第5章 乳腺癌患者血清分子标志物与循环肿瘤细胞检测
第一节 血清分子标志物检测
乳腺癌相关生物标志物检测用于乳腺癌的预后预测、术后监测、治疗方案选择及晚期患者疗效监测，对临床个体化治疗具有较好的指导作用。生物标志物检测临床应用需满足以下几点：①标本易收集；②费效比高便于普及；③具有较高的敏感性和特异性。评价肿瘤标志物主要考虑其实用性、可靠性及在肿瘤评估中的权重。
一、糖蛋白抗原
研究显示，肿瘤特异性大分子糖蛋白抗原（carbohydrate antigen，CA）CA15-3、癌胚抗原（carcino embryonic antigen，CEA）和CA125可用于乳腺癌复发转移的监测，以及晚期乳腺癌化疗的疗效评估。其他标志物包括组织多肽抗原（tissue polypeptide antigen，TPA）、组织多肽特异性抗原（tissue polypeptide specific antigen，TPS）及可溶性人表皮生长因子受体 2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）。
（一）黏蛋白抗原CA15-3
黏蛋白抗原CA15-3最早从乳腺癌细胞中发现，包括膜区、细胞内区和富含糖基的细胞外区3部分，可被115D8和DF3等膜抗体识别，在多种腺癌的癌细胞内存在，如乳腺癌、肺癌、卵巢癌及胰腺癌等。细胞癌变时，细胞内糖基转化酶被激活，其表面CA15-3增加，从癌细胞膜表面分离出来，血清中含量增多，其具有肿瘤特异性，尤其是器官特异性。CA15-3产生于乳腺癌细胞中，可通过细胞膜释放入血，是一种乳腺癌相关抗原。在乳腺癌患者体内，血清CA15-3水平的变化与病情进展相平行，是疾病发生、发展、复发和转移的重要信号，而且这种信号比临床症状和影像学检查如超声、X线或CT均要较早出现。正常人血清CA15-3水平为22～30U/ml，健康人群血清水平的参考值为25U/ml。早期乳腺癌血清CA15-3敏感性低，以> 25U/ml为异常作为标准，其在乳腺癌诊断中具有重要作用，阳性率为22.5%～40.2%。研究表明，当血清CA15-3分别> 30、40和50U/ml时，在评估乳腺癌患者术后有无复发或转移时，其特异性分别为95%、99%和100%，阳性率分别为56%、83%和100%，而敏感性均> 90%。当患者有明显转移灶时，CA15-3阳性率可达到75%～91%。CA15-3水平与乳腺癌患者临床分期、有无淋巴结转移等存在相关性，与年龄、绝经情况及肿瘤受体等无相关性。乳腺癌患者Ⅰ和Ⅱ期CA15-3阳性率为0～36%，Ⅲ和Ⅳ期阳性率为29%～92%，特异性为85%～100%，灵敏度为86%～87%。可见，血清CA15-3水平与乳腺癌患者病情进展呈正相关，而与治疗效果呈负相关，可作为乳腺癌预后评估指标。
研究表明，乳腺癌患者确诊时或术前血清CA15-3水平较高者预后不佳，可能是CA15-3参与肿瘤微转移或隐匿性转移，而这通过临床表现或影像学检查无法发现。如患者血清初始CA15-3水平较高，应进一步检查是否存在转移。术前CA15-3水平可联合其他预后因素用于新发乳腺癌患者的管理。除了欧洲肿瘤标志物组织（European Group on Tumor Markers，EGTM），目前尚无其他学术组织推荐CA15-3用于早期乳腺癌预后的监测。
