第二章　表面活性物质基因突变在间质性肺疾病发病的致病机制

间质性肺疾病(interstitial lung disease，ILD)发病和进展的机制仍无定论。一直以来，人们认为慢性ILD和肺纤维化主要起因于肺泡上皮损伤继发的慢性炎症。若损伤得以控制，修复过程就会逆转纤维化的趋势；若损伤持续，修复过程就会导致瘢痕形成和局部结构改变。但一些对于成人ILD病例的研究显示，过敏性肺炎的疾病早期炎症很明显，后期并未出现纤维化，而广泛纤维化的病理类型中炎症的成分却很少。国外有文献报道，特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一种涉及异常创伤愈合的功能紊乱，进行性的上皮损伤和激活是纤维形成和间质细胞增殖的关键，这种作用并不依赖于炎症。

近年来研究认为，IPF的发病机制分为3个病理生理阶段，易感阶段、起始阶段和进展阶段。易感阶段包括基因突变或变异(即SNPs)，使易患个体发展肺纤维化；个体的生命期间环境暴露导致慢性上皮细胞的损伤，导致端粒缩短，这些因素最终导致上皮细胞功能障碍。并不是所有的人在这个阶段均会出现临床相关的疾病，它取决于暴露于这些因素的程度和持续时间。在起始阶段，上皮细胞功能障碍分子介质如内质网应激，过度TGF-β活化，生长因子、趋化因子或Wnt分泌导致EMT，纤维细胞招募和成纤维细胞分化。这些导致疾病的进展阶段，在这期间的病理间质细胞释放异常类型的基质蛋白，从而重塑和瘢痕肺。病理重塑的基质或在成纤维细胞的表观遗传学的改变可能会导致间充质细胞激活和加重进行性肺纤维化。

【基因突变和其相关的机制】

1.基因突变

儿童ILD领域的一个重要发展是发现了先天性表面活性物质代谢异常，包括表面活性蛋白B、表面活性蛋白C和ABCA3基因的突变。表面活性蛋白B、C和ABCA3是维持表面活性物质稳态和运输的必要物质。这些基因突变编码的蛋白质会导致表面活性物质功能障碍，同时引起致命的婴儿慢性呼吸系统疾病。早产所致肺表面活性物质缺乏是新生儿呼吸窘迫综合征(respiratory distress syndrome，RDS)的主要原因。患有肺部疾病的足月婴儿和患有儿童间质性肺疾病的较大儿童均有可能由肺表面活性物质代谢紊乱所引起。2001年Nogee等［1］描述了一家患有间质性肺疾病的病例。采用候选基因方法识别了表面活性蛋白C(SP-C)的编码基因杂合子突变，外显子4脱落和末端缺失了37个氨基酸(SPCΔexon4)。此报告显示了SP-C突变，影响了肺泡Ⅱ型细胞表面活性蛋白的生产和分泌，导致间质性肺疾病。之后Thomas等［2］报道了家族性肺纤维化(familial pulmonary fibrosis，FPF)患者中的一个大家族中，SP-C末端部分Q188L的错义突变。后续报告发现了另外的6个SP-C基因的突变与肺纤维化相关［3］。这些突变的大多数位于BRICHOS区域，其功能之一为防止SP-C的聚合，同时协助其插入膜［4］。虽然这些研究提供了强有力的证据，表明SPC基因突变与特异家族性肺纤维化有关。但这些突变发生在只有1%的散发性肺纤维化的病例［5-6］。利用单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNP)在一大家族的肺纤维化个体进行超过6000标记面板全基因组连锁分析［7］。分析确定染色体10q22为受累部位。位于这一染色体区域的编码表面活性蛋白A1、A2和D的基因，被确定为候选基因。测序鉴定这些基因的错义突变预测表面活性蛋白A2的G231V突变［7］。随后在FPF大家族的表面活性物质A基因发现第二种错义的突变(F198V)。这两种突变预测的翻译蛋白不稳定，在内质网中突变蛋白异常保留，并不能形成高次序的聚合物。

