第一篇 感染性疾病的实验室诊断
第一章 概 述
一、诊断原则
感染性疾病诊断分为三个层次:①确定是感染性疾病还是非感染性疾病;②确定感染部位;③如有可能，明确感染性疾病的病原学。感染性疾病诊断还需要考虑患者的宿主因素，如年龄、是否有糖尿病等基础病、是否存在免疫缺陷。
对于危及生命的严重感染，特别是需要长时间抗感染治疗的疾病，如心内膜炎、化脓性骨关节炎、脑膜炎，应该积极寻找病原学证据。另外，当感染性疾病患者对经验性抗感染治疗反应不佳时，也需要找到病原菌，或者排除非感染性疾病因素。
病原学诊断是感染性疾病诊断的金标准，只有了解病原学和药敏结果，才能真正做到选择正确的抗菌药物和合理用药，同时避免耐药的发生。最终可以节省医疗花费，减少住院时间，降低病死率。对临床医生而言，优化病原学诊断有三点要求:①临床医生采集合格的标本;②标本及时送达微生物学实验室;③如有可能，使用抗菌药物前留取标本。
1.微生物学实验室与临床医生密切沟通，准确诊断感染性疾病
感染性疾病的病原学诊断包括从留取标本到获得药敏结果，是一个复杂的过程。无论是临床医生还是微生物学家，如果能熟悉整个过程，无疑对提高病原学检出率、指导合理使用抗菌药物有帮助。临床医生与微生物学家应该“优势互补”，共同进步。没有微生物学检验，临床仅仅是“经验主义”，抗菌药物的使用常常是无根据的;而没有临床，微生物学检验也就成了“无源之水”。
临床医生要熟悉各种细菌/真菌/分枝杆菌的形态、细菌/真菌鉴定和培养的操作常规，以及对各种抗菌药物的药敏规律。微生物学家还要起到架起临床与微生物学实验室之间桥梁的作用，并把细菌鉴定和培养的信息以最快的速度反馈回临床。微生物学家还需要主动走出实验室，走到临床一线，帮助不太熟悉感染性疾病的医生解决临床难题，指导医生了解标本留取的要求、如何正确判读药敏报告、如何正确控制院内感染等。
对于任何一例感染性疾病，如果临床医生都能积极地追求病原学诊断，为一份痰、一份血、一份脑脊液标本多跑几次微生物学实验室，这样的医生一定能掌握必要的病原学知识，这样的医生也一定能成为合理使用抗菌药物的专家。同样道理，微生物学家如果发现了有重要临床意义的微生物学结果，比如阳性的血培养、脑脊液发现革兰阴性双球菌、脑脊液墨汁染色阳性、痰或支气管肺泡灌洗液发现抗酸杆菌、发现少见的耐药表型，主动和临床医生沟通，详细了解患者的临床表现和影像学特征，并向医生解释微生物学检验结果，这样不但可以提高病原诊断和治疗成功率，而且对于微生物学家也是重要的学习过程，不断促进微生物学家能力的提高。出色的微生物学家都经常到临床参加会诊和讨论，通过为感染性疾病患者提供高质量的会诊，和临床医生共同成长和提高。
2.重视病史询问，鉴别感染性疾病和非感染性疾病
成功鉴别感染性疾病和非感染性疾病，不可能是一朝一夕之功。临床医生需要格外重视详细的病史询问和体格检查，不断总结经验教训，积累临床经验;用病原学诊断不断纠正自己临床诊断的偏颇。由此可见，重视内科基本功的训练，是提高感染性疾病和非感染性疾病鉴别诊断的最重要方法。
例如:仅仅根据发热症状和胸部影像学表现，不足以诊断医院获得性肺炎［1］，还需要仔细作出鉴别诊断:①老年男性，有长期吸烟史，出现咳嗽、咳痰表现，经抗感染治疗无明显缓解者，需进一步检查有无肺癌;②患者除了肺部症状，还有鼻出血、血尿、胃肠道出血、蛋白尿、皮下结节、坏死性溃疡及浅表皮肤糜烂，要考虑结缔组织病的可能。
