第二节　神经干细胞与神经发生

神经发生（neurogenesis）是包括从神经干细胞（neural stem cells，NSC）增殖并经历对称和不对称分裂成为定向祖细胞（progenitor cell），并逐渐向功能区域迁移，不断发生可塑性变化，并与其他神经元建立突触联系，从而产生神经功能的完整的过程。

一、神经干细胞的定义及基本特征

包括Santiago Ramóny Cajal 在内的早期神经解剖学家认为哺乳动物的神经发生主要局限于胚胎发育阶段，而在成年阶段不具有再生能力，但随着研究的不断深入，人们逐渐发现事实并非如此。 Joseph Altman 于1962 年最早报道了在成年哺乳动物的大脑皮质中存在神经发生这一现象，但其发现一直被学术界所忽视。 直到20 世纪90 年代初期，不同的实验室先后从成年哺乳动物脑内分离出能够进行自我更新的多潜能细胞群落，才由此提出了神经干细胞的概念。

2000 年，给予神经干细胞的定义是：①能产生神经组织或源于神经系统；②具有自我更新能力；③通过不对称分裂生成除自身之外的其他类型细胞或组织（图2-3-1）。 其基本特征为：①具有自我维持、自我更新的能力。 所谓自我更新是指将干细胞的属性从亲代细胞传递到子代细胞，即在分裂增殖过程中子代细胞仍然维持干细胞的属性；②具有不断增殖分裂的能力。 即在一定的条件下能够不断分裂增殖，使得在体外培养能够大量扩增；③具有多向分化的潜能。 可生成中枢神经细胞内各种类型、分化成熟的后代细胞的能力，包括神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞；④对疾病和损伤具有一定的反应能力。

神经干细胞有两种不同的增殖方式：一种是对称分裂，即可通过分裂产生两个同亲代一致的神经干细胞。 另一种是不对称分裂，即可通过分裂产生一个与亲代一致的神经干细胞和一个特殊神经组织细胞系祖细胞。 由于祖细胞的分化能力和自我维持、自我更新能力受到限制，仅具有单潜能或双潜能分化能力或其干细胞样特征只能维持较短的时间，祖细胞在外界刺激因子的作用下可向相应的细胞系（神经元或胶质细胞）终末期细胞成熟，成为神经元或神经胶质细胞，而干细胞则缓慢分裂，在维持干细胞库稳定的同时产生祖细胞以补充丢失的祖细胞。

二、神经干细胞的分类及分布

（一）胚胎源性神经干细胞（embryo derived neural stem cells，EDNSC）

是指来源于早期胚胎或胚胎神经组织的神经干细胞，包括：

1.神经管上皮细胞

分裂能力最强，只存在于胚胎时期，可以产生放射状胶质神经元和神经母细胞。

2.放射状胶质神经元

分化能力较神经管上皮细胞受限。 在发育中的神经系统中，放射状胶质细胞会持续进行细胞分裂，产生放射状胶质神经元并同时产生神经前体细胞或胶质细胞。 其主要作用是充当新生神经元迁移的支架，亦可衍生出大脑皮质中大多数的投射神经元（projection neuron）。 在成熟的脑中，小脑和视网膜仍保留有典型的放射状胶质细胞。

3.神经母细胞

分化能力较神经管上皮细胞受限。 可以产生神经前体细胞、神经元以及各类神经胶质细胞。

4.神经前体细胞

各类神经细胞的前体细胞，比如小胶质细胞是由神经胶质细胞前体产生的。

在胚胎神经早期发育期间（神经管形成前），神经干细胞在神经管的管壁增殖，新生细胞沿放射状纤维迁移至脑或脊髓的特定部位；神经管腔最终发育形成脑室系统和脊髓中央管。神经管形成后，神经干细胞位于神经管的脑室壁周边。 研究表明，哺乳动物胚胎脑中的神经干细胞主要位于以下部位：嗅球、侧脑室脑室带、脑室下带、海马、脊髓、小脑和大脑皮质。 在不同物种之间，上述部位细胞的形态和数量颇有不同。

（二）成体源性神经干细胞（adult derived neural stem cells，ADNSC）

是指成体神经组织或成体非神经组织中的神经干细胞。 现已证实，在成年哺乳动物中枢神经系统中存在两个神经干细胞的聚集区域：①侧脑室壁的脑室下带（subventricular zone，SVZ）-吻侧突起（RE）-嗅球（OB）系统，一般认为在该系统中，侧脑室SVZ 中的神经干细胞产生神经母细胞，后者沿吻侧迁移通路（rostral migratory stream，RMS）不断向嗅球方向迁移、成熟，使感受嗅觉信息的嗅球神经元不断得到更新。 ②海马齿状回的颗粒下层（subgranular zone，SGZ）-颗粒细胞层（GCL）系统，在该系统中，颗粒下层为原始生发区，该部位的神经干细胞逐渐成熟，进入颗粒细胞层，形成新的神经细胞。 除此之外，近年来亦有研究报道，在成年动物脊髓的中央管周围也发现有神经干细胞的存在，这类中央管周围的神经干细胞培养后亦可形成神经细胞球并产生神经元。