SP-B基因突变可引起致命性新生儿RDS。文献还报道，SP-B基因多态性与足月儿呼吸窘迫综合征密切相关［8］。近期发现，SP-C基因及ABCA3基因突变与儿童间质性肺疾病有关［9-11］。SP-C基因变异表现为不同的基因显型，而有SP-C基因突变的儿童大多数表现为非特异性间质性肺炎，少数合并肺泡蛋白沉积。有SP-C突变的成人常表现为非特异性间质性肺炎、脱屑性间质性肺炎或无症状。不伴有SP-B、SP-C基因突变的ABCA3基因突变与新生儿致命性呼吸衰竭有关，年龄稍大的儿童可表现为非致命性肺间质性疾病，婴儿可表现为肺泡蛋白沉积症、脱屑性间质性肺炎或婴儿慢性肺炎［10］。

甲状腺转录因子1(thyroid transcription factor 1，TTF1)，也被称为NKX2.1。甲状腺转录因子1是转录因子同源盒基因家族的一个成员，对重要的表面活性物质的产生和功能的多种基因表达很重要。这些基因包括SP-A、SP-B和SP-C、ABCA3。该基因位于14号染色体长臂(14q13.3)。NKX2.1基因的缺失或完全丧失功能的突变也能导致严重的RDS和ILD的表型。NKX2.1基因在甲状腺、中枢神经系统表达，NKX2.1基因突变的患者可能出现这些器官系统相关的症状。所以，这种疾病可用“脑-甲状腺-肺”综合征来描述［12］。

关于NKX2.1单倍剂量不足(haplo-insufficiency)的肺疾病自然病史并不清楚。有报道新生儿期和婴儿早期引起致命性的肺部疾病，也有在较轻或无肺疾病的老年患者中发现。染色体16q24.1微缺失和FOXF1杂合突变功能缺失导致肺泡毛细血管发育不良伴静脉错位。

近年研究发现，家族性的肺纤维化患者与TERT、TERC基因突变有关［13-14］。我们在2个家庭的5号染色体上使用疾病基因的连锁图谱。在两个肺疾病的家庭的排序的候选基因TERT区间内，共隔离显示错义突变和移码突变。TERT编码端粒酶逆转录酶与端粒酶RNA组成(RNA component of telomerase，TERC)是维持端粒完整性所需要的。测序44个额外的无关的家庭先证者和44例散发的间质性肺疾病，显示其他5个TERT突变。在一个家庭内发现 TERC基因杂合突变。所有的 TERT和TERC基因突变杂合子携带者比同年龄的家庭成员无突变的端粒较短。因此，在TERT和TERC基因突变导致端粒缩短随着时间的推移，导致成人发病的特发性肺纤维化的敏感性急剧增加。

有研究发现，SFTPA2基因杂合突变(OMIM#178642)和家族性肺纤维化有关［13，15］。GM-CSF受体的基因突变引起的缺陷破坏肺泡巨噬细胞的功能，从而导致肺泡蛋白沉积症。最近的全基因组连锁扫描显示，MUC5B基因启动子的变异与家族性和散发性IPF的发展有关［16］。

