第二节 循环肿瘤细胞检测
CTC是指能在肿瘤患者外周血中检测到、来源于实体肿瘤、逃离宿主免疫杀伤后存活于血液循环系统中的异质性肿瘤细胞。早在1869年，Ashworth就在癌症患者外周血中发现了与原发灶肿瘤性质相类似的细胞，并首次提出了CTC的概念。1889年，Paget提出“种子和土壤”假说，用于解释肿瘤原发灶与转移灶之间的关系。而CTC被认为是肿瘤能够发生转移的必要前提，其一方面代表了原发灶肿瘤细胞进入血管的能力，另一方面也代表了远处转移灶形成的可能性，因此被认为是重要的预后指标。此外，CTC还被认为是对肿瘤患者病情发展动态监测的有效指标，可以指导后续治疗；同时也是了解肿瘤细胞致病以及耐药机制的工具。对CTC的研究在乳腺癌中开展较早且最为深入。
一、检测技术概述
恶性肿瘤> 90%来源于上皮组织，而上皮组织的细胞与其他组织类型的细胞，比如血液细胞有着截然不同的基因表达谱及生物学特性。因此，CTC检测多是利用了上皮细胞与血液细胞之间的差异。由于外周血中CTC数量较少，需要首先对CTC进行富集，然后做进一步检测和确认。
（一）CTC的富集技术
CTC的富集主要从生物学特征和物理学特征两方面实现，前者主要是根据细胞表面特异表达的蛋白，而后者主要是根据细胞的大小、密度以及离心力等方面的不同。
1.根据生物学特征的富集技术
根据生物学特征的富集技术又可以分为阳性分选和阴性分选两类。阳性分选采用的是能够与上皮细胞特异结合的抗体，其中最常用的是上皮黏附蛋白（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）抗体，这是因为EpCAM在上皮细胞中是表达最为广泛的表面蛋白。此外，考虑到转移的肿瘤细胞可能会存在上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）现象，有的研究者也会采用上皮和间质细胞共同的抗体（如plastin3）或间质细胞抗体（如N-cadherin）来进行富集。而阴性分选采用的是能够与血液细胞特异结合的抗体分离去除血细胞，最常用的是CD45抗体，主要是因为CD45在血液细胞中广泛表达。
采用抗体捕获的方式，主要通过以下3种方式分离CTC。①抗体先偶联磁珠，在外加磁场的作用下与不结合抗体的细胞相分离，最具代表性的是CellSearch系统，这一种方式目前在临床应用最为广泛。②将外加磁场换成磁力棒，用磁力棒在样品之中搅动，可收集结合了抗体的细胞，代表性的是MagSweeper技术。③将抗体事先与固相表面结合，血液从其中流过，与抗体结合的细胞可以留在固相表面，最具代表性的是CTC-Chip技术。
2.根据物理学特征的富集技术
相比于血液系统的细胞来说，CTC体积和质量一般会更大一些，利用这种差别可实现CTC的富集，较为常用的技术包括滤膜法、密度梯度离心法以及惯性芯片法等。滤膜法原理是采用特定孔径的滤膜，将直径较小的血细胞过滤掉，直径较大的肿瘤细胞留在滤膜上面；密度梯度离心法是在特定的缓冲液体系之中，由于密度的差异，血细胞和CTC在离心时会处于不同的层面，从而实现CTC的富集。惯性芯片一般呈“蚊香”样的回旋结构，当血液在其中流动的时候，由于惯性的原因，质量较大的CTC会处于外侧，较易对其进行收集。
（二）CTC的检测技术
对于富集之后的细胞需要通过一些技术方法来确认是否是CTC，目前主要有以下3种方法。
1.免疫细胞学方法
理论上，CTC应该表达上皮细胞或间质细胞特异的基因，如细胞角蛋白（cytokeratin，CK），波形蛋白（Vimentin），E-钙黏蛋白（E-cadherin）和N-钙黏蛋白（N-cadherin）等。而某种具体的肿瘤可能还表达组织特异的基因，如前列腺癌的前列腺特异性抗原（prostate specific antigen，PSA）以及乳腺癌的乳腺珠蛋白（Mammaglobin）等。此外，还有一些蛋白与肿瘤生长密切相关，如表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）和HER2等。通过对上述蛋白的免疫染色或荧光标记，可以对CTC进行确认，这是目前应用最为广泛的方法。
