第四节　蛋白丝/苏氨酸激酶抑制剂

蛋白丝/苏氨酸激酶（protein serine/threonine kinase，PSK）是哺乳动物体内分布非常广泛的蛋白激酶，种类繁多，作用广泛，其调节机制也很复杂。主要有cAMP依赖的PKA、cGMP依赖的cGPK、钙/磷脂依赖的PKC、钙/钙调蛋白依赖的CaMK以及MAPK。其中与免疫细胞信号转导密切相关的有PKC和MAPK。

一、蛋白激酶C抑制剂

目前在哺乳动物组织中已经确定了12种蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）亚型，都由一条多肽链组成，在结构上具有很大相似性。PKC分子中存在四个相对保守的区域，从N端到C端以此命名为C1～C4。C1是PMA和DAG的结合位点，C2是钙离子结合位点，C1和C2合称PKC的调控区。C3有一个ATP结合基序GxGxxGL，为PKC提供能量和磷酸基团。C4是底物结合区，与C3合称催化区。根据不同亚类的结构类型和功能特点，可将PKC分为三种类型：①Ca2+依赖型或传统（classical/conventional PKCs，cPKCs），包括4种亚型（α、βⅠ、βⅡ及γ），依赖于Ca2+、磷脂酰丝氨酸（phosphatidyl serine，PS）、DAG，还受到顺式不饱和脂肪酸和溶血磷脂酰胆碱的进一步激活；②Ca2+不敏感或新型（novel/new PKCs，nPKCs），包括5种亚型（δ、η、θ、ε及μ），其活化需要PS和DAG的存在，不需要Ca2+的参与；③非典型PKC（atypical PKCs，aPKCs），包括3种亚型（ξ、ι及λ），需要PS，不需要Ca2+和DAG。

PKC-α、β和θ是在T细胞和B细胞活化过程中发挥重要作用的PKC亚型，其中PKC-θ是T细胞活化时向免疫突触募集的唯一PKC。TCR活化后，经过Src家族激酶、Syk家族激酶及接头蛋白的级联活化，将PLC-γ募集到近膜区，在PTK的作用下发生酪氨酸磷酸化并活化。PLC-γ分解细胞膜磷脂成分PIP2产生IP3和DAG，其中DAG与PKC-θ的C2区域结合，促进PKC-θ活化。PKC-θ在多种转录因子的激活过程中发挥重要作用，其中包括NFAT。此外PKC-θ可通过活化Carma1-Bc110-Matl1复合物促进IκK活化，进而激活转录因子NF-κB。因此，开发PKC-θ特异性的抑制剂，可能为抑制机体免疫应答，为治疗自身免疫性疾病和移植排斥反应开辟新的道路。目前最重要的PKC-θ抑制剂包括两种：杂芳香吲哚马来酰亚胺衍生物（以AEB071为代表）和3-吡啶腈衍生物。

Wagner J等发现基于马来酰亚胺的PKC抑制剂（化合物2）具有C3和C4位置双吲哚结构（图1-10A），对C3位置的吲哚基团进行取代后得到化合物3～5，但是这些化合物的PKC抑制活性低于化合物2。接下来，研究者又对C4位置的吲哚基团进行了一系列取代，得到了化合物6～16和化合物1，其中化合物10、12和化合物1（图1-10B～D）对PKC-α、β和θ的抑制活性最强，并能够抑制T细胞经TCR/CD28途径的活化。化合物1可与PKC中Glu418及Val420形成氢键，使其能够结合于PKC的ATP结合槽内，化合物1远端哌嗪基团的N原子亦可与PKC催化环上的Asp476形成氢键，加之在疏水力的作用，化合物1与PKC能够牢固结合（图1-10E）。随后化合物1命名为AEB071，目前AEB071已经进入治疗移植排斥反应的Ⅱ期临床实验阶段。

Matz M与Evenou JP等研究发现，AEB071可以显著抑制活化信号刺激状态下的T细胞PKCθ活性，选择性影响NF-κB和NFAT（而不是AP-1）信号传导途径。AEB071可显著抑制抗CD3/CD28单抗、抗原、IL-2、ConA和异体淋巴细胞诱导的T细胞活化增殖，抑制活化T细胞ICOS、CTLA-4、CD71、CD25、CXCR3、Ox40、CXCR3和PD-1的表达，但不能抑制CD69的表达。AEB071可显著降低活化T细胞IL-2和IFN-γ的分泌，抑制Mo-DC细胞的成熟及共刺激分子CD40、CD80、CD86的表达，降低Mo-DC诱导T细胞活化的能力，还可抑制NK细胞的杀伤活性。因此，AEB071作为一种新型的免疫抑制剂，在器官移植、自身免疫型糖尿病、银屑病的治疗领域内具有广阔的发展前景。

近年来，3-吡啶腈衍生物类PKC-θ抑制剂的研究也取得了丰硕成果，其中抑制活性最强的四种化合物如图1-10F～I所示。化合物4p（图1-10F）是4-芳胺基-3-吡啶腈衍生物，化合物19和23e为5-乙烯基-3-吡啶腈衍生物（图1-10G、H）。化合物13b，为5-苯基-3吡啶腈衍生物（图1-10I）。四种化合物抑制PKC-θ　的IC50依次为70nM、4.7nM、1.8nM和7.4nM。化合物4p可抑制TCR/CD28信号介导的T细胞活化及IL-2分泌。