2.表面活性物质的功能

肺表面活性物质是由肺泡Ⅱ型上皮细胞合成的复杂的磷脂蛋白复合物。它的结构在不同种属间非常类似，包括70%～80%磷脂、10%蛋白质和约10%中性脂质。磷脂的主要成分是磷脂酰胆碱，其中二饱和酯酰卵磷脂约占40%，是最重要的表面活性磷脂。此外，还有其他的磷脂形式，如磷脂酰甘油、磷脂酰肌酐、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂磷酸二酯酶等一些小分子磷脂和中性脂质。目前发现的肺表面活性蛋白有4种，根据发现的顺序命名为SP-A、B、C和D四种亚型。其中SP-A、SP-B、SP-D来源于肺泡Ⅱ型上皮细胞和支气管非纤毛上皮细胞，SP-C来源于肺泡Ⅱ型上皮细胞。按其生物化学特性又分为2大类，大分子亲水SP(SP-A、SP-D)和小分子疏水性SP(SP-B、SP-C)。SP-A占SP总量的50%，是钙离子依赖性糖结合蛋白，在肺泡中的结构是由6个三聚体组成的18个单位的花束状结构，其分子结构由N-端、胶原样区、颈区和糖基识别区4个区域组成，在颈区和糖基识别区间有脂质结合位点，可以同二棕搁酞磷脂酞胆碱(brown phthalein phospholipids phthalein choline，DPPC)等表面活性磷脂结合，起到维持表面活性物质结构的作用，并促进脂质重吸收，在一定条件下抑制肺泡Ⅱ型上皮细胞分泌表面活性物质。在Ca+存在下，SP-A可与脂质结合并促进囊泡状脂质聚集，SP-A的胶原样螺旋结构与其免疫防御功能相关。SP-D大部分存在于肺泡液中，因其不能与磷脂酰胆碱结合，故其在表面张力中的意义不大，但在免疫调解中起主要作用。SP-D能识别病原体如细菌、病毒、真菌表面的糖基结构并与之结合，也能与肺泡巨噬细胞及嗜酸性细胞结合，共同调理吞噬作用。另外，在补体实验中发现，SP-D有抗氧化作用，在SP-D缺乏的大鼠体内，活性氧的危害明显增加。SP-D同时具有调节免疫和抑制炎症的作用，SP-D能与免疫系统的其他成分一起调节由感染原或过敏原引起的二级免疫反应，能够快速消除凋亡细胞，避免炎症反应的进一步发展，SP-D缺乏可增加内毒素血症时肺损伤［17］。

SP-B和SP-C是疏水性SP，SP-B主要作用是促进磷脂的吸附，加速肺泡气-液界面上肺表面活性物质薄膜的形成。SP-C分子是疏水性多肽，主要成α螺旋，仅来自肺泡Ⅱ型上皮细胞，通过共价键与2个棕榈酰基结合，维持脂质的表面活性。研究表明，肺表面活性物质能降低肺泡表面张力，从而降低呼吸做功、防止呼气时肺泡萎陷，这种功能主要依赖于磷脂、中性脂质和表面蛋白B和C的相互作用［18］。

其次，表面活性物质在肺的固有防御反应中起着重要作用，过去这种作用绝大部分归功于亲水蛋白SP-A和SP-D［19］。而近来研究表明，SP-C在对病原体局部免疫反应(包括直接和间接)中有重要调节作用。成熟SP-C和脂多糖的直接作用表明，SP-C参与肺部防御［20］。SP-B缺乏可引起SP-C合成受阻。此外，发现SP-C基因敲除的小鼠和缺乏SP-C患间质性肺疾病的患者中有持续的炎症反应和进行性肺泡结构改变也印证了这一论点。研究发现，I73T突变导致肺泡Ⅱ型细胞前SP-C处理受损，压力承受力的改变和表面活性物质的脂质成分改变，并激活免疫系统的细胞［21］。SP-B缺乏可引起原因不明的足月新生儿RDS，新生儿RDS SP-B mRNA较对照组明显减低，也证实了SP-B缺乏与新生儿RDS发病有关［22］。SFTPC突变与家族性和散发性有关［23］。

一般认为，表面活性物质的主要活性成分磷脂酰胆碱由肺泡Ⅱ型上皮细胞在内质网合成，肺泡Ⅱ型细胞中含有合成肺表面活性物质的关键酶，这些磷脂成分在内质网中合成后，而后通过某种机制转移到高尔基体，转化成大的聚集体即板层体。在板层体内卵磷脂与表面活性蛋白结合成双分子层后以胞外分泌形式分泌到肺泡腔中，形成一定规律的管状结构分布于气-液交界面，维持肺泡形态的稳定。肺泡内表面活性物质有2种形式，一种为具有生物活性的高密度脂蛋白的大聚合体，包括板层体、管髓体和多层脂囊；另一种是无生物活性的低密度脂蛋白的小聚合体，由代谢终产物单层脂囊构成。正常情况下，大聚合体和小聚合体有稳定的比例，处于动态平衡。