三、神经干细胞的标志物

nestin 属于第Ⅳ类中间丝蛋白，在神经系统中主要表达于胚胎早期神经上皮细胞，出生后停止表达。 在神经前体细胞最先表达的是nestin，vimentin 次之，随后两者共存。 一旦神经前体细胞朝向终末方向分化成神经元或胶质细胞时，nestin 便停止表达，而相应的成熟神经元和星形胶质细胞分别表达其特异性标志物：微管相关蛋白2（microtubule-associated protein 2，MAP-2）和胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）。 因此，nestin 被广泛用于神经干细胞的鉴定。

musashi 是一种RNA 结合蛋白，选择性地表达于哺乳类动物的神经干细胞/祖细胞，并在维持干细胞状态和分化中发挥重要的作用。

vimentin 是一种波形蛋白，属于第Ⅲ类中间丝蛋白。 其表达比较早，起始于神经迁移完成时，分化完成后表达下降，因此也被一些人作为神经祖细胞的标志物。

胶质纤维酸性蛋白（GFAP）是一种胶质纤维酸性蛋白，属于第Ⅲ类中间纤维，是星形胶质细胞的标志物。 但研究表明其亦表达于室管膜下区的神经干细胞，因此有人认为其亦可用来标示部分神经干细胞。

四、中枢神经系统的形态发生

（一）神经诱导理论

现代发育神经生物学是基于实验胚胎学而发展起来的，最初的研究来自神经诱导（neural induction）研究，与之有关的重要发现就是“斯佩曼组织者”（Spemann organizer）理论。 既往研究表明，胚胎的发育和分化由两种因素决定：①遗传因素，即细胞谱系发挥重要的作用，这种发育被称为自主发育；②环境因素，即大多数细胞的发育命运由其邻近的细胞所决定，这种发育被称为受调控发育。 脊椎动物胚胎发育的过程是在遗传因素和环境因素的共同作用下完成的。

胚胎的基本结构是从三层细胞开始的，即内胚层、中胚层和外胚层。 外胚层的细胞根据其在胚胎背腹轴的位置，最终分化为不同的组织结构。 其中最背侧的外胚层增厚形成长条状的神经板（neural plate）。 神经板的边缘增厚隆起形成神经褶（neural fold），后者在中线融合，形成中空的神经管（neural tube），其为中枢神经系统原基。 位于神经管腹侧的部分外胚层细胞移行，形成神经嵴（neural crest），其为周围神经系统原基。 而位于神经管吻端腹侧的部分外胚层细胞最终发育为感觉器官，包括耳、鼻以及感觉神经节等。 位于胚胎最腹侧的外胚层细胞发育为皮肤或表皮。 因此，在原肠胚形成中，神经系统发育的首要步骤就是沿胚胎的背腹轴建立外胚层的不同分区，即在胚胎发育过程中，将神经系统从整个胚胎中分化出来而成为神经组织，也叫神经诱导。 其中神经组织是从外胚层分化诱导而来的，而诱导源来自中胚层。 经过神经诱导的外胚层细胞，只能发育成为神经元、胶质细胞或少数其他类型的细胞。

随着研究的不断深入，人们逐渐了解了神经诱导的分子机制。 目前研究者认为，向神经组织分化是默认的外胚层细胞的发育方向，但由于受到骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMP）等的抑制，外胚层会走表皮分化这条道路。 但是在中胚层的组织者释放的脊索蛋白、成头蛋白以及其他BMP 抑制剂的作用下，BMP 对神经分化的抑制作用会翻转过来，因此呈现出神经诱导（图2-3-2）。

（二）形态发生

随着神经板向上蜷曲闭合形成神经管，神经管管壁不断增厚重塑，前端结构逐渐发育为一系列原始脑泡，后端结构逐渐发育为脊髓原基。 这一形态发生的过程与中枢神经系统的有序发生和区域特化密切相关。 传统解剖学和生理学研究表明，结构功能类似的神经元起自特定发育阶段的神经管的特定部位，不同部位产生的神经元在细胞形态、突起走行、突触类型、神经递质以及细胞标志物等方面具有特异性，表明神经发生的时空顺序与中枢神经系统的正常发育密切相关。

