第二节　肝豆状核变性的遗传学

一、肝豆状核变性的遗传学特征

尽管Wilson对WD的研究作出了划时代的伟大贡献，本病亦以其名字命名，但终其一生他也未认识到WD是一种遗传性疾病。1921年，Hall首先推测本病可能为常染色体隐性遗传。1960年，Bearn根据纽约地区30个WD家系的遗传学分析结果（这些WD家系来源于东欧和意大利南部地区）最终确认WD为常染色体隐性遗传。随后大量的不同人群的文献报道均支持WD为常染色体隐性遗传的遗传特征，而WD基因的克隆使得人们进一步认识到本病的遗传本质。

国内梁秀龄等通过对274例中国人WD的临床分析，证实中国人所患WD其遗传方式与世界各国一样，均为常染色体隐性遗传。杨任民等对167个WD家系总共615人的调查结果显示，本病的大部分家系成员符合常染色体隐性遗传的遗传特征，但也观察到有的家系存在累代遗传现象。

二、肝豆状核变性基因的定位克隆

从WD被首次命名报道（1912）到其致病基因的定位克隆（1993），其间经历了一个漫长的阶段。

1985年，Frydman等首先将红细胞表面抗原、红细胞酯酶和部分血清蛋白等27个常染色体遗传标记物对一个阿拉伯-以色列血统的WD庞大家系中的94名成员（含8例WD患者和8名肯定的杂合子）进行基因连锁分析，发现红细胞酯酶D（ESD）基因与WD基因位点（WND）紧密连锁。因为此前Van Heyningen（1974）等已证明ESD与视网膜母细胞瘤（RB）基因同处于13号染色体长臂（l3q14）上，因此Frydman率先提出WND也在13q上并推算出WND与ESD的遗传距离为6cM（厘摩）。翌年以色列遗传学家Bone-Tamir对中东3个WD大家系进行家系调查，并结合分子遗传学分析法首先确定WND位于13q14。

此后，不少学者采用分子遗传标记检测的结果肯定了这一结论的正确性。1988年，Yuzbasiyan-Gurkan等证实了WD基因与13号染色体上的标记D13S1连锁；同年Bowcoxk等克隆了ESD基因，并通过连锁分析，将WD定位于13q14～13q21。1989—1991年，Farrer等将WD基因定位于D13S31与D13S59之间不足2cM的区域，即13q14.3，物理遗传图谱为着丝粒-RB-D13S25-D13S31-0.4CM-WD-1.2CM-D13S59-D13S55-D13S61-D13S26-端粒。此后，Scheffer等（1992）又进一步将WD基因定位于D13S31与D13S118或D13S119之间。据此，White等（1993）构建了D13q14.3区域一个长达4.5兆碱基对（Mb）的人工酵母染色体重叠体（yeast artificial chromosome contig），从中分离出9个高度多态信息的微卫星DNA标记，并应用家系连锁分析及STS作图法，构建了该区的精细遗传图谱：着丝点-RB1-D13S25-AFM205vhz-D13S31-D13S227-D13S228-AFM238vc3-D13S133-AFM0848c5-D13S137-D13S169-D13S155-D13S59-端粒，并将WD基因定位于D13S155与D13S133两个微卫星DNA之间。

1993年底，Bull、Tanzi、Petrukhin等分别同时报道了WD基因的克隆结果，确定了该基因的DNA序列。由于采用不同的技术策略，不同学者分离出的WD基因长度不同：Tanzi等从人脑cDNA文库筛选出的阳性克隆共5422bp，推测其由19个外显子（exon）及内含子（intron）构成，编码1110个氨基酸；Bull等从带有WD候选区的酵母人工染色体（YAC）筛选的阳性克隆（Wcl）cDNA长约7.5kb，编码1411个氨基酸；Petrukhin等对WD基因克隆的cosmid克隆（CosJ3a、CosG81、CosL1a）进行限制性内切酶图谱分析及测序，并与Wcl cDNA序列比较分析，确定了WD基因5’端第一个外显子及3’端最后一个外显子结构，提出ATP7B基因完整的结构由21个外显子及内含子组成，其基因跨度约为80kb。而ATP7B基因的克隆标志着WD的病因病理的研究进入分子水平。