表面活性物质分泌到肺泡腔后可迅速被清除，以维持其稳定。其清除的途径有多种，可经气管清除，少数也可通过淋巴系统、血液循环系统清除或肺泡巨噬细胞吞噬后降解。此外，大部分的表面活性物质通过入胞作用被肺泡Ⅱ型上皮细胞重摄取，重新运送至板层体贮存以备再利用。也有研究认为，表面活性物质被摄取后成为多囊泡体，部分囊泡体与初级溶酶体融合，降解为胆碱、脂肪酸等，然后进入内质网重新合成表面活性物质。其他囊泡体则与板层体结合直接循环利用。

3.基因突变引起间质性肺疾病的机制

携有杂合SP-B生产障碍相关基因的小鼠模型中，SP-B产生减少可导致小鼠在暴露于过氧环境时出现慢性肺损伤［24］。外源性SP-B可修复由此导致的肺功能障碍。SP-B缺乏症导致异常的表面活性物质成分和功能，以及板层小体的结构破坏［25-26］。在体外卵磷脂的成分和合成正常，但在患儿体内用同位素示踪其表面活性物质的前体研究中，磷脂有一定程度减少［25］。SP-B缺乏的同时有SP-C的不完全加工，6KDa的SP-C前体(保留氨基末端侧翼12个氨基酸)的存在表明，缺乏SP-C前体的最终切割步骤，这很可能是因为板层体的功能缺失引起的［27］。而不完全加工的SP-C前体在体外抑制表面活性物质的功能，可以进一步增强SP-B缺乏症的表面活性物质功能缺失。通过研究SP-B基因缺乏的小鼠发现，SP-B在降低肺表面张力、proSP-C的水解加工过程、将表面活性磷脂运送到板层体及维持新生儿阶段正常呼吸功能中起着至关重要的作用。

目前，对于SP-C基因突变的致病机制认为有2种模式［28］：一种如前所述，基因突变发生在SP-C基因的BRICHOS结构域部位。BRICHOS结构域与癌症、神经退行性病变、肺间质性疾病有关。BRICHOS区域在SP-C蛋白前体复杂的翻译过程中起着重要作用：①辅助蛋白质进入分泌途径；②协助细胞内蛋白酶解系统的独特性转化；③避免蛋白质在细胞内淀粉样沉积。BRICHOS区域基因突变的SP-C前体蛋白可导致蛋白错误折叠、转运和合成异常，导致一系列毒性作用，如诱导内质网应激作用、细胞毒性、细胞凋亡蛋白酶3和4诱导的细胞凋亡。这些因素可使细胞损伤和肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡导致ILD。如基因突变发生在邻近SP-C基因的BRICHOS结构域部位，含SP-C突变体的多囊小泡或被转运至细胞膜进而融合、释放出的SP-C突变体会抑制细胞膜的再吸收循环功能或经高尔基体转运至细胞内包涵体后被逐渐降解，这种突变不会影响BRICHOS结构域。这时，SP-C的合成仅轻度减少，肺组织损伤相对较轻［27］。

ABCA3基因突变可以分为2类，类型Ⅰ为细胞内定位异常，如L101P、L982P、L1553P、Q1591P突变；类型Ⅱ为细胞定位正常，但ATP水解活性异常，如R295C、N568D、G1221S和L1580P突变。R280C和L101P突变导致体外培养的肺上皮细胞ABCA3蛋白转运或折叠异常，滞留在内质网中，增加了内质网的应激性、损伤易感性和凋亡标记物表达，促进细胞死亡［29］。此外，ABCA3基因突变导致肺上皮细胞的完整性和功能受到破坏，且表现出间质细胞的特点。

在FPF或散发的IPF患者基因突变和多态性分析，研究肺纤维化的遗传易感性致病机制取得了重大进展。目前为止所有突变确定共同的问题是，突变所影响的基因(如SPA、SPC、MUC5B)是否在肺泡上皮细胞表达或是否导致肺泡上皮细胞可识别分子改变(TERT、TERC)。例如端粒在几乎所有散发的IPF患者的肺泡上皮细胞均短。这些知识使IPF发病机制理解围绕在上皮细胞的作用和功能，在肺纤维化的发展起着作用。