3.合格标本多次送检，重视微生物学检验标准化，提高病原学检出率
一个很简单的道理:如果临床医生不能给微生物学实验室送合格标本，就谈不上病原诊断，微生物学家这时真是“巧妇难为无米之炊”［2］。社区获得性肺炎在留痰之前哪怕用过一次抗菌药物，像肺炎链球菌和流感嗜血杆菌这样的苛养菌可能就培养不出来;血培养送检标本量和检出率有直接关系，标本量越大检出率越高;外科伤口感染如果拿棉拭子采集脓液送检，细菌培养阳性的机会大大下降，因为拭子只能蘸取150μl液体，而且厌氧菌在拭子中不能存活;疑似肺结核的患者，医生在患者留痰前花2～3分钟辅导标本留取要点，就能提高送检标本质量，提高检出率［3］;有些情况下，还需要积极创造条件、抓住时机进行手术或者活检，因为组织标本对于明确病原诊断更有意义。
像临床医生重视病史采集和体格检查等基本功的训练一样，微生物学家也要格外重视微生物学检验基本功的训练，特别重视标本接种的标准化和显微镜检查。例如:如果痰细菌培养不能仔细做到三区划线，就无法获得单个菌落;如果没有获得纯培养，药敏结果就可能出现假阳性。虽然分子生物学技术不断发展，但是微生物学检验还类似于病理诊断，更多依靠微生物学家肉眼和显微镜下观察，临床经验对于微生物学鉴定有重要意义。
4.正确理解药敏结果
当微生物学实验室从临床标本中分离出菌株后，下一步将进行体外药敏试验( AST)，并按照美国临床实验室标准化委员会( Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)指南进行结果判定。AST结果是按照最低抑菌浓度( minimal inhibitory concentration，MIC)来报告的，根据CLSI的判定标准，结果可以释解为“敏感( sensitive，S)”、“耐药( resistance，R)”、“中介( intermediary，I)”或“剂量依赖型敏感( SDD)”，目的是通过体外试验预测某种抗菌药物对某种病原菌临床治疗效果(成功还是失败)。
体外药敏结果的解释需要注意以下几点:
( 1)首先医生要结合临床资料，判断所分离的病原菌是否是真正的致病菌。
( 2)同一株菌不同抗菌药物之间的MICs值并不能直接比较。比如，一株大肠埃希菌，环丙沙星MIC为2mg/L，头孢他啶MIC为1mg/L，并不代表头孢他啶抗菌能力是环丙沙星的两倍。
( 3)针对不同感染部位，AST结果解释不同。虽然对于某些菌，CLSI给出不同感染类型的药敏折点(例如肺炎链球菌对青霉素、头孢曲松等具有脑膜炎和非脑膜炎两种不同的药敏结果判定标准)，但是目前CLSI还无法对所有的菌都制定出不同感染类型的判定标准。
( 4)临床应注意实验室使用的药敏试验的折点的版本和范围。虽然CLSI每年都对药敏折点进行修订和更新，但实验室由于设备等条件所限，可能不能及时进行更新。
( 5)目前某些药物的药敏折点的设定是基于检测出耐药菌来，还缺乏大量的临床数据。如肠杆菌科中碳青霉烯类的敏感性折点。
5.传统方法与分子生物学诊断技术相结合，提高病原诊断率