2.逆转录聚合酶链反应的方法
逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）法同样是检测上皮特异基因的表达，RT-PCR采用的是单基因或多基因的检测方法。与免疫细胞学方法相比，该方法更为灵敏，不足之处在于无法观察到细胞的形态学特征。
3.功能性验证
具有生物学功能的CTC在临床上可能会更有意义，因此功能性的验证是确认CTC的终极目标，具体的策略包括：通过免疫学确认目标细胞是否能够分泌某些功能性蛋白；通过侵袭实验确认目标细胞是否具有侵袭能力；通过端粒酶实验确认目标细胞是否具有无限增殖的潜能；通过动物实验确认目标细胞能否具有在体内成瘤的能力等。
除此之外还有很多发展中的技术方法。这些技术各具优势，未来很有可能是针对不同的临床需求来选择不同的技术。例如，CellSearch技术在CTC计数方面具有很大的优势；滤膜法所富集的细胞会呈现在一个平面上，很适合进行原位的分子分析；而由于不需要特殊的标记，惯性芯片所富集的细胞可能会比较适合进行细胞培养等。尽管多种技术都显示出了非常有意义的应用前景，但是目前只有CellSearch系统被美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）以及我国国家食品药品监督管理局（China Food and Drug Administration，CFDA）批准用于临床，其他技术都还有待更大范围的临床数据验证。因此，在本文后续关于乳腺癌临床治疗应用的论述中，将更多以CellSearch系统为例。
二、检测临床意义
（一）高风险人群的筛查
能够用于高风险人群的筛查是很多人对CTC的期待，遗憾的是目前还缺乏足够的循证医学证据。CellSearch系统在美国和中国的注册临床试验中均入组了一些健康受试者和良性乳腺疾病患者，其中不乏有检测阳性的情况。但是，由于并非研究的重点，这些人绝大多数没有后续的随访数据。仅有1例美国良性乳腺疾病患者后来被确诊为乳腺癌，当时在其外周血中发现了11个CTC。尽管证据不足，但却提示CTC在这方面有潜在的临床应用价值。如果希望在临床应用CTC进行癌症患者筛查，不仅需要有大宗人群的循证医学证据，也有待于更加敏感的检测技术的发展。
（二）临床分期的精准化
肿瘤患者的临床分期多是基于临床-病理、影像等的结果而确定的。然而，早期乳腺癌中CTC的检出率为2%～55%。这一数据提示，乳腺癌患者分期的误判是较为普遍的现象，而CTC检测指标的引入有可能会对现有的判断体系提供校正和补充，从而保证患者能够得到更合适的治疗。然而这一设想未来能否在临床实践中得以实现，还有待更多临床数据的证实。
（三）早期患者预后判断与监测
为推迟复发和转移，早期乳腺癌手术之后常常进行辅助化疗，目的在于抑制或杀灭手术无法切除的癌细胞。但其实有一部分早期患者手术已可以获得很好的治疗效果，不需要接受化疗。但是目前尚没有很好的办法能够区分出可以避免化疗的患者。另一方面，即使接受了辅助治疗，仍然会有20%～30%的患者其病情会进展很快。目前有很多研究正在试图探索CTC的检测能否为早期乳腺癌患者提供更好的监测和治疗指导。在这方面，最重要的证据来自于德国的SUCCESS临床研究，共计有251个研究中心参与，最终收集了2026例有效病例。考虑到早期患者的CTC含量较少，该研究采集了23.5ml外周血，即3倍于常规CellSearch检测的血量进行检测。结果发现，在患者进行手术之后辅助化疗开始之前，CTC检出率为21.5%（435/2026），中位值为1.3（区间为1～827）。随访中位时间为35个月，没有CTC检出的患者在无瘤（病）生存（disease free survival，DFS）和总生存（overall survival，OS）等方面均优于有CTC检出的患者。没有和有CTC检出的患者比较，平均DFS时间分别为41.4个月和38.5个月，P < 0.001；无远处转移平均生存时间分别为41.5个月和38.6个月，P < 0.001；OS未到中位值，P = 0.0002。此外，多变量回归分析还证实，CTC 是 DFS（HR = 1.878，95%CI = 1.318～2.676，P = 0.0005）和 OS（HR = 1.907，95%CI = 1.142～3.183，P = 0.0136）的独立预测因素。