外部损伤是基因突变的易感个体发展为肺纤维化的必要因素。理论上这些突变可能直接导致肺纤维化，但实验数据均不支持这种可能性。研究发现，环境因素如污染、粉尘或烟雾，可能在遗传易感个体导致肺纤维化。IPF患者比健康者烟雾和粉尘接触往往更为常见，非吸烟 IPF患者较吸烟患者存活长［30］。其他暴露因素还有胃食管反流(gastroesophageal reflux，GER)，尤其是微量吸入。有研究认为，GER与特发性肺纤维化有关［31］。但也有研究并不支持GER与IPF相关［32］。应用质子泵抑制剂或外科胃底折叠术治疗GER与疾病发展减缓和更好的生存率有关［33］，说明了GER和微量吸入与疾病的发展和(或)遗传易感个体的疾病加重有关。

特发性肺纤维化的基因突变是持久的，不可逆的变化。通过持续激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)或分泌TGF-β可能有助于疾病的进展。然而，表面活性物质的突变是唯一明确的分子途径的基因突变，可以解释它们在肺纤维化的作用。MUC5B、TERT、TERC突变患者导致肺纤维化的分子机制仍不清楚。IPF的进行性进展非遗传性的因素必须考虑，IPF的成纤维细胞表型的持久的改变导致IPF进展。

4.表观遗传学

最近公认由表观遗传学影响的基因表达的调控是一个环境或其他应激可以引起持久的细胞，组织或生物体的表型变化的重要机制［34］。表观遗传改变包括DNA甲基化改变，组蛋白修饰或microRNA的表达［34-35］。暴露于环境压力如烟草烟雾［36-37］、空气污染［38］和年龄老化［39］可导致表观遗传DNA改变。对IPF肺的表观遗传学改变的研究，miRNA微阵列分析显示，18个小分子RNA包括let-7d水平下降［40］。Let-7d microRNA的定位局限于肺泡上皮，且上皮细胞let-7d水平下降与间充质蛋白如N-钙黏蛋白、波形蛋白、α-SMA的表达增加有关。全基因组甲基化分析在IPF的肺确定了大量的差异甲基化基因［41-42］。许多基因的DNA甲基化变化与mRNA表达相对应，其中一些在IPF中起重要作用，如细胞凋亡和生物合成细胞过程的调控［43］。这些研究结果表明，甲基化和(或)其他表观遗传变化在IPF发病起很重要的作用和持久的影响基因表达可部分解释病情的进展。

5.环境因素

除了遗传因素外，环境因素也影响疾病的发展。目前研究认为，烟草烟雾、暴露于空气污染物和病毒的作用均影响肺纤维化的发病。一些研究还表明，肺纤维化患者肺组织中存在各种病毒蛋白，且表达于肺泡上皮细胞。

6.年龄老化

年龄老化与间质性肺疾病发病有关。在儿童肺纤维化疾病的患病率比成人要低得多。一方面，儿童和成人接触的环境不同；另一方面，随年龄增长，机体对损伤的修复能力减低，与胚胎干细胞不同，成人干细胞并非不朽，随着年龄的增长其端粒长度降低。这样的内源性干细胞池的自然有限的置换能力，可能通过干细胞池耗尽，或通过遗传，或获得的突变改变了相应的干细胞功能的后果。在应对各种压力包括DNA损伤、氧化剂和端粒侵蚀，由于衰老致细胞的有限寿命。在成人ILD患者的肺，所有这些损伤的形式得到证实。

【肺泡上皮细胞的关键作用】

基于临床和实验研究，肺泡上皮在ILD的发病中起关键性作用。损伤后AECs通过再上皮化过程进行正常肺泡结构的修复，或通过EMT过程参与纤维化。肺上皮细胞是间质性肺疾病肺损伤的原发部位。虽然有各种启动因素，终端阶段的特点是肺纤维化。

在EMT过程中，上皮细胞的极性和特有标记消失，细胞的紧密连接部溶解，肌动蛋白的细胞骨架重组，间质基因表达程序得以诱导，细胞在基膜及组织中迁移，而持续的细胞凋亡被证实是推动这个过程的关键。细胞凋亡的一般特征是细胞内表面磷脂酰丝氨酸的表达，相邻细胞特异地识别磷脂酰丝氨酸需要许多抗炎分子的参与，如TGF-β。而基底膜长时间的破坏造成AECs与间质细胞的相互作用和相互干扰，改变了细胞功能，使得氧化剂、酶类、细胞因子和生长因子等产物失衡，造成TGF-β不断引起上皮细胞凋亡同时又不断促进自身产生的恶性循环。

