第二节　胚胎干细胞

胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES细胞）是最经典的一种多能性干细胞，特指哺乳类动物着床前囊胚内细胞团（inner cell mass，ICM）在体外特定条件下培养和扩增所获得的永生性细胞。虽然ES细胞与内细胞团的细胞有相似的特征，但ES细胞并不能等同地代表体内内细胞团的细胞。内细胞团的细胞只短暂地存在于胚胎发育的早期，而ES细胞通过适应体外的培养环境可以长久生存。早在上世纪八十年代初英国科学家John Martin Evans等人就首先成功地分离培养了小鼠ES细胞。而人的ES细胞是在1998年由美国科学家James Thomson分离培养成功。

作为多能性干细胞，ES细胞具有两大特征，即发育的多能性（pluripotency）和无限的自我更新（self-renewal）的潜能。发育的多能性是指ES细胞具有自发地分化成为体内任何种类的细胞的能力，通常包括胚胎发育中三个胚层（内、中、外胚层）来源的细胞和生殖系的细胞；而无限的自我更新能力是指在体外培养中可以长期地自我复制，产生大量的相对均一的多能干细胞。

一、胚胎干细胞起源

胚胎干细胞起源于哺乳动物受精后5天到达囊胚期，囊胚是胚胎的早期阶段，尚未种植于子宫内膜。囊胚由内细胞团和滋养层细胞组成，滋养层细胞发育为胎盘，内细胞团（inner cell mass，ICM）包含13～25个细胞，最终发育为身体的全部分化细胞。ICM细胞基因组的分化基因几乎全部甲基化而沉默，其增殖潜能受到抑制。

ICM细胞或非哺乳动物其等同细胞，可用于培养获得ES细胞。鱼、鸟等一系列哺乳动物均已建立ES细胞系。首次建立人类ES细胞系是通过辅助生殖技术体外受精后的废弃冻融囊胚得到。

制作人类或小鼠ES细胞系的程序。小鼠ES细胞多潜能性的表现是通过将其移植到囊胚，参与组织器官的分化，将其移植入免疫缺陷小鼠中，其将分化成包含三胚层代表的畸胎瘤。人类ES细胞在畸胎瘤实验中，与小鼠一样，但显然不能将ES细胞用于实验。小鼠ES细胞形成球形集落并需要LIF通过STA3信号通路维持其多潜能性。BMP4与LIF协同作用，通过激活分化移植基因维持ES细胞的状态。小鼠ES细胞能在不包含血清和滋养层细胞，只存在LIF和一些小分子的情况下激活Wnt信号通路并抑制ERK1/2和GSK3β激酶活性。人类ES细胞形成扁平集落并需要FGF-2、Activin、Lefty2和IGF信号分子维持。人类ES细胞不能像小鼠那样维持未分化状态。事实上，像小鼠那样维持未分化状态的培养条件，在人类ES细胞中是不可用的。

二、胚胎干细胞多分化潜能的表观遗传学基础

ES细胞能无限增殖并保持多潜能性。一系列转录因子，包括 Oct4、Sox2、Nanog、Tcf3、Klf4、c-Myc、ESRRB、Sall4、Tbx3和STAT3一起维持人和小鼠ES细胞的多潜能性。发育的小鼠胚胎其多潜能细胞逐渐受到限制，只能分化成外胚层细胞。外胚层细胞在原肠胚前具有自我更新能力及多分化潜能，当经历核转录因子沉默后，分化基因激活，随后向三胚层及其衍生物分化。外胚层来源的ES细胞与ES细胞来源的ES细胞相比，具有不同的生长特性、转录特性及分化特性。

ICM来源ES细胞的表观遗传学特征是在受精及合子种植前发育过程中形成的（图2-9）。当合子经过桑葚胚发育到囊胚期时，染色体经过表观遗传学调整，激活内细胞团维持多潜能性的基因并抑制其分化基因。这些调整通过组蛋白、DNA甲基转移酶、去甲基化酶、组蛋白乙酰转移酶、去乙酰化酶在DNA本身CpG岛组蛋白特定氨基酸上添加或去除乙酰基、甲基基团。这些表观遗传学标记决定染色体的包装程度及转录活性。多分化潜能基因是低甲基化的，分化基因是高甲基化的。分析人ES细胞与胎儿肺成纤维细胞的组蛋白乙酰化和甲基化与DNA甲基化，发现分化包含显著的表观遗传学调整。Micro RNA（miRNA）与分化基因抑制有关，是分化发生中必经的过程。miRNA加工酶缺陷的ES细胞不能正常增殖，Oct4表达不能完全降调，因此分化受到抑制。

在多潜能细胞分化过程中，控制多分化潜能的基因表观遗传学沉默、分化基因激活是如何控制的尚不清楚。Loh和Lim指出个别多潜能细胞因子过表达能促进ES细胞分化而不是加强其未分化状态，表明转录模式决定表观遗传学密码的改变。为解释这种现象，他们指出个体多潜能转录因子明确区分胚胎分化并相互间持续竞争，使得多潜能性是一种只能通过外源生长因子来维持的不稳定状态，当这些因子消失后分化方向就已明确。

三、胚胎干细胞的类型

ES细胞来自哺乳类动物发育早期着床前囊胚的胚胎细胞在体外特定条件下培养而获得的多能干细胞系，可根据囊胚来源的不同进一步分为以下三类。

1.来源于正常受精发育的囊胚

对于动物研究，如最常用的小鼠，可以从动物体内（3.5天孕鼠）获取囊胚并建立ES细胞系。但人ES细胞建系（目前在NIH注册的人ES细胞系）都是从卵母细胞体外受精发育到囊胚期的内细胞团获得，也称为人受精ES细胞（human fertilization embryonic stem cell，hfES Cells）。这种ES细胞表达父本和母本的表面抗原，它们对母卵细胞和精子的提供者及其他人都会引起同种异体免疫排斥。这一技术较成熟，所得到的ES细胞系未经任何修饰，最接近自然状态。