乳腺癌转移也与血清CA15-3水平存在相关性，尤其是存在远处转移的患者CA15-3可明显增高，故CA15-3可对乳腺癌转移有一定的监测作用。如果血清CA15-3水平持续增高，则应进行相应的检查。Gioia等对血清肿瘤标志物水平升高的无症状患者行全身磁共振成像（MRI）或PET-CT检查，以期及早发现肿瘤复发。每6周检测CA15-3、CEA和CA125水平，813例患者中有44例标志物水平升高；MRI或PT/CT扫描结果显示，44例患者中，29例发现有远处转移，6例发生乳腺外肿瘤，9例无肿瘤存在的证据。另外一项研究显示，65%的血清标志物升高的患者通过PET/CT扫描发现肿瘤复发转移。对部分乳腺癌根治术后患者而言，血清标志物可以早期发现肿瘤复发，但包括美国临床肿瘤学会（American Society of Clinical Oncology，ASCO）、欧洲肿瘤内科学会（Europen Society for Medical Oncology，ESMO）、及美国国立综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）在内的多数乳腺癌指南反对将其用于乳腺癌术后无症状患者的复发监测。由于缺乏前瞻性对照研究，无法证明患者的生存获益情况。但EGTM专家组推荐，血清CA15-3和CEA可用于乳腺癌复发或无症状乳腺癌早诊的检测指标。推荐在肿瘤确诊后5年内每2～4个月检测1次，随后3年内每6个月检测1次，其后每年检测1次。这些建议为专家共识，并不具备高级别证据。
临床研究表明，血清CA15-3水平与治疗效果存在密切相关性。CA15-3水平异常增高的乳腺癌患者在术后均明显下降，趋于正常参考值范围；而术后复发患者，CA15-3水平多再度升高。在乳腺癌术后随访的动态观察中，CA15-3在参考范围内，但如果其水平呈明显增高趋势，也提示乳腺癌转移或复发的可能。而肿瘤负荷大，转移范围广泛的患者其CA15-3水平比单发转移者高。
在肿瘤治疗过程中，多数患者会发生药物抵抗进而肿瘤发生进展。疗效预测标志物可以帮助医生预测肿瘤治疗的疗效，并根据情况及时调整治疗方案。通过检测血清标志物水平实时监测患者对系统性治疗的反应，是一种成本低且损伤小的方法。用于监测乳腺癌治疗疗效最常用的标志物是CA15-3，其他常用的标志物包括CEA、TPA和TPS。一般情况下，肿瘤标志物水平随药物耐药及肿瘤进展而升高，反之水平降低。但多数患者肿瘤标志物血清水平变化并不与肿瘤进展或消退平行。ASCO指南建议，不可将CA15-3单一指标用于疗效检测，可结合影像学结果、病史及体检结果综合应用于疗效检测。专家建议在治疗不可测量病变的情况下，CA15-3水平升高可提示治疗失败。美国临床生化科学院（National Academy of Clinical Biochemistry，NACB）指南与ASCO类似，该指南指出，对于不可测病变的患者，CA15-3水平连续2次持续升高（即升高水平> 30%）则提示疾病进展，应终止治疗、调整方案或寻求新的治疗方法。EGTM专家组推荐晚期乳腺癌每次化疗前检测CA15-3水平，如接受内分泌治疗则每隔3个月检测1次。认为CA15-3水平升高> 25%有临床意义。如CA15-3水平升高，应在1个月内再次复查确认；而如果血清水平下降> 50%则认为治疗有效。
（二）癌胚抗原
CEA是一种具有人类胚胎抗原特异决定簇的酸性糖蛋白，属于肿瘤细胞表面结构抗原。其主要存在于胎儿体内，出生后含量极低。当细胞的基因调控受到损伤后，体内相关胎儿蛋白可重新合成，肿瘤细胞可大量合成CEA，并释放入血，故血清CEA明显增多。CEA在细胞识别中作为一种黏附分子发挥作用，可干扰正常有效的细胞内或细胞与胶原间的黏附力，使细胞移动增强、组织结构有序性下降。正常成年人血清中CEA < 3.4ng/ml。CEA是一种广谱肿瘤标志物，可在多种恶性肿瘤中表达，主要用于辅助诊断恶性肿瘤、判断肿瘤分期和病变进展程度、监测治疗效果和疾病复发等。