上皮细胞凋亡是间质性肺疾病的初始事件。内质网应激也诱导细胞凋亡。上皮细胞凋亡之后重建，重建过程包括上皮细胞和成纤维细胞活化，细胞因子的产生，凝血途径的激活，新生血管形成，再上皮化、纤维化。细胞凋亡在维持细胞存活与死亡之间的平衡中起重要作用。有2个细胞凋亡信号通路。一个是直接途径从死亡受体连接半胱天冬酶(caspase)级联反应激活和细胞死亡。通过刺激如药物、辐射、感染病原启动的其他途径和活性氧在线粒体中的启动。最近证明，内质网也是执行细胞凋亡的细胞器。各种应激会损害蛋白质折叠，引起内质网应激，严重的内质网应激可引起凋亡信号转导［44］。活性半胱天冬酶介导蛋白质底物的裂解，导致细胞凋亡的形态学特征。细胞凋亡在肺疾病中可能起重要作用。实质细胞过度死亡意味着不可逆的组织损伤，可能导致肺纤维化。

肺泡上皮细胞损伤和细胞死亡诱导上皮基底膜形成了间隙。成纤维细胞通过这些间隙进入肺泡腔，导致肺泡内纤维化。间质纤维化及后续肺泡内纤维化可导致肺损伤后结构重构。在IPF已经证实了细胞凋亡的发生，［45-46］。以及死亡受体/配体的死亡信号，如活性氧族、氮族、促炎性细胞因子、趋化因子和其他凋亡的分子信号参与了间质性肺疾病的病理生理学。

肺泡上皮细胞不仅是肺损伤的原发部位，也通过一些机制参与炎症反应。在IPF上皮细胞能分泌大量分子，如生长因子及其受体、蛋白酶、表面活性蛋白、黏附分子和基质成分，它们可能调节肺内的炎症和纤维化反应。突出的肺泡上皮细胞损伤是IPF的特征。广泛严重损伤的急性炎症区域Ⅰ型肺泡上皮细胞显著降低，肺泡Ⅱ型细胞是修复细胞，上皮细胞损伤后快速增殖。在大多数严重损伤的区域，基底膜由增殖的立方形Ⅱ型细胞所覆盖，Ⅰ型和Ⅱ型细胞的死亡由大量成纤维细胞、平滑肌细胞所取代。

博莱霉素可迅速产生大量肺的DNA损伤。该模型电子显微镜的研究结果显示，在细支气管和肺泡上皮有细胞凋亡的特征。因此，DNA损伤和上皮细胞凋亡可能与肺纤维化有关。随后在IPF患者用原位DNA缺口末端标记法和电子显微镜也证实，肺泡上皮细胞有DNA损伤或上皮细胞的凋亡。DNA损伤和细胞凋亡在急性肺损伤和弥漫性肺泡损伤的肺上皮细胞有报道［47］。

一些细胞死亡需要Fas/FasL途径，即半胱天冬酶激活。研究证实，广谱半胱天冬酶抑制剂，在体内抑制细胞内的半胱天冬酶样蛋白酶活化，并保护小鼠免受LPS诱导的急性肺损伤。它也减轻博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化，说明上皮细胞凋亡可能在肺损伤和纤维化的发病机制中起重要作用。

Fas/FasL途径是细胞凋亡信号受体分子代表系统。在体外实验中，ARDS患者的支气管肺泡灌洗液能够诱导人的远端肺上皮细胞的凋亡并表达Fas，Fas/FasL通路被证实是引起肺泡上皮Ⅱ型细胞凋亡的重要途径［48-49］。在IPF患者肺组织中的渗出炎性细胞的FasL mRNA和蛋白的表达上调。在小鼠博莱霉素诱导肺纤维化和人类的IPF的平滑肌肌动蛋白阳性细胞有FasL分子表达，体外也证实FasL阳性的肌成纤维细胞，诱导小鼠肺的上皮细胞凋亡［50］。抑制这一途径可能是一种新的肺损伤和纤维化的治疗策略。由于氧化还原调控与细胞凋亡关系密切，氧化损伤的细胞保护策略也是抗肺损伤和纤维化的有前景的策略。如硫氧还蛋白-1是一种重要的自由基清除剂。硫氧还蛋白-1转基因小鼠可降低高氧暴露后肺泡损伤。