2.来源于体细胞核转移重组胚发育的囊胚

将体细胞的细胞核转移到去核的未受精卵母细胞中，经体外培养也可形成囊胚。分离、培养其内细胞团，可以获得ES细胞系。这种重组胚胎产生的ES细胞称为核转移ES细胞（nuclear transfer ES cells，ntES cells），是由于卵母细胞的胞质成分激活了移植的体细胞核使其重新编程（reprogram）的结果。从理论上讲，这种ES细胞所表达的细胞表面抗原应与核提供者大部分一致，从而解决ES细胞分化获得的功能细胞用于细胞移植的免疫排斥问题，这就是治疗性克隆的概念。ntES细胞与细胞核提供者在基因水平的差异仅存在于线粒体的基因。目前，在小鼠、猴和人类已成功建立这种ntES细胞系。建立人核移植的ES细胞系，不仅可以解决ES细胞衍生的功能细胞移植的免疫排斥问题，也可以利用患者的体细胞核与未受精的去核卵母细胞融合建立核移植ES细胞系，作为研究疾病的细胞模型。此外，这样的ES细胞系，也为研究基因的调控和印迹基因的表达提供细胞模型。因此，建立人核移植的ES细胞系有着重大的理论意义和应用前景。但是，由于卵细胞供体的缺乏和核移植效率问题，建立人的核转移ES细胞系的技术并未得到推广和应用。

3.来源于孤雌发育的囊胚

孤雌发育指用化学或电刺激等方法激活未受精卵母细胞并使其发育为胚胎的过程。从孤雌发育的囊胚的内细胞团分离培养的ES细胞称为孤雌ES细胞（parthenogenetic or parthenote embryonic stem cells，pES cells）。目前，小鼠、猴和人的pES细胞建系已获成功，并有报道能够将小鼠pES细胞体外诱导分化为神经元，甚至是受到广泛关注的多巴胺神经元。pES细胞的主要优势有：一是人pES细胞表达的表面抗原与卵母细胞提供者基本一致，由此排卵期妇女可望用与自体免疫原性一致的干细胞治疗自身的疾病或组织损伤。二是人pES细胞只含有母本染色体，基因型为纯合子。同种异体之间的细胞或器官移植，包括基于异体干细胞的供体细胞治疗，都会因为主要组织相容性复合体（the major histocompatibility complex，MHC；人类为HLA，human leucocyte antigen）基因型的不同而出现免疫排斥，导致移植失败。由于HLA基因的高度复杂性和在人群中的高度多态性，一般人群中HLA杂合型的干细胞供体所能匹配的受体极其有限。而pES细胞的HLA基因位点基本为纯合子的优势，使得与其相配的受体群体数量非常明显地增大，可被用于细胞治疗的可能性更加接近现实。尤为重要的是，纯合子干细胞技术使创建一个覆盖人群中多数表型的ES细胞库、为治疗各种疾病提供同种异体的供体细胞成为可能。三是孤雌激活的哺乳类胚胎不能发育为个体的特性使建pES细胞系的研究避免了克隆人的伦理争议。此外，与ntES细胞相比，pES细胞所涉及的技术难度低、成功率高。还有，pES细胞表观遗传（epigenetic）的改变可作为研究细胞表观遗传学和基因印迹（genetic imprinting）的极好模型。总之，对人类疾病的细胞替代治疗和基础研究而言，pES细胞具有其独特的优势。

4.来源于单倍体囊胚

所有哺乳类动物的体细胞都携带有两套染色体（分别来自父亲和母亲），即二倍体细胞。以上介绍的三种ES细胞都是利用正常二倍体细胞组成的胚胎建立的。2011年，英国和奥地利的科学家分别利用孤雌发育的单倍体胚胎建立了小鼠单倍体ES细胞系，并利用这样的细胞系进行了正向或反向遗传筛选（forward or reverse genetic screen），以及基因敲除实验。2012年，中国科学院周琪和李劲松领导的研究组分别利用孤雄发育的囊胚建立了小鼠单倍体ES细胞系。这些单倍体ES细胞，与正常二倍体的小鼠ES细胞一样，表达多能性标志性分子，具有在体内和体外分化形成三个胚层来源的各种细胞的能力。当把这样的单倍体ES细胞注入小鼠囊胚时，它们在嵌合体中参与生殖系细胞的分化。值得一提的是，孤雄单倍体ES细胞具一定的精子表观遗传特点。周琪和李劲松研究组的工作都显示，当把孤雄的单倍体ES细胞注入成熟的卵母细胞时，可以获得具有生殖能力的小鼠。这两个研究组还分别尝试了利用孤雄单倍体ES细胞进行转基因和基因敲除实验。这些研究结果展示了单倍体ES细胞在进行基因修饰和遗传筛选，尤其是发现调节隐性遗传特征的基因方面的优势。虽然长期维持这些ES细胞的单倍体状态需要反复地进行单倍体细胞的分选，但单倍体ES细胞系的建立对加速我们对哺乳类动物基因功能的认识具有特殊的意义。2013年，上海干细胞研究人员李劲松、孙强和金颖的课题组合作建立和研究了非人灵长类食蟹猴的单倍体ES细胞系。最近，人类孤雌单倍体ES细胞系被成功地建立。该研究指出，人类单倍体ES细胞具有与正常二倍体ES细胞类似的多能性状态和分化能力。

四、胚胎干细胞的生物学特性

ES细胞作为细胞的一种，具有所有细胞的共同属性。同时，作为一类特殊的细胞，又有其特有的属性。通过研究了解这些特性并不断加深认识，有助于理解干细胞作为研究对象的重要意义和可能的临床应用，最终达到利用干细胞造福人类的目的。基于已有的研究，现从基本特性、形态学特征、分子标记、细胞周期特征和端粒酶活性几个方面对ES细胞的特殊属性归纳如下：

1.ES细胞的基本特性

ES细胞比其他细胞受到格外的广泛关注，主要是由于ES细胞有其他细胞所不具有的生物学特性。这些特性中，以其无限的自我更新能力和分化的多能性最为重要。

（1）具有无限的自我更新能力：

自我更新是指亲代细胞（母细胞）分裂后产生的子代细胞保持了母细胞的所有特征。所有干细胞都具有自我更新的特性，而ES细胞具有无限的自我更新的潜能，换句话说，ES细胞能够在体外合适的培养条件下长久地对称性分裂并保持未分化状态。理论上，这一特性使人们可以得到无限量的ES细胞。处于未分化状态的具有自我更新能力的单个ES细胞能够在贴壁培养时形成鸟巢样克隆，一旦细胞开始分化，就失去了形成克隆的能力。所以，通常通过克隆形成实验来检验ES细胞的自我更新能力。小鼠ES细胞形成集落的能力很强，在合适的培养条件下，可达到90%以上的形成率。而人ES细胞单细胞形成集落的能力很低（约0.1%），即便在ROCK抑制剂存在的条件下，集落形成率也远低于小鼠ES细胞。