由于乳腺癌患者血清CEA测定其灵敏性和特异性不强，仅约10%乳腺癌患者血清CEA超过阈值。因此，不适于乳腺癌的早期诊断和筛查。乳腺癌患者术后血清CEA持续升高，提示肿瘤复发或转移，乳腺癌组织CEA染色阳性率为42%～83%。CEA对乳腺癌的早期诊断敏感性及特异性不高，但转移性乳腺癌患者血清CEA可明显升高，在晚期乳腺癌中的阳性率为40%～50%，且在治疗有效时降低。因此，CEA可作为转移性乳腺癌的预后标志。CEA与肿瘤大小及淋巴结受累情况相关，可反映乳腺癌的进展程度，Ⅰ期和Ⅱ期乳腺癌阳性率为13%～24%，Ⅲ期和Ⅳ期乳腺癌阳性率为40%～73%，发生远处转移尤其骨转移的乳腺癌患者，CEA明显升高。血清CEA作为乳腺癌术后内脏转移的标志物，其敏感性、特异性和阳性预测值均为30%左右。人类乳汁不显示CEA反应，良性囊肿液CEA水平< 100ng/ml，乳头溢液CEA测定对诊断早期乳腺癌有一定的灵敏性。测定乳头溢液CEA用于早期诊断乳腺癌的研究发现，溢液CEA水平与癌灶组织CEA的表达高度相关，而与肿瘤大小、血清CEA水平无相关性。
（三）黏蛋白抗原CA125
黏蛋白抗原CA125存在于体腔上皮衍生组织中，包括心包膜、胸膜和腹膜等。健康人群血清CA125的上限为35U/ml。CA125是卵巢癌和子宫内膜癌的首选肿瘤标志物，在其诊断、预后评估、疗效评价及复发转移监测中有较好的应用价值。CA125特异性不高，胰腺癌、肺癌、输卵管癌、宫颈内膜腺癌、乳腺癌、结直肠癌和胃癌中均可升高，在某些良性疾病如肝炎、肝硬化、子宫内膜异位症、子宫内膜炎和心包炎的患者也可升高，在良性和恶性渗出液中CA125亦有不同程度的升高。CA125对早期乳腺癌的敏感性很低，但当乳腺癌患者发生肺转移或出现恶性胸膜渗出液时CA125可显著升高。有文献报道，乳腺癌患者血清中CA125的阳性率为24%～31%，尤其在伴有淋巴结转移的乳腺癌患者中，血清CA125阳性率可达至40%～45%，故CA125也可作为乳腺癌联合检测中的项目之一。与CA15-3联合，可显著提高灵敏性，均阳性者可视为晚期乳腺癌，对辅助治疗的选择有参考价值。
（四）其他可用于联合检测血清肿瘤标志物
E选择素（E-selectin）是细胞黏附分子选择素家族中的重要成员，能介导血小板、内皮细胞与中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞之间的黏附，同时可增强肿瘤血管生成以及远处病灶中肿瘤细胞与内皮细胞的黏附，在多种肿瘤的进展过程中发挥作用。健康人血清中含量< 40ng/ml，乳腺癌的早期约为60ng/ml，用于诊断的阳性率为30%～70%，均随乳腺癌分期的进展而升高。研究发现，乳腺癌患者组织中E-selectin的表达强度和（或）患者血浆中的浓度与乳腺癌预后密切相关，其高表达提示患者预后较差，易发生侵袭转移。
细胞间黏附因子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1-1）亦属于细胞黏附分子，是分布在多种细胞表面，参与细胞间的黏附、免疫调节、肿瘤的浸润和转移的细胞分子。健康人血清中含量< 250ng/ml，乳腺癌患者可达350ng/ml，随分期的进展而进一步升高。为免疫球蛋白家族成员之一，主要分布于内皮细胞、成纤维细胞和肾上皮细胞等，参与介导细胞间黏附、识别，在肿瘤浸润和转移、机体免疫功能调节及肿瘤诊断预后等方面具有重要意义。研究表明，ICAM-1在包括乳腺癌在内的多种恶性肿瘤患者中血清阳性率明显高于良性患者。天津医科大学肿瘤医院乳腺科赵晶等联合检测正常人群、乳腺良性肿瘤患者及不同分期乳腺癌患者中血清E-selectin、ICAM-1、CEA和CA15-3水平，结果表明，4种肿瘤标志物在乳腺癌患者、良性肿瘤患者及正常人群血清浓度中差异有统计学意义。同时随着疾病的进展，其浓度也出现明显增加，早期乳腺癌、局部进展期乳腺癌及转移性乳腺癌中，其血清浓度差异均有统计学意义，P < 0.01。表明E-selectin、ICAM-1、CEA和CA15-3均为乳腺癌重要的血清标志物，在肿瘤的发生、发展及转移过程中发挥重要的作用，对于进展期乳腺癌患者进行血清监测，能有效判断病情，若出现血清指标的早期升高，应予以高度重视和密切观察。
二、BRCA1和BRCA2基因突变检测