【上皮细胞和成纤维细胞的相互作用】

严重的肺上皮细胞的损伤和不完全的修复，成纤维细胞可增殖，可损害正常的上皮细胞和成纤维细胞的相互作用，从而导致肺纤维化。上皮细胞也可能通过释放细胞因子控制成纤维细胞，抑制成纤维细胞的活性。通过Ⅱ型肺泡上皮细胞增殖和分化完成上皮层的正常修复。这个过程受肺成纤维细胞所产生的因子所影响。如炎症刺激持续存在可导致修复异常，引起肺纤维化。

从纤维化肺分离的异常表型成纤维细胞在体外可产生能够诱导肺泡上皮细胞凋亡和坏死的因子［51］。这些异常的上皮间质细胞的相互作用，通过阻止正常上皮的修复和促成纤维细胞异常增殖的进展，可引起肺纤维化疾病发病和加重。

1.上皮细胞向间充质细胞转化

上皮细胞向间充质细胞转化是一个上皮细胞获得与间充质细胞有关的分子和细胞生理特征的过程。通常紧随特异性生长因素如TGF-β之后［52-53］。正常组织的平衡不需要EMT；相反，在组织损伤和重塑时EMT程序激活［54-55］。有免疫组化研究表明，在IPF患者的肺泡细胞具有EMT的证据［52，56］。

虽然有证据表明，在IPF患者肺上皮细胞获得间充质特征，这些在间质的纤维化过程中变化的作用仍然不清楚。在人类中，唯一支持的证据是从IPF患者分离的成纤维细胞表达上皮细胞蛋白角蛋白18［57］。

在IPF患者UPR、TGF-β和EMT激活与肺纤维化有关。表面活性物质的突变导致UPR的激活，这激活是否足以导致肺纤维化的发展仍然未证实。SPA的基因突变导致上皮细胞的UPR激活，G231V SPA的杂合突变患者支气管肺泡灌洗液中具有较正常者更高的TGF-β水平［58］。不同表达的G231V或F198S SPA突变的上皮细胞也表达高水平的TGF-β，这些观察揭示了UPR激活和TGF-β产生的关系，UPR的激活可能通过增强分泌TGF-β促进肺纤维化的发展。

2.内质网应激

内质网是分泌细胞室，可通过高尔基复合体参与膜蛋白的制造、折叠和成熟的包装和运输。在缺氧、氧化应激等刺激时，未折叠蛋白产生增多，当超过内质网处理能力时，引起内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。内质网应激发生时，产生了大量的错误折叠和未折叠的蛋白，细胞的蛋白质需求和内质网的合成、加工和包装必需蛋白的能力之间不平衡［59］。应对这个应激，细胞增加折叠蛋白的产生和加速未折叠蛋白的降解称为UPR，导致生化通路激活以匹配内质网生产蛋白质的能力。这样，可以维持内质网的稳态，阻止细胞凋亡。如果UPR无法达到需求，激活终端UPR和细胞通过细胞凋亡的途径死亡［59-60］。哺乳动物细胞中含有3个未重叠蛋白的传感器-需肌醇酶1α(inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α)，蛋白激酶RNA样内质网激酶(protein kinase RNA like endoplasmic reticulum kinase，PERK)和激活的转录因子6(activating transcription factor 6，ATF6)。当内质网应激，IRE1α感受与应激相关的未折叠的蛋白，经历反式自身磷酸化。这种磷酸化发信号使凋亡通路的激活［61］。IRE1α是细胞凋亡启动的关键介质。此外，IRE1α具有核糖核酸酶，激活时，拼接XBP1(x-boxbinding protein 1)的 mRNA并产生的转录因子XBP1S，其目标提高ER蛋白折叠的能力。因此，内质网应激和UPR的两标记物是IRE1α的磷酸化和XBP1拼接。

