第三节　麻疹病毒复制

麻疹病毒不具有独立进行代谢的酶系统，只有进入活的易感宿主细胞，由宿主细胞提供合成病毒核酸与蛋白质的原料能源等，才能增殖。病毒增殖的方式是自我复制，即以病毒核酸为模板，在RNA多聚酶及其他必要因素作用下，合成子代病毒的核酸和蛋白质，装配成完整病毒颗粒并释放至细胞外。麻疹病毒复制的过程分为吸附（adsorption）、穿入（penetration）、脱壳（uncoating）、生物大分子合成（biosynthesis）、装配（assembly）与释放（release）五个步骤，又称复制周期（replication cycle）。本节主要描述MV转录和复制的过程，即从病毒与宿主细胞膜融合后开始描述和讨论，重点讲述核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）复合体、参与复制过程的病毒蛋白和宿主因子，根据结构形态来说明两个过程的机制，特别是他们的结构、保守序列、相互作用和调节区域。转录主要依据序列模板、编辑、mRNA的共转录修饰和基因起始状态等来讨论。复制主要依据启动子等顺式作用元件和外源因子对复制的影响等来讨论。另外，本节也介绍了部分MV翻译的相关内容，M-F间UTR结构作用、翻译的调控和修饰等内容。

一、核糖核蛋白

核糖核蛋白（RNP）是指包含有RNA的核蛋白，即将核酸和蛋白质结合在一起的一种形式。RNP复合物是MV感染和转录复制过程的基础结构。

（一）核糖核蛋白特性

RNP在CsCl梯度溶液中密度为1.30g/cm3，包含97%以上的蛋白质，保护RNA不受RNA酶作用。另外，RNP在转录和复制过程中还充当复制模板。早期电子显微镜研究描述麻疹病毒具有多形性，包含大小不等的球形颗粒。感染性缺陷RNP数量还不清楚，这些缺陷RNP既可是全长的，也可能是内部缺失，就像缺陷性干扰颗粒那样影响正常病毒的复制。病毒中也包含正链RNPs，是病毒复制产生子代负链RNPs的重要中间体。超过感染复数（multiplicity of infection，MOI）为0.1的大剂量感染细胞时将获得一定数量的RNP，但其中很多是缺陷型。

尽管细胞中发现不止一种RNP，为简便起见，我们在描述病毒RNA合成后续过程，例如，转录、复制和mRNA翻译时，假设进入细胞的单个RNP包含了全基因组。

除了基因组RNA，RNP还包括N蛋白、P蛋白和较大的L蛋白。RNA依赖RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRp）复合体包含L蛋白和P蛋白，有病毒转录酶和复制酶功能。经负染和电子显微镜，RNP呈现为约长1μm、直径18～21nm、内有5nm内核的螺旋型核壳体。经三维立体重组和低温负染投射电子显微镜，RNP展现了广阔的构象柔性。

（二）RNP从浆膜到细胞内转录和复制位点的运输

病毒的复制与增殖主要定位在细胞核周围，尤其是感染早期。RNP主动聚集到这些区域是否归因于细胞各元件（例如细胞骨架网络）间的相互作用目前还不太清楚。细胞松弛素B能引起细胞去核和严重影响细胞骨架，麻疹病毒在细胞松弛素B处理的细胞中，虽然增殖滴度降低，但仍能生长，提示这些细胞元件虽然有一定作用，但不是必需的。在表达增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）的重组麻疹病毒（MVeGFP）感染星形细胞瘤的研究中，无论何种细胞类型，都没有观察到肌动蛋白、微管蛋白或细胞骨架的波形蛋白成分发生改变，而MVeGFP感染U-251细胞出现了酸性神经胶质蛋白纤维网络破坏[12]。

二、麻疹病毒的转录

在描述麻疹病毒转录和复制的过程中，基因组中的6个转录结构以3′序列为先导编码56个核苷酸的前导序列，并在5′端后跟着一段40个核苷酸的拖尾序列。不同转录结构和编码序列表达出不同大小的蛋白，见表2-1。

（一）RNP相关的病毒和宿主蛋白

1.N/L/P蛋白复合体

RNP由基因组和反基因组RNA及N蛋白组成。与该结构相关的两个蛋白：P蛋白和L蛋白。每个病毒颗粒需要N/L/P蛋白复合体来确保感染力。L蛋白包含RdRp活性，既有转录酶又有复制酶活性。编码P蛋白的基因合成至少两种以上的非结构附加蛋白。