随着SARS冠状病毒、高致病性H5N1禽流感病毒、新型甲型H1N1流感病毒，以及人感染H7N9禽流感病毒等新发呼吸道感染不断出现，分子生物学诊断已经成为临床微生物学实验室的不可缺少的检验技术，而且必将越来越受到重视。北京朝阳医院调查发现流感病毒、副流感病毒、腺病毒以及偏肺病毒引起的肺炎占门诊肺部感染的9. 6%，因此，病毒性肺炎不容忽视［4］。以前，采用传统方法检测，社区获得性肺炎的病原学诊断阳性率最高的只有50%［5］。通过分子生物学诊断，我们对不明原因肺炎的认知程度逐渐增加。近期研究表明，应用分子生物学诊断方法，肺炎病原学检出率可以提高到67%。与传统微生物方法比较，实时定量PCR技术不但可以提高呼吸道病毒的检出率，也可以提高肺炎链球菌的检出率［6］。分子生物学检测方法将成为实验室诊断主要的发展方向。
目前，分子生物学检测方法的研究热点是:①高通量:可以同时检测多种病原体;②标准化:包括从检测样本的选择、核酸提取方法和反应体系的优化，以及最终的结果判读标准等;③自动化:可实现从核酸提取到检测完成的全程自动化［7］。
总之，在细菌耐药受到广泛关注的今天，临床医生需要改变盲目依靠新的广谱抗菌药物来应对难治性感染的习惯。根据病原学结果，谨慎选择窄谱抗菌药物，才是科学的应对之道。临床微生物学实验室也需要不断采用新的病原学诊断方法，大力培养临床微生物学专家，不断提高能力，来满足感染性疾病诊治的需要。临床微生物学家不仅仅在实验室内部进行病原学检测，还肩负着病原学结果解释的重任。临床微生物学家需要经常走出实验室，参加临床感染性疾病的会诊工作，和临床各科进行联系，共同讨论感染症的诊断和治疗问题，提出相应建议和措施，并对技术工作进行检查和指导。
二、治疗原则
不合理使用抗菌药物导致耐药菌产生和传播，很多以前可治的细菌感染现在变成“不治之症”。2006年美国感染性疾病学会( Infectious Diseases Society of America，IDSA)提出“Bad bugs，no drugs”，提醒临床医生合理使用抗感染药物。2009年IDSA再次发表社论，提醒临床医生警惕六种耐药菌( ESKAPE)感染，包括:屎肠球菌( Enterococcus faecium，E)、金黄色葡萄球菌( Staphylococcus aureus，S)、肺炎克雷伯杆菌( Klebsiella pneumoniae，K)、鲍曼不动杆菌( Acinetobacter baumannii，A)、铜绿假单胞菌( Pseudomonas aeruginosa，P)、肠杆菌科细菌( Enterobacteriaceae，E)［8］。面对细菌耐药难题，2011年世界卫生日提出口号“antimicrobial resistance: no action today，no cure tomorrow(今天不采取行动，明天就无药可用)”［9］。另外，不合理使用抗菌药物不仅达不到治疗效果，还增加药物不良反应，并造成医疗花费的增长。
选择合适的抗菌药物，要遵循下列三个原则:首先要判断是不是感染;其次要正确理解经验性治疗和目标治疗;再次要了解抗菌药物的药代/药效学、副作用，以及影响抗菌效果的宿主因素。
1.鉴别诊断是选择合适抗菌药物的基础。选择抗菌药物要把握一个原则，如果不是感染性疾病，尽量不用抗菌药物。当临床鉴别诊断困难时，抗菌药物的使用时机由疾患的危急程度决定:当怀疑脓毒症休克、发热伴粒细胞缺乏、细菌性脑膜炎时，抗菌药物应该立即给予，不能迟疑。但是，如果患者生命体征稳定，一般情况好，可以先不着急应用抗菌药物，先深入地了解病史，做全面的体格检查和必要的实验室检查，同时还要更加积极地寻找病原学证据。特别是亚急性感染性心内膜炎、脊柱骨关节炎，因为需要数周时间抗菌治疗，就需要在多次留取血培养以后再开始抗菌药物治疗。过早使用抗菌药物将抑制细菌生长，丧失掉病原诊断的机会。