三、ATP7B基因定位对肝豆状核变性的实际临床价值和展望

WD是少数可以治疗的神经遗传病之一，患者如果能在发病早期或症状前期被确诊并得到及时治疗，大多预后良好，反之病情逐渐加重甚至危及生命。但由于铜在不同脏器中沉积的速度和程度不同，许多患者早期症状复杂多样，极易被误诊为其他疾病，实验室铜代谢检查等又存在假阳性或假阴性结果，因此本病的早期诊断特别是症状前期和产前诊断较为困难。长期以来，国内外众多学者一直探索采用各种基因诊断技术对WD患者进行症状前期及产前诊断。

WD基因的克隆使得通过各种基因诊断技术检测ATP7B基因的突变对本病患者进行症状前期及产前诊断成为可能。1995年，Thomas等采用聚合酶链反应-单链构象多态性（polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP）分析结合DNA测序技术率先对WD患者进行ATP7B基因突变的研究，在58例欧洲裔WD患者中共发现了25种突变类型，其中第14外显子His1069G1n和第18外显子Gly1266Lys有较高的突变频率。此后多项研究证实14外显子和18外显子是欧美人WD患者的高频突变热区，并有多家学者将其用于WD基因诊断的研究报道。

包括作者单位在内的国内多家单位采用PCR-SSCP、PCR-DHPLC结合DNA测序等方法对国人WD基因突变进行研究，发现WD基因第8、12、13外显子为中国人的突变热区，仅这3个外显子即可检出69.01%的WD患者的基因突变。在此基础上，作者单位应用PCRDNA测序方法对100余例临床疑诊为WD的患者进行了基因诊断的研究，使部分患者在症状前期得以确诊，并对十余个WD家系的成员进行了产前诊断的研究，其中2个家系的孕妇在妊娠期检出胎儿的ATP7B基因的突变。

近年来，一种基于基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）检测核酸分子的MassARRAY检测技术因能够区分含有一个不同碱基的两段基因序列，具有高通量、高质量、低成本、简单、灵活等优势，是进行大样本、高通量的WD基因突变检测和WD基因突变谱研究的有力工具。基于此，作者单位应用该平台检测了1222例确诊的WD患者的基因突变（选择了110个ATP7B基因的常见突变位点），结果检出62种类型的突变，其中第8、13、18、16和12外显子的突变频率最高，p.Arg778Leu、p.Pro992Leu、p.Ile1148Thr、p.Arg919Gly和p.Asn1270Ser等5种突变最为常见，建立基于大样本的最为精确的中国人WD的突变谱（图3-3、图3-4）。该研究提示，中国人WD患者应优先检测第8、13、18、16、12外显子和p.Arg778Leu、p.Pro992Leu、p.Ile1148Thr、p.Arg919Gly、p.Asn1270Ser等突变。

四、ATP7B酶的结构功能及亚细胞定位研究

（一）ATP7B酶的分子结构特点

研究发现，ATP7B酶的结构特征（图3-5）如下：①8个跨膜区（transmembrane domain，Tm），又称跨膜转导区（transduction domain）或疏水区，包括6个跨膜螺旋区和1个双亲媒性区（Tm1～Tm8），间插于整个肽链中，是铜离子进出细胞膜的通道；②6个金属（铜）离子结合区（metal-binding domains，MBDs）组成的巨大N端（氨基端，MBDs1～6），每个MBDs由70个左右的氨基酸组成，含有高度保守的“甘氨酸-甲硫氨酸-苏氨酸-半胱氨酸-X-X半胱氨酸”（GMXCXXC，X可以是任何氨基酸）特征序列，金属（铜）离子通过半胱氨酸残基与该区结合，参与铜离子的活化并与CP的合成有关；③P型ATP酶功能区，主要由含有1个高度保守的膜内CPC（Cys-Pro-Cys）序列、含有ATP结合位点的N域、含有天冬氨酸残基的P域和含有磷酸酯酶的A域组成。其中CPC序列为转运的金属（铜）离子的通道，N域、P域和A域分别含有高度保守序列GDGIND、DKTGT和TGEA，这些保守序列分别与ATP7B酶的ATP结合、磷酸化作用和去磷酸化作用密切相关。

除5′和3′非翻译区外，ATP7B基因第2～5外显子分别编码6个与铜离子结合的保守氨基酸序列（即铜离子结合区）；第6～8、12、13及第19～20号外显子分别编码6个跨膜螺旋区和1个双亲媒性区；第10、11号外显子编码转导区，而第13号外显子还编码跨膜离子通道，第14号外显子编码磷酸化区，第14～18外显子编码ATP结合区，共同构成P型ATP酶功能区（图3-6）。