在中枢神经系统发育的早期阶段，其形态发生主要在两个相互垂直的轴上进行，即前后轴（antero-posterior axis，AP 轴），也称吻尾轴，和背腹轴（dorso-ventral axis，DV 轴）。 各种形态发生素（morphogen）发挥位置信号的作用，在前后轴或背腹轴上具有不同的浓度梯度，进而借助浓度梯度诱导不同部位的神经祖细胞表达特定转录因子，调控区域特异的神经发生和神经迁移等。

1.AP 轴的形态发生

在早期胚胎发育过程中，中枢神经系统AP 轴的形成是伴随着体轴的形成发生的。 其中吻侧端的形成依赖于吻侧端组织者产生的抑制性因子：抑制BMP 信号通路和WNT 信号通路；而尾侧端的形成依赖于尾侧端组织者产生的促进尾端化的因子：WNT、成纤维生长因子（fibroblast growth factors，FGF）、维A 酸（retinoic acid，RA）等。 在这些因子的综合作用下，神经管沿AP 轴呈现出不同的极性（彩图2-3-3A）。

在后续发育过程中，神经管进一步沿AP 轴呈现出区域特化的特点。 局部组织者（local organizer）分泌的一些可扩散因子（形态发生素），借助浓度梯度调控不同区域转录因子的时空特异性表达，进而导致神经板区域特化形成。 功能研究表明，颈部体节分泌的RA 调控后脑菱脑节中homeobox（hox）基因的区域化表达，与菱脑节的形成密切相关；中脑后脑交界处分泌的FGF8 参与中脑和小脑的形成；而丘脑间区（zona limitans intrathamica，ZLI）分泌的Sonic hedgehog（Shh）参与丘脑结构的形成。

随着基因技术的发展，人们发现在脊髓中FGF 和RA 借助沿吻尾轴分布的浓度梯度发挥位置信号的作用，诱导尾端神经管hox 基因家族的表达，继而借助所表达的不同Hox 蛋白之间的交互抑制作用，形成表达特定Hox 蛋白的脊髓节段，并据此决定不同节段的细胞类型（见彩图2-3-3B）。 对脊髓运动神经元来说，hox6 基因的表达参与前肢外侧运动柱（lateral motor neuron columnar，LMC）的神经发生，而hox10 基因的表达参与后肢LMC神经元的神经发生。 此外，hox 基因的表达还参与调控运动神经元的肌肉支配。 功能缺失实验表明，Hox 蛋白对脊髓运动神经元的区域特化、纤维投射等的调控依赖于辅助因子-叉头同源结构域蛋白（forkhead class homeodomain protein，FoxP1）。

2.DV 轴的形态发生

在中枢神经系统的早期发育过程中，不同类型的细胞产生自沿神经管DV 轴分布的不同分区中。 在脊髓、后脑、中脑以及间脑的腹侧正中部位为由胶质细胞构成的底板；底板之上按腹侧-背侧顺序分别为前角中间神经元、运动神经元以及后角中间神经元的起源地；而在神经脊离开神经管之后，背侧中线闭合为顶板。 有关脊椎动物DV轴的形态发生的研究主要集中在神经管的尾侧端——脊髓，但有一些影响因子在神经管吻侧端可能也发挥类似的作用。 与AP 轴的形成依赖于局部组织者释放的单一形态发生素不同的是，DV 轴的形成依赖于腹背侧组织者释放的多种形态发生素的相互作用，即腹侧脊索或底板形成的Shh 浓度梯度和表皮外胚层或顶板产生的BMP 浓度梯度的相互作用。 这些形态发生素发挥位置信号的作用，诱导沿DV 轴分布的特异性转录因子的表达，最终决定DV 轴的形态发生。

端脑沿DV 轴主要分为背侧皮质区（发育为新皮质和海马）和腹侧皮质区（发育为基底神经节）。 在发育早期，腹侧皮质区管壁增厚，形成内侧基底节原基（medial ganglionic eminence，MGE）（发育为苍白球）和外侧基底节原基（lateral ganglionic eminence，LGE）（发育为纹状体）。 其发育受来自腹侧正中线的Shh 信号的影响。 而来自背内侧的BMP 和WNT 影响背侧皮质区的神经分化（彩图2-3-4A）。

在脊髓中，受Shh 和BMP 浓度梯度的影响，沿DV 轴会产生不同类型的神经元。 基因功能研究表明，一些早期用于标识不同细胞亚群的转录因子在区域特化中亦发挥重要的作用。借助于这些转录因子，脊髓脑室带沿DV 轴排布有不同的神经祖细胞结构域，进而产生不同类型的神经元，依次为背侧中间神经元（D1 ～D6）、腹侧中间神经元（V0 ～V2）、运动神经元（MN）和腹侧中间神经元（V3）等（彩图2-3-4B）。

五、中枢神经系统的组织构架

最初的神经管只包括一薄层神经上皮（neuroepithelium），而成熟的大脑有多种多层的皮质和各类核团，提示在发育过程中经历了多重细胞分裂和复杂的细胞分化迁移过程。