（2）分化的多能性：

在长期维持自我更新的同时，ES细胞保留其多向分化潜能。ES细胞所具有的自发地或被诱导分化为生物体内任何种类细胞（包括生殖细胞）的能力，被称为分化的多能性。正是这一特性使ES细胞可以在特定的条件下分化为不同的细胞，用于治疗特定的组织器官的疾病或修复受损伤的组织器官。验证ES细胞分化多能性的方法有体外和体内两大类方法。体外方法主要用类胚体（embryoid body，EB）形成实验。EB是ES细胞撤除维持自我更新的生长因子并在悬浮培养中形成的球形细胞聚集体。EB中的ES细胞可自发地分化为胚胎三胚层来源的各种细胞。这些不同胚层来源的细胞可以通过直接对EB切片进行组织化学染色确定，也可以把EB放回细胞培养皿使其贴壁生长，待分化的细胞从EB向外生长时，再根据分化细胞的形态和免疫细胞化学检查鉴定细胞的种类。体内验证方法主要有两种：一种是畸胎瘤（teratoma）形成实验，另一种是嵌合体（chimera）形成实验。在畸胎瘤形成实验室中，通过皮下、肌肉内、肾包膜内及精囊内等途径，将一定数量的ES细胞注入与ES细胞来源小鼠同一品系的小鼠或者免疫缺陷的小鼠体内。当ES细胞在小鼠体内成瘤后，取出瘤体进行组织化学检查。根据瘤组织的形态可以鉴定不同种类的细胞和组织结构。如果ES细胞所形成的畸胎瘤含有胚胎三胚层来源的细胞或组织，就证明了注入的ES细胞具有分化的多能性。嵌合体形成实验是把待检查的ES细胞注入受体小鼠的囊胚，并把接受了供体ES细胞的囊胚移入假孕小鼠的子宫。供体ES细胞会与受体囊胚内细胞团的细胞一起参与胚胎的发育。当供体ES细胞和受体囊胚选自毛色不同的小鼠品系时，如果供体ES细胞参与了受体胚胎发育，就可以获得毛色掺杂的新生小鼠，即形成了嵌合体。也可以对新生小鼠的各组织器官进行组织化学检查，根据供体ES细胞参与胚胎发育的组织器官分布来评估供体ES细胞的发育潜能。最后，把杂毛的嵌合体小鼠与提供受体囊胚的小鼠进行杂交，得到与供体ES细胞来源小鼠同色的纯毛小鼠，说明供体ES细胞在嵌合体中参与了生殖细胞的发育，发生了生殖系传递（germline transmission），这是具有ES细胞发育多能性的有力证明。当然，对小鼠等动物，检验ES细胞发育能力还有更严谨的方法，即四倍体囊胚互补（tetraploid blastocyst complementary）实验。该方法是将发育到两细胞期的胚胎融合，得到四倍体的两细胞胚胎。继续使后者在体外发育到囊胚期时，将待检验的ES细胞注入其中，并把囊胚植入假孕小鼠的子宫直至生出子代小鼠。由于四倍体的细胞只能发育为胚外组织，新生小鼠体内所有的细胞都是由供体ES细胞而来，从而直接证明了供体ES细胞的分化和发育的多能性。

值得特别强调的是，以上体外方法和体内方法中的畸胎瘤实验可以用于小鼠等动物和人的ES细胞多能性检验。而嵌合体形成实验和四倍体囊胚互补实验，尽管最为有效，由于伦理的限制，通常不能用于人ES细胞的多能性检验。

（3）能保持正常的二倍体核型：

ES细胞的这一特征主要可以将其与EC细胞区别开来。EC细胞的一个特征是核型不正常。虽然小鼠ES细胞可以在体外长期培养中保持正常核型，但也常能发现核型异常的细胞。此时可挑选核型正常的ES细胞克隆建立新的亚细胞系。人ES细胞在体外培养中也很容易发生核型异常，尤其在通过酶消化传代扩增时更为常见，如出现12号染色体三体或17号染色体三体细胞。但如果用机械法传代，人ES细胞可以在体外长期保持正常核型。因此，为了保证研究，尤其是细胞治疗中所用的ES细胞的质量，应该定期对ES细胞进行核型检查。此外，还可以采用更为灵敏的检测手段以便及时发现核型检查所不能确定的遗传变异。

（4）容易进行基因改造：

通过同源重组在ES细胞进行基因打靶（knock-out和knock-in）实验，也可以在ES细胞过表达外源基因。结合RNA干扰技术，可以在ES细胞特异性地减少某一基因的表达，也可以进行可诱导或条件性减少基因的表达。ES细胞的这一特性为研究基因的功能提供了理想的细胞模型。当然，对人ES进行同源重组基因改造及RNA干扰的技术难度要比在小鼠ES细胞大很多。但已有利用慢病毒（lentivirus）对人ES细胞的有效感染，也可用锌指核酶（zinc finger nuclease，ZFN）及最近发展起来的TALEN和CRISPR/Cas等技术对人ES细胞进行基因修饰。

2.ES细胞的形态学特征

形态上，哺乳动物的ES细胞都具有与早期胚胎细胞相似的形态和结构特征，包括细胞体积小，细胞核大、核质比高，胞质较少、结构简单，具一个或多个大的核仁，胞质内细胞器成分少但游离核糖体较丰富且有少量线粒体。超微结构上看，ES细胞显示未分化的外胚层细胞特性。ES细胞呈克隆状生长，其克隆边缘光滑，细胞致密地聚集在一起，形成类似鸟巢样集落。细胞间界限不清，克隆周围有时可见单个ES细胞和分化的扁平状上皮细胞。与人ES细胞克隆（图2-10）相比，小鼠ES细胞的克隆更为致密（图2-11）。

3.ES细胞的分子标记

人以及不同种属动物来源的ES细胞都表达一些未分化细胞特有的标志性基因，如转录因子Oct-4、Nanog、Sox2、生长因子FGF-4、锌指蛋白Rex-1、碱性磷酸酶等。一旦ES细胞发生分化，这些标志性基因的表达水平迅速下降或消失。近年来，通过大规模的基因表达谱比较，已经发现更多的在未分化的ES细胞中特异表达或高表达的标志性分子。尽管所有ES细胞都表达上述核心的标志性分子，不同种属动物来源的ES细胞也有不同的分子标记，如小鼠ES表达阶段特异性胚胎抗原1（stage-specific embryonic antigen 1，SSEA-1），而人和猴ES细胞的SSEA-1为阴性，却表达SSEA-3和SSEA-4。表2-1显示人、猴、小鼠ES细胞表达的分子标记的异同。

4.ES细胞的细胞周期特征

与分化细胞的细胞周期相比，ES细胞周期的G1、G2期很短，细胞大部分时间处于S期。而且，ES细胞生长增殖比分化细胞快。不同种属来源的ES细胞的周期和增殖时间不同。与小鼠ES细胞相比，人ES细胞需要的增殖时间更长。一般说来，人ES细胞周期需要36小时，而小鼠ES细胞周期只需要12小时。

