多少和性质；是否有皮疹、淋巴结肿大及其他脏器受累的表现。
实验室检查方面注意白细胞计数和分类，外周血白细胞对鉴别诊断有一定帮助。一般而言，细菌性肺炎，白细胞多增高，且以中性粒细胞增高为主；无继发细菌感染的病毒性肺炎多数白细胞不高，分类以淋巴细胞增高为主，但少数病毒感染可有白细胞轻度增高，严重的病毒感染、SARS及人禽流感则可出现白细胞降低及淋巴细胞减少。此外，还应注意肝肾功能、降钙素原、C-反应蛋白等，细菌性感染时血清降钙素原水平可明显升高。
影像学检查：了解ARDS时胸片或胸部CT变化及特点，对病因寻找具有重要意义。初始呈现大叶或肺段分布特征可能为肺炎链球菌、肺炎克雷伯杆菌肺炎；双肺弥漫性毛玻璃影可为病毒性肺炎。
二、现场调查
通过到现场调查取证，收集事件发生时现场情况，调查和随访可能暴露人群的健康状况，为确定病因类型，尤其是某些毒物的确定提供进一步诊治方向。
三、实验室研究
可用各种实验室方法对特定的某些病原体进行鉴定，确定可能病因。常用标本有痰液、咽拭子经纤维支气管镜或人工气道吸引的下呼吸道标本、防污染样本毛刷标本、支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)、肺活检标本、血液、胸腔积液、尿液等。
采用的方法有：①血清免疫学诊断：方便且迅速，主要用于非典型病原体或呼吸道病毒抗体的测定。曲霉半乳甘露聚糖抗原试验(GM试验)、1，3-β-D-葡聚糖抗原试验(G试验)、乳胶凝集试验(隐球菌)的检测可用于真菌的诊断。②涂片观察形态学：苏木素-伊红(H-E)法、革兰染色法、Gridly染色法、吉姆萨染色法、Grocott六胺银(GMS)法和过碘酸锡夫(PAS)染色法等。病毒多采用电镜观察。③培养：细菌、真菌、抗酸杆菌、病毒等培养。病毒多采用动物接种、组织培养等方法。④蛋白及核酸检测：多用于病毒。对于某些病因，还可通过实验室方法进行模拟验证，如培养的病毒能够使相同的或相近的宿主产生类似症状；能够从实验感染的宿主体内重新分离到病毒。
根据上述方法初步确定的病因，还需在后续的治疗过程中不断进行评价及验证。随着时间的推移，当另一种诊断能够完全解释病因时，在经过仔细考虑排除可能共同致病的情况下，应当排除原来的病因。对于某些疗效不佳或恢复不彻底的病例应当重新进行评估。对于那些完全恢复的疑似病例，另一种诊断也不能充分解释时，则依旧归类为此病因。
一般是在寻找病因的过程中进行治疗，有些情况下可能始终不能找到确切的病因，但支持治疗的措施是相似的，机械通气的原则也是类似的。
（蒋进军 朱晓丹 宋元林）
第四节 不同病因所致ARDS的转归差异分析
尽管随着危重病诊疗技术的提高，ARDS病死率有不同程度的下降，但总体来说，目前ARDS的病死率仍较高。对1967—1994年国际正式发表的ARDS临床研究进行meta分析，3264例ARDS病人病死率在50%左右。中国上海市15家成人ICU在2001年3月至2002年3月间ARDS病死率高达68.5%。不同研究中ARDS的病因构成、疾病状态和治疗条件的不同可能是导致ARDS病死率不同的主要原因。下面就不同病因所致ARDS转归差异进行分析。
ARDS病因总的可分为肺内因素和肺外因素。①肺内因素：严重肺部感染，胃内容物吸入，肺挫伤，吸入有毒气体，淹溺、氧中毒等；②肺外因素：脓毒症，严重的非胸部创伤，急性重症胰腺炎，大量输血，体外循环，弥散性血管内凝血等。其中前者以重症肺炎最多见，后者以脓毒症最多见，其次为急性胰腺炎。脓毒症和吸入性肺炎所致ARDS的病死率较外伤高，而脓毒症所致ARDS病死率高于吸入性肺炎所致ARDS。但对于肺内外两组所致ARDS病死率，文献报道不一。国外研究发现严重肺部感染等引起的ARDS病死率增高；国内上海市ARDS协作组报道，肺内因素所致ARDS(ARDSp)与肺外因素所致ARDS(ARDSexp)住院期间病死率分别为78%及62.7%；另外国内外多项研究也表明，肺内因素引起ARDS病死率较肺外组高。尽管也有研究报道两组间病死率无明显差异，但国内研究更多倾向于ARDSp病死率高于ARDSexp。当然，肺外ARDS组如果合并感染时，病死率明显升高。两组间以及不同研究之间病死率的差异，可能由于肺内、外因素所致ARDS在肺病理学、影像学、呼吸力学、机械通气策略等方面均有不同所致。
一、病理学差异
ARDSp动物模型研究发现，致病因素激活了肺泡巨噬细胞、中性粒细胞及炎症因子网络，导致了肺内过度放大的炎症反应，造成肺损伤。组织学观察到肺泡上皮细胞结构受损，而毛细血管内皮细胞结构近于正常。ARDSp模型支气管肺泡灌洗(bronchoalveolar lavage，BAL)液中的凋亡中性粒细胞，损伤的Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮细胞，IL-6、IL-8、IL-10等细胞因子的数量均高于ARDSexp模型。这说明ARDSp主要病理改变在肺泡内，即肺泡内充血性水肿、纤维蛋白渗出、中性粒细胞聚集、成纤维细胞增生，而间质改变较轻，这种病理改变通常称为肺实变。相比较而言，ARDSexp动物研究表明：ARDSexp最先受到损害的是肺毛细血管内皮细胞，造成血管通透性增加及肺间质水肿。因此，病理改变主要为肺微血管充血、肺间质水肿、肺泡萎陷和压迫性不张，肺泡腔的结构相对正常。