以上数据证实，CTC在早期患者的预后判断和病情监测方面具有重要的临床价值，同为临床常规方法判定的早期患者，有CTC检出患者的治疗策略应该有所调整。但是，具体该如何应用，还有待进一步的临床研究。SUCCESS研究还未结束，后续还将针对CTC作为早期疗效预测标志物以及CTC分子分型指导个体化治疗等方面探索，这将对CTC在早期乳腺癌患者中的应用提供重要的线索。
（四）新辅助治疗疗效的评价
对于可手术乳腺癌在局部治疗前进行的全身治疗被称为新辅助治疗，新辅助治疗疗效评判的主要指标是病理缓解率（pathological response rate）以及患者的复发风险。既往的荟萃研究发现，CTC的数值变化与新辅助治疗的病理缓解率之间并无明显的相关性。但是在复发风险方面，Pierga等纳入118例患者的Ⅱ期临床研究发现，新辅助治疗前和治疗后CTC检出率（≥1CTC/7.5ml）分别为23%和17%，治疗前和治疗后CTC数目均与患者无远处转移的生存期相关，是独立的预后指标。
总体来说，对于进行新辅助治疗患者的CTC研究还较少，而且纳入研究的患者随访时间尚短。因此，CTC在这个治疗阶段的实际意义可能还未被充分认识和了解，有待更进一步的临床证据。
（五）肿瘤转移机制的探索
肿瘤复发和转移是临床研究的重点和难点，既往对于肿瘤转移机制的认识多数来源于动物模型和体外实验。如果能直接对患者的CTC进行实时动态分析，则有望深入认识肿瘤转移的机制，从而制订更加有效的治疗策略，改善预后。
在这方面，具有代表意义的为Aceto等的研究成果。该研究发现，相比于单个CTC来说，CTC细胞团的转移潜能要高23～50倍。进一步RNA测序分析发现，在这些CTC细胞团中有较高水平的斑珠蛋白（plakoglobin）表达，而斑珠蛋白是细胞连接组分的重要成分之一。在小鼠模型中，敲除该基因的表达可以阻止CTC细胞团的产生并抑制肺转移的发生。而在乳腺癌患者中，CTC细胞团的数量以及高水平斑珠蛋白表达均与不良预后有关。上述结果说明，CTC细胞团通过斑珠蛋白依赖的细胞间黏附方式而聚集在一起，尽管其数量稀少，但是在肿瘤转移过程中具有重要意义。
这项研究成果为阻断乳腺癌转移治疗策略的制订提供了重要依据，并且掀起了该领域研究的“热潮”，未来也许会对患者的临床治疗带来革命性的改变。
（六）晚期患者治疗的监测
1.疗效预测
文献报道，乳腺癌最重要的2个标志物雌激素受体（estrogen receptor，ER）和HER2的表达在原发灶和转移灶之间存在明显的不一致性。这说明肿瘤处在不断地发展和变化之中，而治疗方案也需要随之调整。在这方面，CTC具有独特的优势。但是既往虽然有通过CTC对ER以及PI3KCA等分子进行实时分型的报道，总体来说，CTC用于疗效预测的研究还是更多集中在HER2上。这很大程度上是因为HER2是靶向药物应用的判断指标，且HER2阳性患者是乳腺癌治疗的难点之一。
然而，既往关于CTC检测HER2的研究在方法学上并不一致，关于CTC HER2阳性的定义也各不相同，这使得这些研究很难有可比性。军事医学科学院附属医院研究团队结合既往的研究以及组织学HER2的阳性标准，认为合理的CTC HER2阳性标准应该既考虑到单个CTC的HER2表达强度，又考虑到这种表达强度的CTC在整个群体中所占的比率，提出了> 30% CTC表达强阳性的HER2信号为HER2阳性（+++）的CTC HER2阳性标准。以此标准进行分析，发现组织学和CTC之间HER2的不一致率高达51.9%（14/27）；并且，在组织学HER2阳性且接受抗HER2靶向治疗的患者中，只有CTC HER2阳性的患者才能真正获益，CTC HER2阴性患者和CTC HER2阳性患者中位无进展生存分别为2.5个月和8.8个月，P = 0.002。在后续研究中，这一标准又得到了进一步的验证。研究者同时还发现，患者组织学HER2的末次检测时间距离CTC的检测时间越长，两者之间出现不一致的可能性越大，从而进一步提示通过CTC进行HER2实时检测的必要性。目前为止，只有这两项研究所提出的CTC HER2阳性标准经过了患者靶向治疗数据的验证，尽管样本量较少，但为通过CTC的实时分子分型来预测患者疗效提供了重要的参考依据。