神经管形成后，构成神经板的单层柱状上皮开始增生，细胞数量增加，细胞核位置有高有低，形成类似假复层柱状上皮的形式，成为神经上皮。 神经管壁的内、外面覆盖着由间充质构成的基底膜，分别称为内界膜和外界膜。 在每个细胞周期时，神经上皮细胞的细胞核在内、外界膜之间往返移动。 在DNA 合成期即分裂准备期，细胞核靠近外界膜；而在细胞分裂期间，细胞核靠近内界膜，且与外界膜暂时失去连接；但在细胞分裂之后，一个或两个子细胞都可能和内界膜脱离，向外界膜的方向迁移成为游离的神经母细胞。 由于神经母细胞的不断形成及迁移，神经管增厚，形成三层结构：最内层为脑室带（包括神经上皮细胞，为胚胎期细胞增殖的主要区域），中间是神经母细胞胞体密集排布的套膜带，表层为神经母细胞伸长的轴突组成的边缘带。 这三层结构保留于脊髓和延髓，随着神经管壁神经元的发育，套膜带进一步分化为中枢神经的灰质，而边缘带分化为将来的白质。 但在其他区域，比如大脑和小脑，一些神经母细胞会迁移进入边缘带，形成皮质板，后者成熟而成为成体皮质。

应用放射性核素标记技术研究发现，哺乳动物的大脑皮质锥体神经元的发育呈现由内向外的方式（inside-out）进行：最早产生的神经元位于皮质板深层，而较晚产生的神经元穿过已产生的深层神经元，定位于皮质板浅层。 供体与受体的移植研究表明，神经元的最终定位在其还在脑室带时即已决定，与其退出细胞周期（最后一次有丝分裂），即产生时间有关（彩图2-3-5）。

六、神经干细胞的细胞决定

通过中胚层的诱导，神经管基本成形后，为了形成具有成熟功能的神经系统，那些增殖的前体细胞将退出细胞周期，分化为不同类型的神经细胞。 因此，从细胞水平来看，就是要探求神经干细胞怎么从外胚层细胞中分化出来，以及这些干细胞怎么确定其进一步分化方向。 基于果蝇和脊椎动物的研究表明，神经细胞命运决定（cell determination）是内源性基因调控和外源性信号调控两种机制共同作用的结果。

（一）内源性基因调控

内源性基因调控是指神经干细胞自身的转录因子及其他的一些功能蛋白对其发育的调控，其中牵涉到一些细胞内的信号转导通路。

目前已清楚Notch 信号通路在神经干细胞的基因调控中发挥负性调控的作用，研究表明该通路的激活与3 个蛋白质有关系，分别为Notch、Delta 和AS 复合物（achaete-scute complex）。 在神经系统发育过程中，神经管同一部位的细胞会分化为不同类型的细胞，其中只有部分细胞会分化为神经细胞。 研究人员认为这一过程的机制如下：首先，位于神经管中的细胞均具有分化为神经前体细胞的可能。 其次，这些细胞会相互竞争，以确定各自的分化方向。 例如，在早期发育阶段，果蝇的神经外胚层细胞都有形成神经前体细胞的可能，并表达能使其成为神经前体细胞的因子（AS 复合物）。 然而，一旦某个细胞分化为神经前体细胞，其会分泌抑制信号[suppressor of hairless，Su（H）]，阻止邻近其他细胞也选择这一命运，这就是“侧位抑制”机制。 这个过程是通过Notch 和其配体Delta 完成。 在最开始，所有的前体细胞都可以表达同样多的Notch 和Delta，到某一阶段，其中一个细胞会比别的细胞表达更多的Delta（该细胞将分化为神经前体细胞），这些Delta 会和邻近细胞的Notch 结合，进而通过上调Su（H）的释放和核转位，进而抑制邻近细胞中AS 复合物的表达，最终使后者分化为表皮细胞。 这样，那些在发育初期性质相同的细胞通过侧位抑制的途径，有些细胞会形成神经细胞，而邻近的其他细胞则形成表皮细胞。 由于Notch 信号通路在进化上的保守性，这种机制在脊椎动物中也是发挥作用的。

