测定血浆FⅧ活性（FⅧ：C），辅以FⅧ抗原（FⅧ：Ag）可确诊血友病A；测定血浆FⅨ活性（FⅨ：C），辅以FⅨ抗原（FⅨ：Ag）可确诊血友病B。以上检测也可鉴别血友病A和B。若患者的FⅧ：C/FⅨ：C和FⅧ：Ag/FⅨ：Ag同时相应减低，提示FⅧ/FⅨ蛋白质合成和分泌减少；若其FⅧ：C/FⅨ：C减低而FⅧ：Ag/FⅨ：Ag正常，则提示FⅧ/FⅨ相应的分子功能异常。

FⅧ：C/FⅨ：C目前多采用一期法测定。一期法的前提条件是假定反应系统中只有FⅧ/FⅨ是可变的，其他血浆凝血因子均恒定且正常，在这一系统中凝血时间只与FⅧ：C/FⅨ：C水平有关。

本法用人凝血因子FⅧ/FⅨ缺乏血浆为基质血浆，符合血浆FⅧ/FⅨ国际标准的血浆作为原始标准血浆，而在临床测定中更常采用经过当地再校准的国际标准血浆作为标准血浆。具体方法如下。

（1）3.8%枸橼酸钠溶液：取无水枸橼酸钠9.5g，加水溶解并稀释至250ml。

（2）咪唑缓冲液（pH7.3）：取咪唑0.68g和氯化钠1.17g，加水使溶解成100ml，加入0.1mol/L盐酸溶液42.2ml，再加水稀释至200ml。

（3）稀释液：取1体积的3.8%的枸橼酸钠加入5体积咪唑缓冲液混合，加适量20%人血清蛋白至终浓度为1%。

（4）激活的部分凝血活酶（APTT）试剂。

（5）人凝血因子FⅧ/FⅨ缺乏血浆：为人凝血因子FⅧ/FⅨ含量低于1%的人血浆或人工基质血浆。

（6）0.05mol/L氯化钙溶液：取氯化钙（CaCl ₂·2H ₂O）147g，加水溶解并稀释至1000ml，配制成1mol/L的氯化钙贮存液，用前用水稀释20倍，配制成0.05mol/L氯化钙溶液。

用人凝血因子Ⅷ缺乏血浆将标准品稀释成每1ml含1IU凝血因子Ⅷ，再用稀释液分别进行10倍、20倍、40倍和80倍稀释，置冰浴待用。

用人凝血因子FⅧ/FⅨ缺乏血浆将供试品稀释成每1ml含1IU凝血因子FⅧ/FⅨ，再用稀释液进行10倍和20倍或40倍稀释，置冰浴待用。

取激活的部分凝血活酶试剂0.1ml，置37℃水浴保温一定时间（一般4分钟），加入凝血因子FⅧ/FⅨ缺乏血浆0.1ml、供试品溶液0.1ml，混匀，置37℃水浴保温一定时间（一般5分钟），加已预热至37℃ 0.05mol/L氯化钙溶液0.1ml，记录凝固时间。

用不同稀释度的人凝血因子FⅧ/FⅨ标准溶液0.1ml替代供试品溶液，同法操作。

将标准溶液人凝血因子FⅧ/FⅨ效价（IU/ml）的对数对其相应的凝固时间（秒）的对数进行直线回归处理，求出直线回归方程。计算供试品溶液人凝血因子FⅧ/FⅨ效价，再乘以稀释倍数，即为供试品人凝血因子FⅧ/FⅨ效价（IU/ml）。根据FⅧ：C/FⅨ：C水平的高低，将血友病A/B分为：重型（＜1%或＜0.01IU/ml）；中型（1%～5%或0.01～0.05IU/ml）；轻型（5%～25%或0.05～0.25IU/ml）；亚临床型（25%～45%或0.25～0.45IU/ml）。

血友病患者血浆凝血因子抗原的测定具有重要意义，可以据此将血友病分为交叉反应物质阴性型（CRM-）和交叉反应物质阳性型（CRM+）两个表现型。CRM-表现型常见于重型血友病，由于患者体内基本无FⅧ蛋白（抗原）的合成与分泌，替代治疗采用的FⅧ则成为异体蛋白（抗原），诱导免疫反应，产生抑制物。而CRM+表现型多见于轻、中型血友病，在重型血友病患者中十分少见。由于患者可合成和分泌无功能活性的FⅧ蛋白（抗原），因此部分患者可形成免疫耐受，抑制物发生率低。近几年来，免疫放射测定分析和ELISA分析开始用于FⅧ抗原测定，所用抗体多取自存在抑制物的血友病患者，由于超纯FⅧ/FⅨ获取困难，而动物的抗体可能与其他血浆蛋白发生交叉反应，仅有少数实验室能够进行FⅧ/Ⅸ抗原测定。但随着技术的进步和ELISA技术的广泛应用，目前FⅧ：Ag/FⅨ：Ag测定也越来越普及。