对于组织学HER2表达阴性的患者，目前德国进行的DETECT Ⅲ研究以及法国进行的CirCe XXX1研究都期望通过CTC的HER2检测，进一步筛选出其中能够从抗HER2靶向药物中获益的患者，前者采用免疫荧光技术，后者采用荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技术。上述研究将从另一个侧面证实CTC的实时分子分型对疗效的预测价值。
2.疗效评价
目前，患者疗效评价的常规方法是肿瘤标志物和影像学检测，但前者由于患者的个体差异，其参考价值相对有限，而后者在时间上有一定的滞后，一般需要2个周期的治疗（6～8周时间）才能得出确切结论。既往的文献报道，治疗前后CTC数值变化也可以用于患者的疗效评价。相比于肿瘤标志物，CTC的评价与临床符合性更好；而相比于影像学，CTC的评价要更为及时，在第一个治疗周期结束（3～4周）即可做出准确的评价，这对于使用较为昂贵的治疗方案的患者，会更有意义。
CTC的动态监测分析将为患者的治疗提供更加有针对性的指导。2013年发表于Science的一项研究采用RNA原位杂交技术对CTC表型进行了实时动态分析。该研究发现，EMT在乳腺癌的血液转移方面具有重要的预测价值，患者病情的进展会伴随CTC的EMT，而随着病情缓解，这一类细胞的EMT转变会降低。相比于笼统的CTC计数，这种更加注重CTC表型的变化与患者病情的相关性可能更为密切，其动态分析将会为患者治疗疗效的判断及治疗方案的更改提供有价值的信息。
关于CTC和影像学检查方法的相关性，Budd等研究发现，同为影像学检测评价为获益或稳定的患者，有13.5%（13/96）患者其7.5ml外周血中CTC数值≥5个，其预后要远远差于CTC数值< 5个的患者，中位无进展生存期分别为15.3个月和26.9个月，P = 0.0175，说明这些患者并未从现有治疗之中获益，治疗方案应随之调整；相反，在影像学检测评价为进展的患者中，有47.6%（20/42）患者7.5ml外周血中CTC数值< 5个，其预后要远远优于CTC数值≥5个的患者，中位无进展生存期分别为19.9个月和6.4个月，P = 0.0008，说明这些患者其实正在从现有治疗之中获益，可以维持现有的治疗方案。上述结果表明，CTC指标的引入，可以使患者的疗效评价变得更为准确。虽然影像学方法依然还是患者疗效评价的主要标准，但是结合CTC，可以提供更加丰富的患者信息，从而保证患者能够得到更加合理的治疗。
有研究提出，以1～2个治疗周期之后CTC数值是否还≥5个作为评价患者是否获益的标准。然而，关于在CTC提示治疗失败之后是否应该更改治疗，备受关注的SWOG 0500研究却并未得到阳性结果。在该项研究中，一线治疗之前CTC数值< 5个的患者被分为A组，治疗前CTC数值≥5但1个治疗周期之后< 5的被分为B组，而治疗前和1个治疗周期之后CTC数值一直≥5的患者被分为C组，C组患者进一步被随机分为C1组和C2组，其中一组继续维持原有的一线治疗方案，另外一组更换为新的治疗方案。最后的结果发现，虽然A、B、C 3组患者的生存情况与之前的报道相吻合，即A优于B，B优于C，中位总生存分别为35个月、23个月和13个月，P < 0.0001，但是C1和C2组在无进展生存和总生存上并未发现差别。