综上所述，ARDSp的发病主要是肺泡中炎症细胞及炎症因子明显增加，肺泡上皮细胞受损及纤维素渗出，导致肺实变；ARDSexp主要为血中的炎性物质显著增加，毛细血管内皮细胞受累及间质水肿，导致肺泡萎陷和压迫性不张。两者病理学上的差异造成呼吸力学改变差异，对药物治疗及机械通气的治疗反应也有所不同。
二、胸部影像学差异
ARDS病人胸部X线发现，ARDSp肺部阴影密度较ARDSexp高，即ARDSp肺部实变影较多；而ARDSexp肺部多以渗出和毛玻璃样改变为表现。总体上，ARDSp病人肺损伤严重度评分高于ARDSexp。Goodman等人分析了33例ARDS病人的胸部CT，结果发现 ARDSexp的 “磨玻璃样改变”比 ARDSp多，而 ARDSp的 “肺实变”较ARDSexp多。
这些都说明ARDSp肺泡炎症及纤维渗出明显，主要表现以肺实变为主，或实变与毛玻璃样变相当，肺组织密度比较均匀，伴有部分毛玻璃样改变。实变多分布在肺的背侧。ARDSexp以毛玻璃样变为主，少量实变。肺部毛玻璃样改变多分布在近肺门的肺中央区，肺腹侧毛玻璃样改变和实变分布无显著性差异。
三、呼吸力学差异
研究发现ARDSp主要是肺弹性阻力增高，而ARDSexp为肺和胸壁弹性阻力均增高，以后者增加为主。ARDSp因肺实变，导致肺弹性阻力增高明显，肺跨壁压升高，肺气压伤发生率增高。ARDSexp由于腹腔内的病理状态(胃肠道黏膜充血、积液、积气、肠蠕动减慢等有关)导致ARDS发生，腹腔内压力影响胸壁弹性阻力，并且影响膈肌运动、静脉回流、心脏充盈和射血分数等。此外，有研究认为ARDSp肺内分流明显高于ARDSexp；ARDSp氧合指数明显低于ARDSexp。
四、机械通气策略差异
ARDSp与ARDSexp不同的呼吸力学和病理生理特点决定了其不同的机械通气策略，并导致了不同的临床结局。事实上，肺泡萎陷具有较高的再开放机会，而肺泡实变则较困难。所以对以肺泡实变为主的ARDSp，PEEP增加主要导致肺过度膨胀。而对以肺泡萎陷为主的ARDSexp，PEEP增加有利于肺泡复张。
研究发现PEEP增加对ARDSp与ARDSexp弹性阻力的作用不同。在ARDSp，PEEP增加使整个呼吸系统的弹性阻力增加，主要是肺弹性阻力增加，而胸壁弹性阻力并无变化；相反的，在ARDSexp时，PEEP增加使整个呼吸系统的弹性阻力下降，主要是因为肺和胸壁弹性阻力的下降。尽管在ARDSp和ARDSexp时，PEEP增加导致呼气末肺容积增加，但是只在ARDSexp有利于肺泡复张和氧合改善。研究发现，ARDSp病人应用PEEP治疗后，氧合并没有改善，反而出现严重肺组织损害，导致肺泡出血，纤维素渗出。对ARDSexp病人应用PEEP治疗后氧合有改善。此外，动物研究也比较了不同类型的急性肺损伤使用肺泡复张通气，发现静脉注射油酸所致肺损伤(与ARDSexp改变相近)效果好，而气管内滴注细菌所致肺损伤(与ARDSp改变相近)效果不理想。上述研究说明，完全肺实变时应用肺泡复张手法和高水平PEEP效果不一定理想。
在俯卧位通气方面，研究发现ARDSexp组氧合改善明显好于ARDSp，且改善速度较快，尽管两组间总病死率没有区别。其主要机制是，当病人由仰卧转为俯卧位时，坠积性水肿区域的胸膜压力减弱使跨肺压增加，导致ARDSexp病人的压迫性肺不张得到改善，肺的通气血流重新分布，或者使局部跨肺压改变导致氧合的迅速改善。但是对于ARDSp病人，则不会使实变的肺组织立刻得到改善。
综上所述，研究表明ARDSp因广泛肺泡实变，对肺泡复张通气、高PEEP治疗及俯卧位通气的反应欠佳；而ARDSexp病理主要表现为肺泡萎陷及压力性不张、间质水肿，影像学以毛玻璃影及渗出为主，故对上述通气策略反应较ARDSp为佳，但这是否直接影响两组间病死率，不同研究还存在着差异。除病死率之外，其他预后指标，如恢复期肺功能的改变、生活质量等，在肺内型及肺外型之间也存在差别。一般说来，肺外型ARDS病人恢复期，其肺功能的损害要小于肺内型，长期生活质量也较高。
由于之前的研究为非前瞻性随机对照试验，且不同研究ARDS病人临床特征(如性别、年龄等)、疾病严重程度、对ARDS的治疗上都存在差异，造成病死率及预后也不同，故也影响了肺内外组预后的差异，将来亟需设计高质量的随机对照试验，以确定不同病因所致ARDS的转归是否存在差异。
（蒋进军 朱晓丹 宋元林）
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