5.ES细胞的端粒酶活性

端粒是染色体端部的一个特化结构，通常由富含鸟嘌呤核苷酸的短的串联重复序列组成，对保持染色体稳定性和细胞活性有重要作用。端粒酶能延长缩短的端粒，从而增强细胞的增殖能力。分化的细胞中没有端粒酶的活性，所以细胞每分裂一次，端粒也就缩短一些。随着细胞的不断分裂，端粒长度越来越短，当达到某个临界长度时，细胞染色体失去稳定性，进而导致细胞死亡。ES细胞具有高的端粒酶活性，使ES细胞在每次分裂后仍能保持端粒长度，维持ES细胞的长期自我更新。

6.胚胎干细胞的代谢和表观遗传特征

为维持快速的生长特点，ES细胞必须维持能量和代谢的平衡。与分化的细胞相比，人和小鼠ES细胞更大程度上依赖糖酵解（glycolysis）获得ATP。调节糖酵解的酶，如己糖激酶、乳酸脱氢酶，在多能干细胞中呈高水平表达。与此相一致，ES细胞具有低于分化细胞的线粒体氧消耗，高于分化细胞的糖酵解通量。此外，与分化细胞相比，人多能干细胞具有低的丙酮酸脱氢酶复合体的活性，减少代谢底物进入三羧酸循环。多能干细胞所表现的低氧化代谢水平有可能减少活性氧的产生，有利于维护细胞遗传物质和细胞成分。此外，ES细胞的染色体结构处于相对开放状态，在发育相关的基因的启动子区同时有标志基因表达激活状态的H3K4三甲基化修饰和标志基因表达沉默的H3K27三甲基化修饰。这样的表观遗传特定有利于ES细胞在收到分化信号时，迅速表达与分化相关的基因。

五、胚胎干细胞的分离和扩增

最初小鼠ES细胞的建系条件是模拟早期胚胎中内细胞团细胞生长环境，即在小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）构成的滋养层细胞上和血清存在的条件下。后来的研究发现，MEF主要是通过分泌白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）支持ES细胞生长。于是，ES细胞的建系和培养可以在无滋养层细胞，只有LIF和血清的条件下实现。接下来的研究发现，血清中维持ES细胞处于自我更新状态的主要成分是骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）。此发现成为无血清ES细胞建系和培养的基础，在只含有BMP和LIF的培养条件下，小鼠ES细胞既能进行对称性分裂而自我更新、无限增殖；同时，保持通过不对称性分裂而分化为体内任何种类的细胞的能力。相比之下，人ES细胞的特性虽然相似，但其分离和培养要比小鼠ES细胞困难得多。近年来，优化人ES细胞分离和培养条件的研究取得进展，实现了人ES细胞无滋养层培养和单细胞传代，并对人ES细胞在体外培养中的生长特性和基因表达有了更多的认识。此外，人ES细胞与小鼠ES细胞还有其他一些不同之处，如人ES细胞生长缓慢，培养中易出现自发分化；LIF不能支持人ES细胞处于未分化状态；人ES细胞的培养需要在培养液中添加碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）。

人ES细胞分离培养的主要步骤和技术包括：早期人胚胎培养、分离内细胞团、人ES细胞连续传代培养、鉴定和保存。由于人早期胚胎极其珍贵，相关的获取和培养等工作必须严格按照伦理和临床规范进行操作。可与有资质的临床单位合作获得胚胎，根据自己实验室的条件确定胚胎的培养方法，在获得生长到第5～6天的囊胚后，可用免疫分离（immunosurgery）或机械分离方法获得内细胞团。免疫分离内细胞团的方法是1975年由Davor和Barbara教授提出的。其原理是囊胚的滋养层细胞对某些外源抗体具有不可穿透性。当囊胚与抗体和补体分步进行反应后，滋养层细胞可被杀死而内细胞团将被保留，从而获得完整的内细胞团。人ES细胞建系初期的细胞扩增需机械法完成。只有当细胞达到一定数量时才能通过酶消化的方法连续传代培养。在此过程中，可利用胶原酶Ⅵ、Dispase或用机械分离的方法进行传代。这些方法都不是以单个细胞的形式进行传代。胰蛋白酶和木瓜蛋白酶可以将人ES细胞消化成单个细胞。多次用胰蛋白酶处理会使人ES细胞受到损伤和基因组不稳定。与之相比，木瓜蛋白酶比较温和。即便如此，人ES细胞对细胞-细胞联接非常敏感，当人ES细胞被消化成单个细胞时，细胞会发生大规模死亡。人ES细胞对单细胞培养敏感，主要原因就是E-cadherin信号在单细胞化的过程中受到不可逆的损伤。当人ES细胞在较长时间内无法建立依赖E-cadherin的细胞间联系时，ROCK被激活，随后引发的肌动球蛋白超活化（actomyosin hyperactivation）引发细胞凋亡。现在，可以利用Rho相关的卷曲蛋白形成丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶（ROCK）家族的小分子特异性抑制剂（Y27632）处理单细胞消化传代的人ES细胞。此外，传代的密度也很重要，接种的细胞太少不易生长，一般4～6天传代一次。人ES细胞对营养要求很高，因此必须每天换液，细胞一般培养在六孔皿中。

六、胚胎干细胞不同的多能性状态

小鼠ES细胞与人ES细胞之间存在显而易见的差别，例如细胞生长特性、分化能力、对细胞因子的需求等。小鼠ES细胞最关键的功能特征之一是能够经过囊胚移植形成嵌合体（chimeras），并且实现生殖传递（germline transmission）。而人 ES细胞不具备这样的能力。随着小鼠上胚层干细胞（epiblast stem cell，EpiSC）的建立，人们意识到哺乳类动物的多能干细胞具有不同的多能性状态：原始态（naive）和始发态（primed）。原始态多能干细胞处于更原始的多能性状态，对应于小鼠胚胎着床前（pre-implantation）的囊胚上胚层多能细胞；始发态多能干细胞则对应于胚胎着床后（post-implantation）的上胚层多能细胞。这一理论认为在含有白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）和两种抑制剂（2 inhibitors，2i；MEK/ERK1/2抑制剂和GSK3b抑制剂）的条件下培养的小鼠ES细胞处于原始态，而传统的人ES细胞处于始发态。这样，是否存在原始态的人多能干细胞成为了干细胞研究领域关键的科学问题之一。国际上一些实验室开展了建立原始态人ES细胞的尝试。目前，国际上至少有五个研究小组，包括以色列威斯曼研究所Jacob Hanna、新加坡基因组研究所Huck-Hui Ng、美国华盛顿大学Ruohola-Baker、英国剑桥大学Austin Smith和美国白头研究院Rudolf Jaenisch，分别通过基因表达和筛选小分子抑制剂，先后建立了将始发态人多能干细胞转变为与小鼠ES细胞类似的原始态人多能干细胞，或直接分离培养原始态人ES细胞的系统。其中，Jacob Hanna实验室获得的原始态人ES细胞具有形成跨种属嵌合的能力。与传统的始发态人多能干细胞相比，原始态人多能干细胞均一性更好，体外培养更容易维持，更易进行基因编辑操作，具有更强的分化潜能，能够形成异种嵌合体。这些特性使得人多能干细胞具有更加广泛的应用前景。此外，原始态多能干细胞也在大鼠、猴等物种中被成功建立，提示原始态多能干细胞可能广泛地存在于哺乳动物的不同种属中。