（二）ATP7B酶铜转运的分子机制

ATP7B酶对铜的转运是一个需ATP供能的过程，目前认为其转运过程如下：铜离子与MBDs结合后，ATP结合区蛋白构象改变，将ATP水解为ADP，使磷酸化区的丝氨酸被磷酸化，铜离子转位并被Tm6的CPC阳离子序列转运。这一转运过程通常包括以下5个步骤：①MBDs与铜结合；②N域与ATP结合；③P域磷酸化，ATP水解释放ADP；④铜转位至细胞膜对侧；⑤P域在A域的作用下去磷酸化（图3-7）。

研究表明，ATP7B酶的N域与ATP结合之后，结合位点上靠近P域的区域构象发生改变，促进了ATP与ATP7B酶结合和P域的磷酸化。实验证明，ATP在ATP7B酶P域的结合靠近D1027，天冬氨酸残基的突变完全阻止了酰基磷酸盐中间产物的形成。天冬氨酸残基的去磷酸化是由磷酸酯酶活性调节的，其中A域起了关键作用。Petris等通过观察TGEA域突变的ATP7B酶在亚细胞水平的定位发现保守的TGE域在蛋白的过磷酸化中具有重要作用。

（三）ATP7B酶的生物学功能

ATP7B酶的结构特性决定了其在肝细胞内铜的转运过程中起到关键作用。目前认为肝细胞有2条途径将铜排出细胞外：①将合成的CP以小囊泡分泌的方式释放入血液循环；②通过位于肝细胞胆管膜侧的铜到溶酶体的囊泡转运将铜随胆汁排出。Hung等将ATP7B cDNA转导进一种铜转运体缺陷的Ccc2酵母，结果发现其铜转运功能重建，铜被转运到Fet3铜蛋白。Terada等将ATP7B cDNA重组腺病毒载体转导进有ATP7B基因缺陷的WD模型LEC大鼠，在LEC大鼠的肝细胞的TGN发现ATP7B酶的表达，并检测到有氧化酶活性的holo-CP，而胆管内铜含量也明显增加，这说明ATP7B蛋白直接参与铜与CP结合，以及在胆道排铜的过程中起着十分重要的作用。反之，当ATP7B基因突变后，ATP7B酶转运铜的功能缺失，则铜在细胞内蓄积以及Apo-CP不能和铜进行结合导致有活性的holo-CP水平减低，这也就是WD发病的基本分子机制。肝细胞内正常的铜转运模式图如图3-8A所示，WD肝细胞内的铜转运模式图如图3-8B所示。

（四）ATP7B酶的亚细胞定位研究

ATP7B酶是P型ATP酶家族进化高度保守的跨膜蛋白，与其他P型ATP酶（如ATP7A）的氨基酸序列大约有54%～65%的同源性。目前研究认为，当细胞内处于低铜环境，ATP7B酶主要定位于TGN；当细胞内铜离子浓度升高时，ATP7B酶接受激酶介导的磷酸化作用，从TGN重新定位至细胞的顶膜（apical membrane），以分泌小囊泡的形式将铜运出胞膜。如Schaefer等通过激光扫描共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscopy，LSCM）以双标记免疫荧光技术观察发现，肝细胞中未发生突变的ATP7B酶在低铜环境中主要位于TGN，而在高铜环境中则转移至细胞质泡室（cytoplasmic vesicular compartment），当去除高铜环境后ATP7B蛋白又重新迁移回TGN。Forbes等则将人工诱变的重组ATP7B cDNA质粒瞬时转染实验发现，在转染细胞中表达的ATP7B突变蛋白存在亚细胞功能定位障碍，或不能定位于TGN，或出现TGN↔细胞质泡室的迁移障碍。

作者在前期研究中采用Western blot技术发现WD患者肝细胞内ATP7B蛋白的异常表达，并发现WD患者肝细胞各亚细胞组分中的铜含量均显著高于正常对照者，推测可能系ATP7B突变蛋白的亚细胞功能定位障碍所致。在此基础上，作者采用LSCM双标记免疫荧光结合核染色技术，发现正常的DL小鼠的ATP7B蛋白在肝细胞内定位于TGN（图3-9），而ATP7B基因发生突变的TX小鼠的ATP7B蛋白在肝细胞内发生了TGN的定位障碍（图3-10），而以含中药肝豆汤兔血清孵育培养后的TX小鼠肝细胞的ATP7B蛋白则可重新定位于TGN（图3-11）。该研究初步揭示了中药肝豆汤细胞内排铜的机制。