乳腺癌发生发展过程中，多种基因参与乳腺癌的发病过程，其中BRCA1和BRCA2研究较多。对于家族性及非家族性乳腺癌患者，进行BRCA1/BRCA2突变筛选，不仅有助于乳腺癌的预防和继发肿瘤的早期检测，而且有利于BRCA1/BRCA2基因突变乳腺癌患者一、二级亲属的遗传咨询。2015年ASCO指南已将该检测用于家族性乳腺癌的妇女、年轻乳腺癌妇女和遗传倾向者的疾病管理。BRCA1/BRCA2突变筛选常用标本为待检者外周血，提取DNA后进行检测，因此，BRCA1/BRCA2突变不属于严格意义上的血清标志物。鉴于其在乳腺癌患病高风险人群筛查中的重要作用，在此一并介绍。
BRCA1/BRCA2均为抑癌基因，参与DNA双链断裂修复过程，对维持DNA的完整性至关重要，但两者生物学功能不同且功能无交叉。两者突变占乳腺癌突变的比例为15%～25%。一项前瞻性研究结果显示，年龄< 70岁的BRCA1和BRCA2突变携带者罹患乳腺癌的风险分别为60%和55%；该研究还发现，卵巢癌的罹患风险分别为59%和16.5%。乳腺癌患病风险的个体差异与突变位点、突变类型及环境因素密切相关。BRCA2突变与胰腺癌及前列腺癌的发生密切相关，BRCA1则无此相关性。对于乳腺癌和卵巢癌高风险家族而言，BRCA1/BRCA2基因检测可作为风险评估常规项目。美国预防服务工作组（US Preventive Services Task Force，USPSTF）建议，如果女性就诊者家族中有乳腺、卵巢、输卵管或腹膜癌患者，应对该女性进行筛查，可以帮助医生更精确地评估个体或家族中其他女性的乳腺癌发生风险，做到早诊断和早预防。对基因发生突变的女性，可提供建议降低乳腺癌的发病风险或定期随访实现早期诊断。建议包括定期X线摄影检查、MRI、预防性双侧乳腺切除、卵巢切除或预防性应用他莫昔芬或雷洛昔芬等药物。USPSTF推荐对乳腺癌高风险人群或药物不良反应低风险人群预防性应用他莫昔芬或雷洛昔芬。
三、微小RNA和循环肿瘤DNA
微小RNA（miRNAs，简称miR）为双链非编码RNA，20～25核苷酸大小，是许多基因的关键调控因子。不同研究已经报道了组织特异相关的miR。在乳腺癌细胞中，> 300个miR被用于评估它们与乳腺癌的关联，其中较有前景的miR包括miR-29a、miR-30b、miR-342-5p和miR-520a-5p。功能分析揭示了这些miR在细胞增殖和信号传递中的作用，可用于乳腺癌细胞的亚型鉴定。运用5-甲基胞嘧啶免疫沉淀反应组合miR覆瓦式（tiling）微阵列分析对miR编码区域的启动区进行了评估，发现数个miR启动子呈高甲基化，尤其是miR-31、miR-130a、miR-let7a-3/let7-b、miR-155和miR-137。miR通过结合其目标mRNA而发挥作用。由于miR-155高表达与肿瘤血管生成和侵袭性相关，miR-155可用于三阴性乳腺癌的预后判断。总之，miR检测可能用于乳腺癌筛查和发病前的风险评估。此外，miR表达谱可能作为乳腺癌预后和生存预测的潜在标志物，但现有的乳腺癌指南还未将miRNA用于乳腺癌的临床评估，miRNA作为潜在标志物用于临床尚需要深入研究。
同传统的生物标志物及循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTC）一样，肿瘤细胞释放核酸如DNA、RNA及micro-RNA入血。血液中DNA大部分来自正常细胞释放，小部分为肿瘤细胞释放的DNA。肿瘤来源的DNA在血浆总DNA中的比例≤1%甚至低至< 0.01%。乳腺癌患者血液的遗传改变包括突变、杂合性缺失及甲基化状态的变化，这类发生变化的DNA来自肿瘤细胞，正常细胞不会发生类似改变。研究表明，肿瘤来源突变DNA可作为乳腺癌治疗疗效监测的敏感标志物，但检测成本较高，目前只适用于实验室研究。
（欧江华 周长春 宣立学）