分析上述结果的原因可能有2点：其一，不应以≥5的绝对值作为评判标准，因为在临床上经常会到CTC数值从几百降到几十数量级的患者，虽然CTC数值依然≥5，但是从CTC降低的幅度来看，还是有理由相信患者是受益的。其二，评判更改的治疗是否有效应该以治疗后而不是治疗前的CTC数值来做评判。相比而言，法国进行的CirCe 01研究可能考虑得更为充分一些。这项研究以CTC的降低幅度为依据，但是具体幅度如何，可能需要做统计学分析。此外，该研究选择的是三线治疗的患者，并且一直观察到五线及以后的治疗，更改治疗之后的效果将会由治疗后的CTC数值来做评判。从研究设计上来看，CirCe 01似乎比SWOG 0500更加符合临床的实际情况，在未来也许可以提供更多有价值的信息，以指导CTC更好地用于疗效评价。
3.耐药机制的探索
晚期或复发转移乳腺癌患者的病情处于动态变化中。因此，如何实时监测患者的病情进展，了解患者耐药的具体机制，以便及时采取有针对的治疗策略显得尤为重要。由于血液样本的动态获取相对容易，CTC检测在患者病情监测以及耐药机制方面的研究受到了越来越多的关注，是目前CTC研究的最前沿。
Yu等发表于2014年Science杂志的研究中，在6个ER阳性患者中成功实现了CTC的体外培养。这些培养的CTC细胞系多数可以在小鼠体内成瘤，对其进行基因组测序不仅发现了原有的PIK3CA基因突变，而且还发现了雌激素受体基因（estrogen receptor genes，ESR1），PIK3CA基因以及成纤维细胞生长因子受体基因（fibroblast growth factor receptor gene，FGFR2）等多个获得性突变。根据这些突变而设计的体外药物敏感性试验发现了潜在的药物作用新靶点，相应的药物已经在动物模型中取得了很好的治疗效果。这项研究提示，未来在患者发生耐药的时候，通过CTC的分离、体外培养和分子分型，可以无创地监测患者药物敏感模式的转变，了解患者耐药的具体机制，从而采取更有针对性的后续治疗措施。这种模式的转变将是肿瘤临床治疗策略的重大革新，虽然目前从技术方法上来讲还很难在临床常规应用，但基于其在实验室研究阶段的良好数据，这种模式将是一种必然的趋势。
4.预后判断
在转移性疾病阶段，治疗策略多以姑息治疗为主，更加注重提高患者的生活质量。在这一阶段，通过CTC检测可更加精确地判断患者预后，将有助于实现对患者的个体化治疗，而这也是目前CTC的应用研究做得最为充分的一个领域。其中，最具影响力的研究发表于2004年的The New England Journal of Medicine，这项研究同时也是CellSearch系统在美国的前瞻性、多中心、注册临床试验，共计入组了177例晚期乳腺癌患者。该研究先是采用其中一部分患者建立了一个训练组，通过统计学分析方法建立了一个CTC≥5的阈值，之后又在其余患者所组成的验证组以及全体患者中对该阈值进行了验证。该研究发现，在开始治疗前，CTC数值≥5个的患者无进展生存期和总生存期都比< 5个的患者更短，无进展生存期中位值分别为2.7个月和7.0个月，P < 0.001；总生存期中位值分别为10.1个月和> 18个月，P < 0.001。此外，在患者的第一个周期治疗结束后进行检测，依然是类似的结果，无进展生存期中位值分别为2.1个月和7.0个月，P < 0.001；总生存期中位值分别为8.2个月和> 18个月，P < 0.001。多变量Cox回归分析发现，在统计学模型的所有变量中，基线以及第一次随访时的CTC数值是患者无进展生存期和总生存期最有意义的预测因子。
这项工作为今后的CTC研究带来了深远的影响，不管是我国2013年报道的多中心注册临床试验CBCSG004，还是Bidard于2014年对欧洲17家中心研究的荟萃分析，均进一步验证了这项研究的成果。基于上述研究成果，CellSearch系统在包括我国在内的多个国家得以批准用于临床，为患者治疗方案的制订提供了重要的参考。
液态活检的另一个途径是游离DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）监测。ctDNA是肿瘤细胞在代谢、凋亡或坏死过程释放到血液中的DNA，其变化可以反映肿瘤的生长情况并且已在多个研究及临床试验中被检测到。ctDNA是一个显示肿瘤负荷的敏感指标，可用于乳腺癌筛查和监测乳腺癌的病情变化；对ctDNA的动态监测或可提供肿瘤进化的信息并且找出治疗靶点，而深度测序的发展则将推动ctDNA迈向临床。