Huber等对P蛋白上的N-P相互作用区域作图[13]，揭示了P羧基端的40%和N特异结合；60%为细胞质中保留N蛋白所需，认为N蛋白的保留归因于和P的特异相互作用。

核蛋白磷酸化及其在病毒生命周期中担当的任务还不清楚。磷蛋白有很多磷酸化位点，位于第86、151和180位的丝氨酸残基被酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化。酪氨酸第110位也被磷酸化[14]。若要对病毒更进一步了解，可以运用时序分析法洞悉磷酸化潜在控制作用，运用反向遗传学研究病毒蛋白磷酸化的功能。

2.C和V蛋白

C蛋白由重叠开放阅读框架（open reading frame，ORF）中P基因mRNA翻译而成。核糖体在P蛋白的ORF 60位，或在C蛋白的ORF 82位启动翻译。C蛋白由186个氨基酸组成，担当感染性因子、抑制Ⅰ型干扰素诱导转录反应和信号的功能。缺乏这些蛋白的病毒突变体也可以在组织培养中成功繁殖。

V蛋白由编辑过的P基因转录产物生成。信号传导及转录活化因子（signal transducers and activators of transcription，STAT）诱导型转录干扰能导致病毒诱导的体内细胞因子抑制和促进STAT1降解。前面的231个氨基酸是P蛋白氨基共同末端，从而分享P的主要磷酸化位点，包括第110位的重要的酪氨酸残基[14，15]。随后的69个氨基酸尾端富含半胱氨酸残基，并包含一个锌指结合域[16]。这区域是由副黏病毒P基因编码的最保守产物之一。V蛋白在小基因组试验中影响报告基因的表达，该说法在其他研究中未被证实。尽管V和C蛋白在这些试验中可能影响基因表达，但是病毒在去除这些蛋白表达的组织培养中生长良好，表明这些蛋白不是RdRp的主要成分。

3.RdRp复合体

RdRp只能利用RNP而不是RNA作为模板。尽管L/P复合体包含了RdRp必需的催化活性，它的活性可能还涉及由宿主细胞蛋白和（或）像微管蛋白样的细胞骨架组件调节，微管蛋白已有促进体外培养RNA合成的报道。RdRp复合体和RNP的相互作用可能包含桥接P蛋白功能，同时含有N和L蛋白结合位点。Rima等试图综合MV蛋白的相互作用（同源寡聚体），各自和选择性宿主因子的相互作用（异源寡聚体），揭示病毒蛋白相互作用的复杂性（图2-5）。此外，尽管RdRp的两种形式可能包含同一种蛋白，但其磷酸化状态可能不同。

4.L蛋白

Poch等确认了6个（Ⅰ-Ⅵ）保守区域。除了Ⅲ区包含有潜在RdRp活性的GDNQ序列外，其他无特别功能。针对麻疹病毒属，分析发现L蛋白里有两个非保守链将其分隔成3个保守区域[18]。第一区（D1）包含了Poch的Ⅰ和Ⅱ区，第2区（D2）包含了Ⅲ，Ⅳ和Ⅴ区，第3区（D3）包含Ⅵ区。后者涉及2-O-甲基转移酶活性结构部分。麻疹疫苗株和流行株的L蛋白序列比较证实：存在基因型不同但是未发现功能性差异，该研究不能鉴定疫苗株和流行株间的差异变化。

（二）转录过程

麻疹病毒基因组6个结构基因为3′-N-P（V/C）-M-F-H-L-5′。基因组的前5个基因的非转录基因间隔区序列（负链）为3′-GAA-5′。L和H基因序列有一个单核苷酸差异为3′-GCA-5′。这些基因间三核苷酸不被RdRp转录。基因组由多个6核苷酸组成（6×2649）。这种麻疹病毒遵守的6个规则[19，20]解释为每一个N蛋白联系RNA的6个核苷酸。2649个核衣壳蛋白和RNA构成一个约204（2649/13）个螺旋转的螺旋形RNP。

麻疹病毒中启动子有两个识别序列，A盒由基因组和反基因组3′端的前15个核苷酸组成，B盒以在第14、15和16位六聚体的GN5GN5GN5序列为代表。RNP结构研究提示在RNP第一和第二个螺旋B盒紧靠A盒，RNP每螺旋转包含13个N蛋白分子即13×6＝78个核苷酸。已证明B盒中3 G残基至关重要且在所有MV中均保守。有人分析了大量MV疫苗株和流行株的基因组终端，只在基因组3′端的第26和42位发现变化。通过小基因组表达分析发现这些3′前导区核苷酸自发突变影响了报告蛋白合成水平[21]。