研究证实，在IPF肺泡Ⅱ型细胞UPR激活的标记物增加［62-64］，证实从IPF分离的Ⅱ型细胞活性的磷酸化的IRE1α、XBP1S的水平增加。

在IPF中内质网应激的许多可能的原因已确定，如疱疹类病毒感染、基因突变［64-65］。因此，如果UPR激活是一个促进发展IPF的中心途径，那么触发UPR激活的其他因子与肺纤维化有关。

3.转化生长因子β

IPF患者肺的活性TGF-β水平增加。TGF-β的激活的纤维化过程包括抑制AEC增殖，成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化［66］，促进上皮细胞向间充质转变的程序的活化［52］。

TGF-β是细胞外基质生产的最有力的推动者，也是一个强有力的单核细胞和巨噬细胞的趋化因子。上皮细胞TGF-β增加和IPF患者肺组织和啮齿类动物博莱霉素诱导的肺纤维化的巨噬细胞的增加一致。在博莱霉素诱导的肺纤维化的肺胶原沉积的增加可通过抗TGF-β抗体治疗减少或重组TGFRⅡ治疗减少［67］。核心蛋白聚糖，一种自然产生拮抗TGF-β1的生物活性的生物分子，可以减轻损伤肺的TGF-β过度信号。

TGF-β1在各种细胞可直接诱导细胞凋亡。TGF-β1介导凋亡的机制在不同细胞类型变化。TGF-β1是通过激活caspase-3和下调p21表达诱导细胞凋亡，也是Fas介导的肺上皮细胞凋亡的增强因子，在治疗肺损伤和纤维化时TGF-β1在肺上皮细胞凋亡的这种功能应考虑。TGF-β1在肺上皮细胞过度表达可诱导小鼠的肺纤维化，TGF-β1诱导上皮细胞凋亡是肺纤维化早期的关键。

内皮素-1(endothelin-1，ET-1)也被认为是肺纤维化发生发展过程中的一个重要因素。ET-1是一个21个氨基酸的肽，已证明具有包括成纤维细胞、平滑肌细胞的有丝分裂原、刺激胶原合成的许多功能。特发性肺纤维化患者血浆ET-1水平均提高。此外，转基因小鼠过度表达ET-1表达引起肺和肾间质纤维化。最近的研究表明，AEC产生ET-1在生理上相关的水平可通过刺激内源性TGF-β的产生引起肺泡EMT。这些数据支持了ET-1联合TGF-β在EMT和肺纤维化起作用［68］。

上皮细胞在TGF-β1介导下向间充质细胞转化。在结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)作用下，可激活成纤维细胞，促进纤维化的发生［69］。

4.血管紧张素Ⅱ

研究发现，血管紧张素Ⅱ1类受体(angiotensin I，AT1)过度表达可促进局部肺纤维化的发生，参与气道重构，血管紧张素可能在肺纤维化中发挥重要作用。血管紧张素Ⅱ和血管紧张素原体外诱导肺泡上皮细胞凋亡。血管紧张素Ⅱ体外通过血管紧张素Ⅱ的1类受体激活和TGF-β的自分泌作用诱导人肺成纤维细胞增生。ACE抑制剂抑制在体外Fas和TNF-α诱导的人肺上皮细胞凋亡，ACE抑制剂卡托普利减轻野百合碱或胺碘酮诱发的大鼠肺的纤维化［70］，并减轻呼吸机所致大鼠肺肺损伤［71］。AT1拮抗剂减轻博莱霉素诱导的肺纤维化和支气管肺泡灌洗液中的淋巴细胞、中性粒细胞、TNF-α和TGF-β1减少［72］。

总之，基因突变或变异是个体的易患疾病的基础，而环境暴露是必要的因素。脆弱的肺泡上皮细胞在反复的损伤因素作用下，引起异常的修复和进行性纤维化［73-74］，见图2-1。上皮细胞功能障碍是间质性肺疾病的发病其关键作用。上皮细胞功能障碍分子介质如内质网应激，过度TGF-β活化，生长因子、趋化因子、EMT、纤维细胞招募和成纤维细胞分化。这些分子介质与间质性疾病的纤维化有关。

（刘秀云　江载芳）

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