除此之外，Notch 信号通路对神经干细胞的分化亦具有抑制性的调控作用。 当Notch 与其配体Delta 结合后，Notch 信号通路被激活，通过对称性分裂增加神经干细胞的数量，进入增殖程序；反之则通过不对称分裂进入分化程序，发育为成熟的神经细胞。 果蝇的Notch 信号通路分析研究表明，该调控作用与胞内蛋白Numb 对Notch 的调控有关。 既往研究表明，神经干细胞主要通过对称性分裂产生与亲代一致的子代，维持自身数量的稳定和实现自我更新；而通过不对称分裂产生不同性质的神经细胞。 子代细胞的命运与分裂平面有关：通常认为垂直分裂为对称性分裂，两个子细胞仍留在脑室带继续进行分裂；而水平分裂为不对称分裂，距脑室带较远的子细胞会向外迁移，分化为特定类型的神经细胞，其余的子细胞则留在脑室带继续进行分裂。 分裂平面决定细胞命运的机制在于子细胞从母细胞继承的细胞质中的决定子Numb 的不同。 细胞分裂前，Numb 迁移到母细胞的基底面，当细胞垂直分裂时，Numb 被平均分配到两个子细胞中，两个子细胞与亲代性质一致，均可继续分裂；而当细胞水平分裂时，Numb 留在距脑室带较近的子细胞中，该细胞可继续分裂，而另一个Numb 缺失的子细胞则保留亲代的性质（图2-3-6）。

除Notch 信号通路外，一些碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-1oop-helix，bHLH）转录因子亦参与神经干细胞的分化调控。 其中发挥关键性作用的bHLH转录因子可依据其效应分为抑制型和促进型两类。前者包括HES-1、HES-3 和HES-5，而后者包括Mash-1、Math 以及Neurogenin（Ngn）。 当抑制型转录因子（HES-1、HES-3 和HES-5）表达时，神经干细胞的分化将被抑制，抑制神经干细胞分化为神经元或胶质细胞，从而保持神经元和胶质细胞合适的数目和比例。 而当抑制型转录因子表达下调时，神经干细胞不能进行充分的增殖，而是过早地分化为神经元，这些神经元在没有形成星形胶质细胞和室管膜细胞的情况下会逐渐衰竭，从而导致神经胶质细胞数目减少，神经干细胞甚至消耗殆尽。 当促进型转录因子表达上调时，神经干细胞向神经元的分化增强，而向胶质细胞的分化减弱，同时还能诱导Notch 配体Delta 的表达，通过活化Notch 信号通路，促进邻近细胞抑制性转录因子的表达，从而维持其处于未分化状态。 抑制型bHLH 转录因子和促进型bHLH 转录因子相互协调，共同调节神经干细胞的分化，不仅在神经发生的早期阶段起作用，并且在脑发育的晚期阶段也发挥重要作用，对于维持正常的脑形态及脑结构至关重要。

（二）外源性信号调控

外源性信号调控是指神经干细胞所处的微环境对其发育的调控，包括细胞因子、微环境等多个方面。

目前普遍认为表皮生长因子（epithelia grow factor，EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（base fibroblast growth factor，bFGF）等丝裂原信号在神经干细胞的增殖和分化中发挥重要的作用，其可维持神经干细胞的自我更新能力。 其他一些神经因子，如转移性生长因子-β（transform growth factor β，TGF-β）、骨形态发生蛋白2（bone morphological protein，BMP2）、脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、血小板源性生长因子（plateletderived neurotrophic factor，PDGF）、神经营养因子（neurotrophin，NT）以及淋巴细胞抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）等在神经干细胞的分化过程中主要起协同作用（具体内容见下节）。

微环境是指能对神经干细胞的分化产生影响的周围结构成分，包括附近的神经细胞、胶质细胞和细胞外基质等。 细胞外基质由各种糖蛋白/黏蛋白组成，通过调节黏着和迁移能力，以及与细胞外基质中各种生长因子和细胞因子的结合，来影响神经干细胞的增殖和分化。 外源性信号调控对神经干细胞的发育同样重要，同一来源的神经干细胞在不同微环境下可发育为不同的神经细胞，而且干细胞所处的微环境也随着时间、空间时刻在变化。

由此可见，神经干细胞的细胞决定是细胞内多信号转导途径，以及诸多外界环境因素参与的错综复杂的调控过程。 这些内源性和外源性调控机制的作用以及相互之间的作用仍有待进一步深入研究。 Sidney Brenner 将其类比为细胞命运或由欧洲模式决定，或由美国模式决定：在欧洲模式中，是怎样一个神经元取决于该细胞的世系；而在美国模式中，是怎样一个神经元则取决于该细胞的邻居。

七、神经干细胞的应用研究

随着成体神经干细胞的发现和对神经干细胞增殖、分化机制的深入研究，人们逐渐认识到神经干细胞的主要功能是作为后备贮备，参与神经系统损伤修复或细胞正常死亡的更新。基于神经干细胞具有自我更新和多向分化的潜能，神经干细胞可望成为脑损伤修复的替代来源，基于该领域的神经性疾病的治疗研究也备受关注。