二、MAPK家族激酶抑制剂

丝裂酶原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是一种可以被多种细胞外信号激活的蛋白丝/苏氨酸激酶，处于胞浆信号转导通路的终末端位置，活化后转位到核内，作用于核内转录因子，调节基因表达。目前已经报道的哺乳动物的MAPK亚型已超过20余种，其中研究最为广泛的三组成员是ERK1/2、p38MAPK和JNK。尽管三个成员分布广泛，功能复杂且有交叉，但也存在着一定分工：ERK1/2对于细胞增殖至关重要，是多种生长因子受体胞内信号传导的参与者，P38MAPK主要参与炎症反应和促炎性细胞因子的分泌，而JNK又称为应激激活的蛋白激酶（stress activated protein kinase，SAPK），在应激和炎症反应中发挥重要作用。

（一）JNK激酶抑制剂

JNK信号传导牵涉很多慢性免疫相关性疾病，比如RA、糖尿病、动脉粥样硬化、阿尔兹海默病、帕金森病等，因此JNK成为了这些疾病有价值的治疗靶点之一。针对JNK与支架蛋白JNK相互作用蛋白1（JNK-interacting protein-1，JIP1）相互作用的多肽类抑制剂pepJIP1（氨基酸序列为RPKRPTTLNLF）虽可抑制JNK的活化，但是其跨膜转运效率及代谢稳定性较低，不利于临床应用。Stebbins JL等通过高通量筛选得到了小分子化合物BI-78D3，以及此基础上衍生得到的BI-87G3和BI-87D11，通过与JNK竞争性结合阻断JNK的作用（图1-11A～C）。

Pellecchia M等以BI-78D3为参考，合成了一系列小分子的JNK抑制剂，其中活性最强的是化合物9（图1-11D）。化合物9的硝基噻唑基团可与JIP结合位点的Arg127及Cys163结合，发挥与pepJIP1相似的作用，阻断JNK的活化，IC50为0.7μM。Pellecchia M等最近又合成了一批JNK小分子抑制剂，其中活性较高的化合物为BI-90H6、BI-90H9、BI-90H10和BI-98A10。这些化合物活性最强的为BI-98A101，IC50为3μM，低于BI-78D3（图1-11E）。

（二）P38MAPK激酶抑制剂

p38MAPK通路在炎症和应激条件下可被强烈激活，对于炎性细胞在炎症部位的聚集及促炎性细胞因子（如IL-1β和TNFα）的释放均发挥重要作用，近年来，新型的p38MAPK小分子阻断剂包括VX-702、SB706504、BIRB796、ORG48762-0、FR167653、VX-745、AMG548和pamapimod等不断被研发生产。此类药物多用于RA或Crohn病等自身免疫性疾病的治疗。

多种ATP竞争抑制型p38 MAPK抑制剂都是由典型的嘧啶-4-咪唑类化合物SB203580衍生而来。此类化合物能与ATP结合槽发生作用，关键在于以下4方面：①2-氨基吡啶残基于p38铰链区形成氢键；②亲脂的芳香基团与ATP结合槽内疏水口袋后方区域结合；③与ATP结合槽内疏水口袋前方区域结合；④进一步与糖基口袋及磷酸盐结合区域结合（图1-12）。

由Scios公司开发的p38MAPK抑制剂SCIO-469（图1-13A），属于吲哚酰胺类衍生物，对P38MAPKα具有很高的选择性。结构预测分析显示，SCIO-469的C5羰基可能和p38的Met109以氢键连接，疏水性的苄基哌嗪占据p38激酶的作用位点，从而抑制p38的激酶活性。SCIO-469对促炎性细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的分泌具有一定抑制作用，并能抑制机体炎症反应。一项有302例活动期类风湿关节炎患者入组的为期24周的临床试验已经结束，但试验结果显示SCIO-469对该类型类风湿关节炎无明显治疗作用。

SB203580（图1-13B）可模拟ATP与p38结合，抑制p38MAPK活性，抑制子宫内膜异位模型小鼠腹膜细胞IL-1β、TNF-α、MMP-2和MMP-9的蛋白及mRNA表达水平，减轻模型小鼠子宫内膜异位损害。辉瑞公司合成的PH-797804（图1-13C）是一种ATP竞争性p38MAPK抑制剂，可结合于p38的ATP结合位点。体内实验证实，PH-797804可抑制促炎性细胞因子IL-6和TNF-α的分泌，抑制内毒素和LPS引起的慢性炎症反应，缓解大鼠AA和小鼠CIA的症状，减轻关节损伤。Chopra P等合成的p38 MAPK抑制剂AW-814114（图1-13D）可抑制LPS诱导的人外周血单个核细胞TNF-α的表达，抑制小鼠CIA模型的进展。ML3043（图1-13E）可与p38α MAPK结合，抑制p38 MAPK诱导的呼吸道平滑肌细胞分泌促炎性细胞因子IL-6和IL-8，降低呼吸道炎症反应。