目前国际上为数不多的实验室具有建立人原始态多能干细胞的能力。而且，不同研究组建立人原始态多能干细胞的维持条件存在较大差异。这些方法大多使用了基因编辑手段或血清替代因子成分，抑制剂种类较多，花费巨大。因此，发现更适合的建立原始态人多能干细胞的条件是亟待解决的问题。然而，确定人多能干细胞自我更新和多能性不同状态及相互转化的分子基础和调控网络是解决这一问题的关键所在。

七、胚胎干细胞的体外定向分化

根据前面叙及的ES细胞具有无限自我更新和分化多能性的特性，ES细胞不能直接用于人体进行细胞治疗，而必须在体外将其定向分化为受损伤组织所需要的有功能的细胞，通常是特定组织类型的细胞。因此，ES细胞的定向诱导分化，使其产生安全、有效的供体细胞，是ES细胞研究中的重要内容，特别是发现促进形成某种具有特定功能的细胞的重要诱导因子或者是更优化的诱导分化方案。ES细胞体外定向诱导分化的报道非常多、也很分散，但归纳起来主要还是向三个胚层来源的组成重要组织器官的细胞类型的分化。以下以神经外胚层细胞诱导分化为例介绍。

外胚层组织中最重要的是神经外胚层。这也是干细胞研究领域最热门的领域之一，特别是ES细胞向神经细胞的定向诱导分化，为各种神经退行性疾病的治疗带来了希望。

在ES细胞的神经分化领域，已积累了很多经验并建立了多种定向诱导分化技术，主要有：①EB形成方法；②与基质细胞共培养方法；③单层贴壁方法等。ES细胞的神经诱导分化具有较高的分化效率，再通过转基因技术进行细胞分选或筛选，所获得的细胞中神经细胞往往占有很高的比例。目前已能通过ES细胞的神经定向诱导分化获得中枢神经系统的三种主要神经细胞，即神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。通过在诱导分化途径中加入相应的分化调节因子，可获得比例较高的特定类型的神经细胞，如神经元（图2-12）和胶质细胞（图2-13），并进一步获得了如中脑多巴胺能神经元、运动神经元等特定亚型的细胞。利用动物模型，已证明小鼠ES细胞分化获得的神经细胞能整合到受体小鼠中枢神经组织，并检查到了供体细胞来源的三种终末分化的神经细胞；ES细胞分化获得的少突胶质细胞移植进入髓鞘缺失的多发性硬化（multiple sclerosis，MS）大鼠模型能有效地恢复受体大鼠神经轴突的髓鞘化。

类胚体形成和共培养方法可以成功地使人ES细胞向神经细胞分化。然而，这两种分化方法中都有许多未知性和复杂性，这些未知因素严重地影响了人ES细胞来源的神经细胞在细胞替代治疗中的应用。于是，2005年Gerrard和同事们第一次报道了单层细胞诱导的神经分化方法。他们利用BMP拮抗剂Noggin和改造过的化学成分明确的培养液N2B27为诱导环境，从单层培养的人ES细胞中高效地诱导分化出了神经前体细胞（neural progenitor cell，NPC）。与之前小鼠ES细胞的研究结果一致，抑制BMP信号非常有效地促使了神经外胚层命运的决定，并且抑制了胚外内胚层的分化。单层细胞诱导的神经分化方法的优点之一是分化的整个过程，都可以通过显微镜监测每一个细胞的变化。单层细胞诱导的神经分化过程与体内神经系统的发育非常相似。在整个分化过程中，细胞先会变小，然后逐渐出现极性，细胞和细胞排列变得紧密，直到出现标志性的类似神经管的花环状结构（rosette structure）。非常有趣的是，使用Noggin介导的单层细胞诱导的方法得到的NPC，在撤除bFGF和EGF进入神经元分化时得到更多的是γ-氨基丁酸能神经元，而不是像共培养分化方法那样更容易得到多巴胺能神经元，或者是谷氨酸能神经元。当然，在加入特定的形态素后Noggin诱导的NPC还是可以定向特化成为多巴胺能神经元和谷氨酸能神经元。事实上，几乎所有人ES细胞来源的神经前体细胞都有分化成为任意一种特定神经元的潜能，只是使用的早期神经诱导分化方法的不同导致了其分化成某些神经元的潜能大小有所差异。除了BMP的拮抗剂之外，在神经诱导培养液中只加入bFGF也能够使单层贴壁培养的人ES细胞分化为神经细胞。2006年，Shin和同事们在没有使用任何外源性神经诱导因子的情况下，在特定的培养环境下将人ES细胞分化成为可长期增殖的神经上皮细胞（long-term proliferating neuroepithelial，NEP）。同样的神经分化方法在早期的小鼠ES细胞神经分化研究中就有应用。但值得指出的是，这种分化方法并不适用于所有的人ES干细胞系。同时，最新的研究进展显示不同人ES细胞系有着不同的神经分化潜能。可能对每个人ES细胞系都需要找到一种最适合它的高效神经分化方法。

