第五节 基因打靶(CRISPR/Cas技术)
基因打靶(gene targeting)是通过特殊技术实现基因敲除(gene knock-out)或基因敲入(gene knock-in),特异地改变细胞或生物体基因表型的实验手段。
CRISPR/Cas是成簇的、规律间隔的短回文重复序列及其相关基因(clustered regularly interspaced short palindromic repeat(CRISPR)/CRISPR-associated genes)的缩写。CRISPR/Cas9技术实现了在基因组特定位点敲除或加入基因,对人基因组进行靶向编辑;能在活细胞中有效、便捷地编辑任何基因,已经开始应用于临床治疗遗传性疾病。
一、CRISPR/Cas9技术原理
CRISPR/Cas9系统由单一Cas9蛋白和两条非编码RNA(tracrRNA和crRNA)组成,其中tracrRNA可与具有DNA内切酶活性的Cas9蛋白结合,crRNA可与tracrRNA聚合并引导Cas9剪切与crRNA互补的、邻近PAM(protospacer adjacent motifs)位点的特定DNA序列(图2-1-5)。2012年,Jannifer Doudna和Emmanuelle Charpentier对tracrRNA和crRNA进行组合设计,成功实现仅用单条tracrRNA-crRNA引导Cas9对特定DNA位点进行切割,实现了靶向特异地敲除基因。2013年,George M Church和Feng Zhang用CRISPR/Cas9技术靶向修饰人类细胞基因组,具有高效、快捷等特点。CRISPR/Cas9技术已经成为人基因组定向编辑的首选工具。
图2-1-5 CRISPR/Cas9原理的示意
二、CRISPR/Cas9技术简要过程
在细胞系中运用CRISPR/Cas9技术进行基因编辑的流程:
1.基因组序列中寻找含有PAM序列的靶点,设计18～20bp反义识别序列。
2.与订购的特定单链寡核苷酸序列退火形成含有反义识别序列的双链DNA,与有sg RNA骨架序列和Cas9编码序列的表达载体连接,转化扩增细菌,获得特异性sgRNA/Cas9表达质粒。
3.通过转染慢病毒等方式将sg RNA/Cas9特异表达质粒(可含有荧光标记)导入靶细胞。
4.通过荧光标记筛选单细胞克隆并测序鉴定,扩增靶基因修饰成功的细胞株(图2-1-6)。
图2-1-6 运用CRISPR/Cas9在细胞系中进行基因组编辑流程的示意
PAM sequence:PAM序列,靶点序列3’端的NGG序列,可介导Cas9的结合和功能
对生物个体进行CRISPR/Cas9基因修饰与在细胞系中操作相似,简要步骤:
1.寻找合适的靶序列并设计18～20bp的反义识别序列。
2.反义识别序列与sgRNA骨架序列连接并进行体外转录获得特异性sgRNA。体外转录获得Cas9的mRNA。
3.将sgRNA和Cas9 mRNA/蛋白显微注射导入单细胞期的受精卵中。
4.根据生物体发育快慢不同进行P0代筛选,P0代的胚胎将发育成为突变体或突变嵌合体。
5.P0代与野生型外交筛选后代获取杂合突变F1代。
三、CRISPR/Cas9技术临床应用范例
CRISPR/Cas9技术能迅速有效地进行人类活细胞基因组编辑,修复致病突变,根治遗传缺陷。如Hans Clevers等用于人肠干细胞修复了与囊性纤维化相关的CFTR基因缺陷。Charles Gersbach在杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD)患者中分离培养的诱导型多能干细胞(iPSCs)和成肌细胞中对DYSTROPHIN基因缺陷进行了修复,显著改善了肌细胞的功能。
运用CRISPR/Cas9技术在受精卵阶段对胚胎的遗传缺陷进行修复。黄军等对人胚胎β-地中海贫血相关基因HBB进行了修饰,从生命的起始阶段根除个体的遗传缺陷。CRISPR/Cas9技术已在精准医疗方面发挥作用。