（一）研究策略

1.原位诱导

即利用某些有助于细胞存活、分化以及生长的细胞因子、激素和其他信号转导分子，激发个体自身的内源性神经干细胞的修复机制，对损伤的组织进行修复。

2.细胞移植

即通过体外培养未分化的神经干细胞，将其诱导分化为预先设计好的具有特定潜能的成熟神经细胞，再将这些分化好的细胞植入到损伤部位，发挥修复作用；或将未分化的神经干细胞直接植入损伤部位，靠体内的信号转导机制让其发育成为该部组织所需要的成熟神经细胞，以达到修复的目的。

由于成体神经干细胞的数目和分布部位有限，以及中枢神经系统特殊的内环境的限制，通过内源性神经干细胞的增殖与分化治疗各类神经性疾病的能力有限。 因此目前的研究主要关注于神经干细胞的移植或具有特定分化潜能的神经前体细胞的移植。 但面临的主要问题是如何使神经干细胞定向分化为具有特定功能的神经细胞，进而实现功能恢复的目的。下述内容主要围绕细胞移植展开。

（二）神经干细胞的来源

1.来源于神经组织

如前所述，在哺乳动物胚胎脑中的大部分脑区，如嗅球、侧脑室脑室带、脑室下带、海马、脊髓、小脑和大脑皮质等，以及成年动物的侧脑室脑室下带、齿状回、脊髓中央管周围等部位均能成功分离并培养出神经干细胞。 但由于受技术条件、来源以及伦理道德等的限制，该方面的临床应用受到制约。

2.来源于胚胎干细胞

胚胎干细胞可通过定向诱导分化，产生神经干细胞。 但由于伦理道德的限制、潜在的成瘤性以及移植排斥等问题，该方面的研究受到一定的限制。

3.来源于骨髓间充质干细胞

通过诱导分化，使骨髓基质干细胞定向分化为具有特定潜能的神经细胞。 由于骨髓间充质干细胞的来源广泛、容易获得、分离培养速度快，且具有较强的自我增殖、多分化潜能、低免疫源性以及良好的组织整合性等特性，该方面的研究成为体外诱导神经分化的热点之一。

4.来源于脐血间充质干细胞

同骨髓间充质干细胞类似，脐血亦具有来源丰富、易于获得、采集方便的优点，加之脐血间充质干细胞具有更强的增殖及分化能力、移植后免疫排斥小等优势，该方面的研究亦为临床应用研究的热点之一。

5.其他来源

亦可从脂肪间充质干细胞、嗅球外间质干细胞、永生化细胞系（如C17.2细胞系、MHP36 细胞系、NT2 细胞系、N2a 细胞系等），以及通过基因操作获得神经干细胞。

（三）神经干细胞的移植方式

1.局部注射移植

（1）立体定向脑内注射移植：

是目前动物实验和临床研究采用最多的干细胞移植方法。该方法定位准确，适用于多种疾病模型的研究和病灶比较局限的疾病的治疗，如局灶性脑梗、帕金森病等。 其优点在于能将干细胞集中到病灶及其周边发挥治疗作用，神经功能改善迅速、直接。 但缺点包括：①会对脑部造成机械性损伤；②由于容积占位效应，移植量有限；③植入细胞可被激活的小胶质细胞等清除，致使移植成功率较低；④局部神经干细胞过度聚集，不利于神经分化等。

（2）脊髓局部注射移植：

是目前治疗脊髓损伤的动物实验和临床研究采用最多的干细胞移植方法。 其优点在于该方法可使移植的细胞在损伤脊髓两端发挥作用，同时手术可以发挥减压的作用，促进部分脊髓功能的恢复。 但缺点在于创伤大，存在出血的风险，且手术本身为二次损伤，有可能加重神经功能的缺失。

2.经脑脊液途径移植

（1）腰椎穿刺注射移植：

该方法适用于病变较广泛的神经性疾病的治疗。 主要借助脑脊液循环将移植细胞输送到整个大脑和脊髓。 其优点在于创伤小，操作简单。 但缺点在于：①不好控制移植细胞的分布范围，治疗效果不如定向注射明确；②由于需要通过脑脊液-脑屏障，细胞损伤较多；③植入细胞直接进入脑脊液，与体外培养环境差异较大，不好评估在体存活细胞数量。

（2）脑室穿刺注射移植：

该方法兼具脑内注射和腰椎穿刺注射的优缺点。 其优点在于：①移植细胞可直接到达脑室系统，循环路径较短，细胞损失较少；②避免了脑内注射移植时的容积占位效应，增加了移植量；③由于移植细胞可远离损伤环境，避免了损伤区微环境对移植细胞的清除，提高了移植成功率；④脑室内环境有利于移植细胞的神经分化。 其缺点在于：①脑室穿刺的创伤较腰椎穿刺大，风险较高；②同样需要通过脑脊液-脑屏障，需要移植的细胞数量要增加。