2009年，Chamber等建立了两个抑制剂介导的人ES细胞单层细胞诱导的神经分化方法。这两个抑制剂都抑制SMAD通路，一个是Noggin，另外一个是SB431542，后者特异性地抑制TGFβ超家族的Ⅰ型受体，ALK4、ALK5和ALK7的磷酸化。两个抑制剂相比较Noggin单个因子诱导更快更高效。同时，由于使用了ROCK抑制剂Y27632和单细胞传代，使单层贴壁培养的人ES细胞更加地均一，并且更均匀地暴露在抑制剂的培养液中。使用这个方法能够在3周的时间得到特定分化的运动神经元，与类胚体形成或者共培养的神经分化（30～50天）比较要快很多。因此，双因子介导的单层细胞诱导的神经分化方法被认为是一种更为理想的分化模型。1年后，Wang实验室的研究人员发现了一种TGFβ超家族受体的小分子抑制剂Compound C，可同时替代Noggin和SB431542来诱导人ES细胞向神经分化。Compound C主要通过抑制TGFβ超家族Ⅰ型（ALK2、ALK3和ALK6）和Ⅱ型受体（ActRⅡA和ActRⅡB）来达到同时抑制Activin和BMP信号通路的功能。以上两个研究表明只要能够抑制Activin和BMP两个信号通路的激活，那么就可以有效地（90%）使人ES细胞向神经细胞分化。最近，Chamber等人又改进了双因子单层细胞诱导的方法。他们用小分子LD-193189替代了Noggin，降低分化成本，并且同时分化系统中加入SU5402（FGF受体特异性酪氨酸激酶抑制剂），CHIR99021（GSK3的抑制剂）和DAPT（NOTCH信号通路抑制剂）三个小分子。这样，5个小分子联合使用可以在10天之内得到大于75%的人ES细胞来源的疼痛感觉神经元（nociceptors）。综上所述，通过在单层贴壁培养的人ES细胞中抑制SMAD信号通路，可以快速而有效地得到较为均一的神经细胞，加上其操作的简便性，过程的可视性，使之成为研究神经分化分子机制及再生医学研究的理想实验模型。

八、胚胎干细胞扩增后移植所伴随的风险

ES细胞被认为是再生医学治疗中一种主要的可移植细胞，因为它可以无限扩增提供大量细胞扩增产物并保持其多分化潜能，几乎可以分化成体内任何一种细胞，而且处于零衰老状态。然而，出于这种目的使用ES细胞的风险，必须严格评估。第一，随着培养时间的延长，染色体异常的可能性加大，例如丢失、复制、扩增。这些异常可能会对细胞的分化潜能、存活率、功能的稳定性、成瘤性产生潜在影响。第二，即使上述风险得到解决，另外一个潜在的主要问题是移植来源于人ES细胞的细胞可能错误分化、产生过量的细胞、错误定位、形成肿瘤。对移植的来源于ES细胞的细胞，需要建立限制其染色体异常、测试其分化潜能及功能特性、清除移植后错误定位的细胞、正确分化的方法。另外，比较17种人类ES细胞系发现其中一些细胞系具有分化成某种细胞类型的偏好，通常比特异性基因表达大100倍以上。这些发育潜能的差异表明建立ES细胞谱系确定其最佳分化方向的重要性。

九、体细胞核移植囊胚获得设计“胚胎干细胞”

向非免疫豁免位置移植ES细胞来源的细胞将会受到免疫排斥，不同的ES细胞系具有不同的HLA表型，因此能够建立一个不同ES细胞的细胞库，从而增加匹配的可能性。解决免疫排斥最直接的办法是采用患者自身的体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer，SCNT）来源ES细胞（derived embryonic stem cells，dES细胞），这一技术最初是苏格兰人在两栖类动物身上实现的（Wilmut和Campbell在哺乳动物身上实现）。这种技术是将体细胞核移植到去核卵细胞中（图2-14），供者细胞核染色体携带一整套表观遗传学标记，决定表型相关的转录活动。卵细胞胞质重排供者细胞核的表观遗传学状态，使之处于受精卵阶段发育至囊胚，在囊胚期取出内细胞团培养形成自体ES细胞系。来源于这种细胞系的细胞移植到细胞核捐赠者体内不会受到免疫排斥，因为它表达细胞核捐赠者的MHC抗原。这种设计的dES细胞最初在小鼠身上得到，并且证实可以体外分化成神经元与肌肉。利用dES细胞作为核供体获得的生殖克隆可产生能繁殖的成年小鼠，证明细胞核的多潜能性。最近，猴子身上获得的SCNT囊胚形成的dES细胞被用于分化成分别代表三胚层的细胞类型。人类SCNT囊胚也被用于克隆，但是内细胞团获得的细胞未形成dES细胞。总之，这些实验能够证明人类SCNT有能力形成dES细胞。

利用人类SCNT形成dES细胞有其缺点：①人类卵子短缺；②重编程效率低；③出于人类ES细胞研究的伦理和道德考虑。将人类体细胞核移植到动物去核卵细胞的实验正在探索。2003年Chen等首先报道将人类的阴茎包皮和面部皮肤细胞核移植到兔子的去核卵细胞中成功得到ES细胞。这种杂交细胞的增殖潜能如何现在尚不清楚，但是由于人类细胞核与兔子细胞质线粒体产生的蛋白质存在物种不兼容的问题可能导致其不稳定。生物伦理学问题禁止进行ES细胞研究，尤其是SCNT胚胎得到的ES细胞。对这种问题的争论基于胚胎存在的道德权利及人格权利，并且，随着hiPS细胞的出现不再需要hES细胞作为研究对象。相反的观点认为hES细胞和hiPS细胞均有可能减轻人类遭受各种疾病所带来的痛苦。此外，iPS细胞的出现使得hES细胞的研究就不会发生了，而hiPS细胞是否等同于hES细胞，尚存在许多问题。因此，限制hES细胞的研究本身不道德。

ES细胞系来源于辅助生殖技术中多余囊胚的内细胞团。ES细胞多潜能性的分子基础我们知道得很多，多潜能性的维持是由DNA的表观遗传学密码决定，包括特定组蛋白氨基酸残基的乙酰化和甲基化，基因启动子的甲基化形式，micro RNA的作用。维持多潜能性的关键基因包括Oct4、Sox2、Nanog、Tcf3以及Klf4、c-Myc、ESSRB、Sall4、Tbx3和STAT3。这些基因的启动子区甲基化水平很低，乙酰化水平很高，分化相关基因与之相反。在体内ES细胞可以定向分化成多种细胞类型，通过多潜能基因的沉默和分化基因的激活而实现。然而ES细胞来源细胞可能受到免疫排斥。通过SCNT从自体大鼠和猴子中获得的囊胚培养出ES细胞，人类SCNT已经克隆，但未能将内细胞团培养成ES细胞。无论生物伦理学怎样评价这些技术，制作这种设计的ES细胞系效率很低，以至于这种技术不可能用于自体移植。结缔组织和骨髓经过长期培养也可以获得ES样细胞。