转录从产生56个核苷酸前导序列模板的3′端开始，还是从N基因开始直接生成带帽mRNA还不太清楚。已经发现这56个核苷酸前导RNA和mRNA编码MV N蛋白相关联。如果转录过程总是从复制基因组3′端开始，那么细胞内会形成至少等摩尔量的前导序列和N mRNA，但是在感染细胞中前导RNA未达到期望水平。然而要注意的是，缺乏证据并不等于不存在，没有5′帽或3′多聚A尾的小RNA分子的稳定度易造成其快速降解。Castaneda和Wong阐述了急性和持续性感染细胞中有大量前导N和前导N-P通读RNA分子未带帽的多聚腺苷酸化。环己酰亚胺处理细胞不产生这些分子提示这些前导N通读产物可能来源于失败的复制过程而不是转录过程。最近提出的非节段负链RNA合成机制提示单股负链病毒组多聚酶可能到达模板3′端并扫描直到从N起始位点开始复制模板，对麻疹病毒来说前导序列的合成相对罕见。

（三）mRNA修饰

在第二个及之后的转录结构启动或重新启动转录，转录产物5′端有一个一致性起始序列AGGRNNc/aARGa/t。和单股负链病毒中发现的相似，麻疹病毒mRNA显示为带帽结构。麻疹病毒L蛋白D3区有一个O-甲基化转移酶序列，可能与包含反向鸟嘌呤残基的甲基化帽结构形成有关，但是，反向遗传学的直接证据还未能支持该观点。

麻疹病毒是细胞质型病毒，不涉及细胞核，病毒在无核细胞中同样生长可以证明。有证据表明N和C蛋白能进入细胞核，尽管还没有相关功能的描述[22]。亚急性硬化性全脑炎（subacute sclerosing panencephalitis，SSPE）病例的感染细胞中RNP在细胞核的积累作用尤其明显。

所有mRNA尾部聚腺苷酸化尾长度与正常细胞的mRNA相似。生成多聚A尾的过程需要基因末端（gene end，GE）的信号序列。当RdRp复合体遇到GE序列5′-RUUAUAAAACTT-3′时，会在新生RNA 3′端的70-140-A残基位置使U富集模板序列打结或滑动。麻疹病毒属的GE信号特征为：保守序列RUU后跟着一段富集A且包含1～2个嘧啶的8个核苷酸序列。还没有突变分析来评估这些麻疹病毒序列信号的功能重要性。

发现一个GE相似信号在P基因5′AUUAAAAAGGGCAC-AGA 3′序列中间。由于RdRp在UUUUUCCC模板滑动或打结，不能聚腺苷酸化而是非模板化插入G残基，被称为共转录编辑，生成编码V和W蛋白的转录产物。V蛋白由插入G的mRNA翻译而成，G在P基因的前231个密码子后移动了ORF并导致特有的羧基端69个氨基酸的延伸。由合并两个插入G产生的W蛋白在MV感染细胞中未被证实，可能是由于严格控制的剪接，意味着大多数情况下剪接导致的插入只允许插入单个G残基。没有那么严格的剪接的副黏病毒亚科的其他成员，能合并一定数量（1-4）的G残基导致V-、W-和P-之类的蛋白带有甘氨酸残基。急性MV感染细胞里，已编辑的V相对于非编辑的P百分比变化为30%到50%，这依赖于感染发生的细胞类型。没有证据显示其他MV mRNA发生类似编辑。RYY序列后跟着富含A的延伸段在多处基因组被发现。

（四）转录和相位（phase）

6个核苷酸关联1个N蛋白的规则，意味着每个核苷酸有其相对于N蛋白和基因组3′端的特有相位（1，2，3，4，5或6位）。不遵守该规则的小基因组既不能高效复制也不易壳体化。麻疹病毒属基因组对比分析证明转录起始位点相位在不同病毒间是保守的，在不同基因间却不然。麻疹病毒属的N mRNA转录起始位点在第2位，意味着存在于模板的U是第二个被N蛋白分子保护的。P和L基因起始位点相位也是第2位，M为4，H为3。唯一有变化的是F基因的起始位点相位，MV为3位，而RPV、CDV、CMV和PDV均为第2位。相位保守但是在同基因组的不同基因间明显不保守。麻疹病毒基因组长度改变通常主要包括UTR区域多组6个氨基酸的缺失或插入，这样也就保存了基因的相位，似乎与相位保守的生物学压力有关。此外，Iseni等以仙台病毒来说明相位影响共转录编辑模式[23]，RdRp复合体至少有一种感应相位的潜能，壳体化在基因体上增加了一种高级结构即RNP。