3.经血液循环途径移植

（1）静脉内注射移植：

该方法通过血液循环，使移植系统通过血-脑脊液屏障到达脑组织发挥作用。 其优点是创伤小、避免损伤正常脑组织，且可以通过反复多次移植来弥补到达病灶区神经干细胞数目较少的不足。 其缺点在于从外周静脉进入脑内需经长时迁移，最后进入脑内的细胞数量十分有限，从而导致移植成功率不高。

（2）动脉内注射移植：

该方法的基本原理与静脉内注射移植基本相同。 多采用颈内动脉穿刺的方法，以便移植细胞集中进入脑组织，减少损耗。 其缺点在于可能会使动脉壁上的血栓脱落形成脑血栓，或可能形成夹层动脉瘤。

（四）神经干细胞移植在神经系统疾病中的作用

目前，神经干细胞移植广泛应用于脑损伤性疾病、神经退行性疾病以及遗传代谢性脑疾病等。

1.神经干细胞在脑损伤性疾病中的应用

颅脑外伤以及各种脑血管意外是脑损伤的主要原因，其共同特点是局部神经元和胶质细胞的缺失，表现为运动、感觉以及认知功能损害，目前尚无有效的方法促进脑神经损伤后神经功能的恢复。 神经干细胞移植为改善脑损伤后遗症带来了希望。

研究表明，缺血性脑损伤或脑外伤的情况下，成年啮齿类动物海马齿状回颗粒下层的神经干细胞会反应性增殖、分化和迁移，补充部分缺失的神经元或胶质细胞。 但是这些反应性的神经发生不足以抵消负性应激造成的细胞死亡，因此仍需补充神经干细胞以实现功能修复。 研究表明，在缺血性脑损伤所形成的梗死半暗带存在着由损伤后的神经细胞和神经胶质细胞以及血管内皮细胞等释放的大量的细胞因子、炎性介质等，这些因子构成了缺血性脑损伤时神经干细胞增殖分化的微环境，在促进内源性神经发生和神经替代方面具有重要的意义。 内源性神经干细胞治疗不存在伦理道德、免疫排斥等方面的问题，然而由于其分布局限、数量有限，并且其增殖、分化、迁移、存活以及神经元修复和突触形成的机制不清楚，很大程度上限制了该方面的应用。

在大多数情况下，仅由内源性干细胞增殖分化新生的神经组织可能不足以替代损伤后缺失的组织，尤其在脊髓、纹状体等神经组织发生很少的部位。 因此，通过外源性途径使神经干细胞在体外特异性地分化为特定类型的细胞，并将其移植到患者体内，已经成为大多数学者的研究方向。 研究表明，给予缺血性脑梗死啮齿类动物注射外源性神经干细胞，可以改善动物的功能损失，观察到梗死区体积减小，并且在显微镜下可见缺血半暗带有新生的神经细胞和胶质细胞。 目前关于该方面的研究主要是将中枢神经系统中的神经祖细胞或干细胞分离出来，借助分子生物学的方向，导入外源性基因，建立永生化祖细胞系或干细胞系，根据损伤部位进行定点移植，提高成功率。

2.神经干细胞在帕金森病中的应用

帕金森病是一种常见的神经系统变性疾病，其主要病理变化为中脑黑质多巴胺能神经元的变性缺失导致纹状体内多巴胺递质释放减少，从而产生帕金森病的一系列症状。 由于药物治疗和手术治疗的限制，较为理想的方法就是增加多巴胺能神经元的数目，从根本上解决多巴胺能神经元的来源问题，也就是细胞替代治疗。 神经干细胞稳定的增殖能力、潜在的迁移能力以及诱导分化为特定细胞类型如多巴胺能神经元的能力，是神经干细胞成为帕金森病细胞移植治疗的重要来源。

20 世纪中期，Lindvall 等将含多巴胺能神经元的胚胎脑组织首次移植入帕金森病患者的纹状体，改善了患者的临床症状。 其后随着干细胞体外培养技术的建立和成体干细胞横向分化能力的发现，干细胞治疗成为帕金森病治疗研究的方向之一。

早期的研究大多直接将神经干细胞从胎脑中分离出来，体外用一些生长因子刺激其增殖生长，而后再移植回脑内，在体诱导分化，希望其能促进神经系统功能的恢复。 各种动物实验研究表明，来源于不同脑区的神经干细胞在体内不同的脑环境中，出现不同的分化方向。 从多巴胺能神经元发育的中脑分离的神经干细胞可能由于本身含有中脑源性转录因子，更有利于分化的成功。