十、胚胎干细胞的应用

干细胞之所以能引起世界范围的关注是因为它有着广泛的基础研究和临床应用前景。简要地讲，ES细胞的应用大致可归纳为三个方面：首先是利用ES细胞的分化作为体外模型研究人类胚胎发育过程以及由于不正常的细胞分化或增殖所引起的疾病，如发育缺陷或癌症等；其次是利用ES细胞可以分化成特定细胞和组织的特性建立人类疾病模型，用于疾病的发病机制研究、药物筛选和研发、毒理学研究等；第三是利用ES细胞分化出来的供体细胞针对目前难治的疾病开展细胞移植治疗（图2-15）。

1.胚胎干细胞在基础研究中的应用

尽管现在的科学技术已经非常先进，但人类对自身的胚胎早期发育过程、细胞分化机制以及相应基因的时空表达调控还了解甚少。一个具有发育全能性的受精卵经历了怎样的过程最后演变为由众多种类细胞和组织器官组成的具有高度复杂功能和精密调控机制的个体？什么因素决定着机体内部这些不同种类细胞高度有序的时空排列？胚胎发育过程中哪些步骤或环节出了问题会导致哪些先天性和遗传性疾病？等等。这些问题的答案大多还不清楚，主要原因是相关研究在很大程度上受到实际可操作性和伦理准则的限制。由于ES细胞可以在体外自发地分化形成包括三个胚层来源的各种细胞的类胚体，在一定程度上可模拟体内胚胎发育过程，为研究哺乳类早期胚胎发育提供了很好的模型，特别是为研究人类自身早期胚胎中细胞分化为各种主要细胞系的过程以及这些细胞系如何进一步发育成熟并构成各种组织和器官提供了理想的模型。目前，ES细胞系统已经被用于研究胚胎发育过程中的重要事件、特定基因的作用、调节诱导原始胚层分化的关键因子，以及分离和鉴定发育特定阶段的祖细胞群。此外，利用ES细胞进行发育的研究可推动遗传病研究、癌症研究等多个领域的发展。事实上，对ES细胞的研究已经促进了出生缺陷的病因学研究，并将在指导建立有效的预防措施方面发挥重要作用。目前，全基因组范围内基因表达水平检测的技术日趋成熟，尤其是单细胞水平RNA测序技术的出现，人们可以用少量胚胎细胞研究发育过程中基因表达调控的真实过程，并与体外人ES细胞分化过程的基因表达进行比对，并指导体外人ES细胞的定向分化。

2.ES细胞在药物筛选和新药开发中的应用

ES细胞模型已被用于药物筛选和新药开发研究。人ES细胞来源的心肌细胞和肝细胞等可用来模拟细胞和组织在体内对受试药物的反应情况，还能观察到动物实验中无法显示的毒性反应，为毒理学研究和药物筛选提供更安全、方便的模型。利用ES细胞研究药物的其他优势包括：①与体内试验相比，需要的药量很少，并可在新药开发的更早期进行试验；②ES细胞可以提供各种不同遗传背景的模型，从而可对引起特殊遗传药理学反应的药物进行药物反应和毒性试验。

通过改造ES细胞，可以使对药物疗效的定量监测变得更为简便。如将GFP与特定祖细胞群的标记基因或者与细胞功能相关的基因进行融合，可以有效地检测药物是否具有促进某类细胞增殖分化的功能。ES细胞的这一特性是其他细胞所无法替代的。一个典型的例子就是在ES细胞中表达与胰腺发育或胰岛细胞成熟相关的报告基因，筛选这样的细胞可以更容易找到促进特定胰腺祖细胞生长或者促进分泌胰岛素的胰岛细胞成熟的分子。

利用具有不同遗传疾病背景的ES细胞系，能有效地研究这些疾病的发病机制，也为开发用于治疗这些疾病的药物提供了有效的筛选系统。此外，很多人类疾病缺乏动物和细胞模型，许多致病性病毒包括人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）和丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）都只能在人和黑猩猩细胞中生长。ES细胞来源的细胞及组织将为研究这些疾病及其他病毒性疾病提供很好的模型。ES细胞还可以像其他干细胞一样用来作为基因治疗的一种新的基因运载系统。

3.基于胚胎干细胞的细胞治疗

许多疾病都缘于细胞的损伤或身体组织的破坏，需要以组织或器官替换来进行修复。不论是在动物实验还是在临床实践，细胞治疗对这类疾病都显示出较好的治疗效果。比如，利用从新生小鼠视网膜分离的原代视网膜前体细胞（primary retinal progenitor cell，P-RPC）作为供体细胞，移植到视网膜变性小鼠视网膜下腔后，可分化为视网膜的各类细胞，改善模型小鼠的视力，且未观察到肿瘤发生。不过，由于供体细胞的困难，有需求的患者群体远远多于可以获得的捐赠的组织或器官，因此这类治疗很难在临床推广。由于ES细胞可在体外无限增殖并可以被定向诱导分化成几乎所有种类的细胞，所以可解决目前面临的治疗退行性疾病等的供体细胞短缺问题。正因为如此，ES细胞应用中最引人关注的就是提供细胞移植治疗的细胞来源。1型糖尿病、帕金森病、心血管疾病、阿尔茨海默病、视网膜变性、脊髓损伤、骨缺损、类风湿关节炎等疾病都适合于细胞移植治疗。不过，到目前为止，移植ES细胞来源的供体细胞并证明其在体内有治疗作用或替代功能的成功例子还非常缺乏。在这方面，研究积累最多的是人ES细胞的神经分化研究，其研究进展给基于ES细胞的神经退行性疾病的细胞移植治疗带来了希望。从人ES细胞分化获得的中脑多巴胺能神经元在移植进帕金森病大鼠模型后，能在受体大鼠体内检测到供体细胞，并且移植治疗组大鼠有一定程度的功能恢复。

在人ES细胞建系成功后13年，基于ES细胞的细胞治疗终于走上了临床试验，即最近的ES细胞来源的视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞治疗视网膜变性的研究，标志着干细胞研究发展到一个新的阶段。尽管还存在很多不足，但是这项里程碑性的工作还是能代表着干细胞研究领域的进步。在这项FDA批准的前瞻性临床前期试验中，治疗了一例年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）和一例Stargardt黄斑营养不良（Stargardt’s sacular dystrophy）。供体细胞为人ES细胞来源的RPE细胞，经手术移植到黄斑区周围的视网膜下腔。手术前、后分别进行视力、眼底荧光血管造影、光学相干断层扫描和视野等检查。手术后4个月，眼内没有发现移植细胞的过度增殖、异常生长或者免疫排斥，并且这两例晚期患者的视力有了一点儿改善。用早期治疗糖尿病视网膜病变研究（early treatment diabetic retinopathy study，［ETDRS］）视力表检查时，AMD患者的视力从能辨认 21个字母提高到28个字母，Stargardt黄斑营养不良患者则从0个字母提高到5个字母。逻辑上推测，如果能在疾病更早阶段进行治疗，有可能更好地改善患者的光感受器细胞的功能以及患者的视力。此外，在临床试验前，该研究组先在动物模型中证实了ES细胞来源的RPE细胞（99%纯度）能够整合到宿主RPE层中并形成单层结构，视为这项研究的基础之一。