转录和复制过程的拓扑学还未知。根据第一原理，当RdRp复制模板时，使RdRp和新生成RNA围绕RNP所需要的能量很重要。依据拓扑学原理，如果RdRp保持固定位置、螺旋RNP以其长度轴旋转将耗费最少能量。当前的模型显示RNA和N蛋白之间的相互作用为断裂或是RNA模板能够基础识别。

麻疹病毒转录过程仍存在很多问题需要进一步研究。尽管运用实时RT-PCR技术对很多的转录研究有所帮助，但是缺少可靠的体外研究系统还是阻碍了研究的发展。

三、麻疹病毒的复制

（一）一些顺式作用元件和蛋白分子

顺式作用元件是基因内、外的一些特定的DNA序列，与结构基因表达调控相关，能被基因调控蛋白特异识别和结合。复制过程中，RdRp结合在基因组3′端，新生RNA分子立刻被N蛋白壳体化。基于复制需要N蛋白，游离N-P复合物水平被作为控制转录和复制相对水平的重要参数。忽略基因起始（GS）、基因末端（GE）、基因间（Ig）三核苷酸和编辑位点的信号形态，RNP内产生全长正链RNA分子，通过电镜观察到RNP呈Y形态。这种形态使模板和产物RNP易于识别，也能识别其的3′和5′端。

含反基因组的正链RNP在3′端有一个强启动子，能产生含过量基因组RNA的RNP。在感染细胞中含反基因组与基因组的RNP之比，Cattaneo等估计为0.43（300/700）[24]，Plumet等估计为0.13（130/1030）[25]，Plumet还得出该比值在病毒体和感染细胞内相同，所以在含反基因组和基因组的RNP之间，病毒体的包装无选择性。Udem和Cook估计该比值为0.40[26]。复制过程中只有基因组、反基因组、前导和拖尾RNA的末端有5′三磷酸盐，可能通过RIG-I激活先天免疫系统[27]。

A盒、B盒为MV复制过程所需，基因组可分节段[28]。Takeda等将基因组分为三段：第一段编码N、P蛋白及Lac-Z；第二段编码M、F基因及DsRed；第三段编码H、L基因及EGFP。三段能一起复制为分节段麻疹病毒。同时发现细胞只感染其中两段的频率很低，提示大多MV颗粒至少包含三段中任意一段（或更多），证实了MV颗粒的多倍体性。

复制系统能表达多至6个报告基因，其显示的稳定性和颗粒无限制包装能力，使其成为完美的多种基因和蛋白的调控运输系统。有时也可能从转录结构产生表达三种报告基因（Lac-Z，EGFP和CAT）的单个非节段重组MV[29]。基因组复制的保真像个谜，体内基因组非常稳定，存在于附加转录结构的ORF也稳定保守。

（二）复制的一些外来影响因素

Yoshikawa等就罂粟碱对MV复制的影响展开了研究[30]，发现MV在人类神经和非神经细胞系的复制受罂粟碱的抑制，RNA（包括基因组RNA和mRNA）合成和蛋白磷酸化作用受到抑制，认为病毒在神经细胞复制的抑制和MV在中枢神经系统的持久化机制有关。

丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶（AKT）是细胞生长的主要调节因子。许多RNA和DNA病毒通过活化AKT来提高病毒复制，与之相反，麻疹病毒感染细胞导致AKT下调，Mary等发现MV复制不依赖磷酸化AKT（PAKT）水平，PAKT可能影响病毒释放，下降的PAKT水平可能是MV诱导的免疫抑制的部分原因[31]。

正常情况下细胞内表达丰富的过氧化物酶1（PRDX1），在感染细胞中PRDX1结合于MV N蛋白的C端，Akira等发现PRDX1与N结合位点和N-P蛋白结构位点重叠，从而与P竞争结合N[32]。HEK293-SLAM细胞中PRDX1抑制不仅导致病毒RNA合成和传染性子代病毒释放显著减少，还加速病毒mRNA转录极性衰减。