但由于神经干细胞具有多向分化性，移植入脑后大部分向胶质细胞分化，在形成神经元的同时，也产生了很多胶质细胞，形成胶质瘢痕，阻碍神经纤维的延伸。 更为严重的是干细胞可能在脑内异常增殖，形成畸胎瘤样肿瘤等。 因此大家逐渐认识到将神经干细胞先在体外诱导分化为相应的祖细胞甚至神经元，减少胶质细胞的比例，而后再移植，效果可能更佳，而且也更安全。 相关的研究也主要集中在神经干细胞向多巴胺能神经元体外诱导分化条件的摸索，先后发现IL-1、IL-11、LIF 和GDNF 等细胞因子，维生素C，以及3%低氧环境能提高向多巴胺能神经元的分化比例。

在体外进行诱导分化虽有可行性，但由于影响细胞分化的因素尚未明确，且神经干细胞诱导分化后阳性比例仍然偏低，故而有一定的局限性。 已经证实体内的神经干细胞可受外界因素的调节，因此可激活或动员内源性神经干细胞迁移到纹状体，使之分化为多巴胺能神经元，与周围建立突触联系治疗帕金森病。 中脑黑质神经前体细胞的发现和分离成功，更向人们表明了原位诱导的重要性和可能性。 尽管神经干细胞的原位诱导仍有很多问题尚待探索。 但可以肯定的是，通过原位诱导神经干细胞或者特定的神经前体细胞在黑质内的再生来治疗帕金森病具有良好的前景，由此也可以开发刺激患者本身神经干细胞增殖和向神经元分化的药物来达到治疗帕金森病的目的。

3.神经干细胞在癫痫中的应用

癫痫是慢性反复发作性短暂脑功能失调综合征，以脑神经元异常放电引起反复痫性发作为特征。 其中导致癫痫发作的神经元放电或损害影响到整个或部分颞叶的局限性癫痫，称作颞叶癫痫。 目前普遍认为颞叶癫痫的发生与以下因素有关：①海马齿状回门区锥体神经元的丧失和苔藓纤维的异常芽生；②γ-氨基丁酸（GABA）能神经元递质的改变；③中间神经元的抑制性减弱，谷氨酸能神经元的兴奋性增强。

因此，用移植的方法增加GABA 能神经元的数量，以此恢复抑制性神经递质和兴奋性神经递质的平衡，可能为从根本上治愈颞叶癫痫带来希望。 目前已经能够通过体外诱导的方法将神经干细胞分化成GABA 能神经元和谷氨酸能神经元；此外亦可通过基因操作，将GABA 基因转入神经干细胞，然后植入海马，恢复兴奋性-抑制性的平衡，进而达到治疗癫痫的目的。 目前已有研究表明，移植的神经干细胞可显著减轻癫痫模型的细胞损伤、减少受损神经元出现异位的苔藓纤维发芽及超微结构的损伤，并使癫痫动物模型的脑放电减少、波幅下降。 这些结果提示神经干细胞移植治疗颞叶癫痫模型的有效性。

随着研究的不断深入，人们发现癫痫发作诱发的脑损伤在导致神经细胞损失的同时，也可活化齿状回颗粒下层的神经干细胞（祖细胞），使其分化成熟，这就提示在损伤部位可能存在代偿现象。 但是，由于癫痫灶外远隔部位的神经元会转变成为镜影癫痫灶，这些内源性或外源性神经干细胞在癫痫微环境下，亦有转变为“癫痫神经元”的可能。 这就给神经干细胞移植治疗癫痫带来希望的同时，也带来了挑战。 这些细胞会被诱导分化补充丢失的神经元发挥治疗癫痫的作用，还是会被诱导发育为异常放电的“癫痫神经元”加重癫痫的发作，目前尚无定论。

4.神经干细胞在脊髓损伤中的应用

脊髓损伤后会导致细胞溶解、溶酶体破裂、组织水肿、细胞毒性物质释放，进而导致脊髓断端发生变性、坏死等。 借助神经干细胞移植可以补充损伤后缺失的神经元和胶质细胞；可通过新生神经细胞释放多种神经营养因子，改善局部微环境，进而促进轴突再生；通过产生的细胞外基质，填补损伤后遗留的空腔，为轴突再生提供支持物；还可形成新的髓鞘，保持神经纤维的完整性。 但由于脊髓本身内源性神经干细胞的数目有限，不足以替代损伤后缺失的组织、恢复功能。 因此目前主要通过转基因技术，以神经干细胞为载体，使神经生长因子长期稳定地在特定部位表达，改善损伤部位的微环境，促进局部神经通路的重建，改善肢体功能。

随着对神经干细胞研究的不断深入，应用神经干细胞治疗中枢神经系统损伤的研究也取得了快速的发展。 但总的来说仍有许多问题尚未解决，如神经干细胞定向诱导分化的机制不明，微环境中神经营养因子的产生途径未明。 相信随着研究的不断深入，这些问题终将会得到不同程度的解决。