客观地分析，这项研究还有许多缺陷。首先是病例太少，两种疾病各选一个病例，偶然性大，难以得出令人信服的数据。其次是细胞数量少，很多在小动物开展的类似研究都移植几十万至上百万个细胞。如果后面的研究证明再生视觉需要更多的细胞，这个项目的安全性会由于细胞数量少而受到质疑。更何况这个研究不能排除视力改善不佳是由于移植细胞数量少的可能性。第三是术后观察时间太短，4个月时间往往不足以说明细胞治疗的安全，需要更长时间的随访。但我们可以从正面看待这一工作，就是在这个领域发展中的引领作用。2015年Schwartz等报道，他们在9列患有Stargardt黄斑营养不良患者和9列萎缩性AMD患者进行视网膜下腔移植人ES细胞来源的视网膜色素上皮细胞的工作。细胞移植后平均随访22个月。没有发现不良增殖、排异、及严重局部或全身与细胞移植相关的安全问题。可喜的是，10只移植细胞的眼视力得到纠正，7只眼视力改善或维持原状，1只眼视力下降。没有接受细胞移植的眼视力没有任何改善。这项研究结果首次提供了人ES细胞来源的细胞安全治疗人类疾病的中-长期证据。

总结利用ES细胞来源供体细胞进行细胞移植治疗的工作，在推广到临床应用之前，我们还面临着几个需要解决的重要问题。

1.关于移植用的细胞类型和细胞数量

其中最重要的问题是移植ES细胞分化到哪个阶段的细胞。不同细胞类型用于移植的要求不同，例如考虑造血细胞移植治疗，需要移植相对分化的、成熟的，但仍具有一定增殖和再生能力的细胞。相反，持续替代造血系统就要求移植增殖分化能力更强的造血干细胞。至于移植细胞的数量则取决于细胞系类型、发育阶段以及疾病的种类及严重程度。

2.关于细胞移植治疗过程中的安全性

移植ES细胞来源的细胞有可能因为移植物中所含有的未分化细胞而产生畸胎瘤。在这类研究中，我们最近的一项实验很有代表性。将小鼠ES细胞定向分化为神经祖细胞（neural progenitor cell，NPC），简称为ESC-NPC，并在视网膜变性小鼠视网膜下腔进行移植，有约70%的受体眼内发现畸胎瘤；如果将ESC-NPC通过流式细胞分选仪分选去除残余的未分化ES细胞，然后进行单层细胞培养并进一步诱导其向神经视网膜方向分化。收集这些ES细胞来源的视网膜前体细胞（retinal progenitor cells，ESC-RPC）进行移植，结果在60%移植眼内可见神经瘤，但不再有畸胎瘤；比较ESC-RPC和从新生小鼠视网膜分离的原代RPC的全基因表达谱发现，ESC-RPC中经典Wnt信号通路持续激活，并且应用该通路抑制剂DKK1处理的ESC-RPC移植后，神经瘤的形成率降低到3%左右。因此，一方面我们可以通过改进特定分化细胞的筛选技术而减少移植物中未分化细胞的数量。另一方面通过调控供体细胞的信号转导通路，使用于移植的细胞处于最佳的状态，即最好的治疗效果和最小的成瘤危险。因此，在ES细胞向特定供体细胞分化过程中找到一个治疗性和致瘤性的平衡点至关重要。要解决这一问题需要必须理解特定细胞系的发育机制和规律。

3.必须克服的障碍是伦理限制和移植免疫排斥问题

这是基于ES细胞的细胞治疗目前难以跨越的障碍。由于人ES细胞的建系需要人的早期胚胎，在伦理学上存在很大的争议，尤其在宗教势力强大的国家。下一节将要介绍的诱导多能干细胞，为解决这些障碍提供了新的更理想的途径。利用患者自身体细胞建立诱导多能干细胞，细胞分化而来的细胞进行移植治疗，就自身细胞移植治疗来说，不仅规避了伦理限制，也不会导致免疫排斥反应。有关iPS细胞，后面将详细介绍。随着科技的发展，围绕ES细胞研究的伦理争议将越来越少，因为人多能干细胞不是必须来自早期的人类胚胎。

4.基于胚胎干细胞的组织器官再生

ES细胞定向分化为具有特定功能的细胞，只是干细胞临床治疗应用研究的第一步。由于机体的主要功能大多是由组织和器官完成的，再生医学治疗疾病需要把ES细胞诱导分化并产生特定的组织和（或）器官。与细胞定向诱导分化相比，人们在这一领域的积累还很少。但可喜的是，现在已经有了重要突破。

2011年，日本Sasai研究组报道了小鼠ES细胞经过类胚体三维培养形成视杯结构（视原基）的工作。这是首次体外由ES细胞分化的细胞构建近于完整的组织器官，标志着利用ES细胞构建组织器官的开始。这项研究是基于细胞的分化由内在和外界信号共同调控，并且ES细胞在合适的环境中能自发形成神经组织的假设，将ES细胞置于低吸附性培养皿中，添加细胞外基质Matrigel进行无血清悬浮培养。这样，在没有添加细胞外信号干预情况下，利用类胚体内在的机制自发地形成视泡组织。在视泡分化过程中，ES细胞首先增殖分化形成神经上皮样结构，然后沿着远-近端轴从神经上皮泡外翻形成由视网膜上皮组成的初级视泡，远端继续分化形成视网膜色素上皮，而近端则逐渐内折，形成与胚胎期视泡相似的结构。这种视网膜神经上皮细胞表现出典型的区间动态核迁移，进而形成复层视网膜组织，与体内胚胎发育过程中上皮泡从间脑的两侧突出形成的视原基相似。在这项研究中，Sasai等还构建了以Rax基因驱动GFP表达的敲入细胞系，通过Rax的表达监测ES细胞向视网膜细胞分化过程的每个细节。最近，该研究组利用人的ES细胞的体外三维培养体系，构建了具有人视网膜组织特征的视杯结构。这项研究成果为在体外研究神经系统发生、视网膜器官发育、视网膜疾病模拟和最终视网膜干细胞移植治疗开辟了一个新途径、搭建了一个强大的平台。

（金　颖）