四、麻疹病毒的翻译

尽管翻译是病毒调控蛋白表达的两个过程之一，但是关于RNA病毒的翻译控制的了解却不多。关于MV感染细胞，对宿主mRNA翻译的总体作用的相关报道较少见，也未见eIF2α磷酸化作用的相关文献，该作用在其他病毒中突出表现为抑制宿主mRNA翻译。此外，也无PKR活化作用信息。Sato等用MV-N筛查T细胞cDNA文库寻找N结合细胞蛋白，分离出真核生物起始因子3的p40亚组（eIF3-p40）[33]，运用共免疫沉淀法证实了在哺乳动物细胞里MV-N以eIF3-p40为目标抑制MV诱导的宿主翻译。

麻疹病毒倾向于建立非溶细胞性、持续性感染，利于病毒、宿主mRNA合成和翻译平衡。而在急性感染Vero细胞中发现宿主蛋白合成抑制，可能源于核糖体竞争，通过MV RNA拷贝数分析，麻疹病毒RNA（大约52000拷贝）大概占细胞总RNA的25%。

1.翻译的调控

麻疹病毒通过调控翻译来控制基因表达。P和C的ORF起始密码子在MV属中处于次优环境，核糖体的帽依赖扫描P/C或V/C mRNA可能在mRNA的P/V ORF 60位或C蛋白ORF 82位为起点启动翻译。这样，可以调节C蛋白和P、V蛋白的比例。

C蛋白有186个氨基酸，在麻疹病毒属不同成员间其长度不同，尤其值得注意的是序列也不同。迄今为止，还不清楚通过改变起始密码子敲除C蛋白表达是否会影响P或V蛋白表达。C的起始密码子处于第二位，若核糖体扫描不到C起始密码子是否导致形成氨基酸末端缩短的P和V蛋白，或是始于第三框架102位的57个氨基酸ORF的表达也尚不清楚，该框架165位为有Kozak一致性序列的第二个蛋氨酸密码子。奇特的是，当P/C基因在腺病毒载体表达时，更改P ORF的起始密码子（CCGAUGG到GAGAUGG），并不改变P和C蛋白表达。

2.翻译后修饰

Prodhomme等发现重组体核蛋白和病毒核蛋白在N端α-乙酰化，确定的磷酸化位点重组体核蛋白有9个、病毒核蛋白有7个。这些磷位点发现于松散的C-端，聚集在转录和复制相关功能区域，强调翻译后修饰的重要性[34]。

3.M-F间UTR的作用

延伸的M mRNA 3′UTR和F mRNA 5′UTR一起形成1kb长度的麻疹病毒属基因组保守非翻译区，关于该非翻译区和麻疹病毒翻译控制之间的关系已经有相关研究。

4.温度对翻译的影响

M和F mRNA翻译比其他蛋白对高温更为敏感，当温度上调至39℃时就立刻终止，而N、P和H蛋白mRNA翻译在该温度下尽管效率很低但仍能进行。该作用是可逆的，降低温度就能使翻译恢复。

5.翻译的定位

病毒蛋白合成在细胞质内的精确定位还不是很清楚。有一些初步证据证实N、P和M mRNA在特定病毒工厂里积累。它们是否在那里翻译或者扩散在细胞质中还有待研究。转录和翻译是否同步进行也还不清楚。其他mRNA因为量太少或太分散而难于用ISH检测到而没有相关信息。

6.MxA蛋白对翻译的影响

MxA蛋白（人Ⅰ型干扰素诱导蛋白），转染鼠3T3细胞时表现为抑制VSV和A型流感病毒，持续表达MxA的U937克隆中释放感染性MV降低100倍。在该细胞系中MV转录率或MV特有mRNA水平未受影响。U937/MxA细胞中MV糖蛋白F和H的合成显著降低，其他病毒蛋白则不然，表明MxA表达诱导的某些病毒mRNA的特有翻译作用不同。

在MV的复制过程中，不同病毒成分是如何运输到细胞膜和特定结构的，这个过程还未被很好的了解。例如，引起SSPE的MV能沿神经解剖学通路蔓延，病毒可能需要跨越突触转移。RNP就必须运输到神经轴突和树突末端，两种病毒糖蛋白也需要通过某种方式到达同一位置。位置和定位在细胞病理学中同等重要，麻疹病毒在NT2细胞中的持久性研究表明，含有细胞融合所需蛋白和表达CD46受体的细胞，通过改变其受体定位，细胞间融合就无法发生并持续保持这种不融合状态。这些过程的复杂性表明我们对MV复制的理解还处于初期阶段。