2.经验性抗菌治疗不是盲目治疗，而是在深入了解病原流行病学基础上的科学的抗菌治疗。
因为病原学结果常常需要等待24～72小时，因此，初始抗菌药物的选择常常是经验性的。但是，经验性选择抗菌药物绝对不是盲目选择，而是应该建立在对感染部位、宿主因素和病原流行病学深入了解的基础上。
( 1)社区获得性皮肤软组织感染常见致病菌为链球菌属和葡萄球菌属;急诊细菌性脑膜炎常由肺炎链球菌或者脑膜炎奈瑟菌感染引起;医院获得性导管相关性血流感染常常由定植在皮肤表面的葡萄球菌引起。因此，选择抗菌药物就需要针对这些感染部位常见的病原菌选药。
( 2)经验性选择抗菌药物要参照当地各种感染的病原学类型和常见耐药表型。
( 3)经验性应用抗菌药物后要密切随访。如果是感染性疾病，而且抗菌药物选择得当的话，一般48～72小时见效。如果加用抗菌药物后72小时无效，或者病情继续加重，就需要考虑:是否为非感染性疾病?感染灶是否未清除或引流不畅?是否存在特殊感染(结核分枝杆菌、诺卡菌、肺孢子菌等) ?
经验性抗菌药物治疗过程中，一旦病原学结果和药敏结果明确，就需要根据药敏结果调整用药:从联合治疗改为单药治疗;从广谱抗菌药物改为窄谱抗菌药物;选择价格便宜药物，降低花费;选择毒副作用小的抗菌药物。
3.了解抗菌药物药代/药效学和宿主因素，抗菌药物选择“知己知彼”。要想合理选择抗菌药物，必须掌握常用抗菌药物的药代学和药效学。根据药代学/药效学( pharmacokinetics/pharmacodynamics，PD/PK)理论，抗菌药物的疗效可以分成两大类，一类“时间依赖性”，以β-内酰胺类为代表，疗效与T＞MIC(最低抑菌浓度)有关，要发挥这类抗菌药物最佳的疗效，必须一天多次给药;另外一类为“浓度依赖性”，以氨基糖苷类(疗效与峰浓度有关)和氟喹诺酮(疗效与AUC/MIC有关)为代表，这类抗菌药物可以一天一次给药。
选择合适的抗生素，还应该充分了解各种抗菌药物的作用机制、抗菌谱、适应证、禁忌证、常见副作用和常用治疗剂量等知识。
对于严重感染，如心内膜炎和脑膜炎，常常需要选择杀菌剂。根据抗菌药物作用机制，直接作用于细菌的细胞壁(β-内酰胺类)、细胞膜(达托霉素)和DNA(氟喹诺酮)的抗菌药物，能够直接造成细菌死亡，称为杀菌剂。而抑制蛋白质合成的称为抑菌剂(磺胺、四环素、大环内酯)。但是，这种区分不是绝对的，对某些细菌是杀菌剂的抗菌药物，对另外一些细菌可能为抑菌剂。
抗菌药物常见的不良反应包括直接作用和间接作用两种。直接作用:①药物过敏:表现为IgE介导的过敏性休克，以及皮疹、药物热。研究表明:抗菌药物相关不良反应占急诊就诊的药物不良反应的19%，其中过敏反应占抗菌药物不良反应的79%［10］。②肝、肾、血液、耳、神经毒性反应:这种不良反应常常出现在过量使用和长时间使用抗菌药物的时候。因此，对于治疗剂量和中毒剂量接近的抗菌药物(如万古霉素、多黏菌素)，常常需要监测血药浓度。并根据机体肝肾功能状况，适当调整剂量，减少毒性作用。③药物相互作用:这种情况常常出现在不同抗菌药物竞争同一种代谢途径，如利福平是细胞色素P450酶系统的诱导剂，而大环内酯和唑类抗真菌药是P450的抑制剂。抗菌药物联合治疗(万古霉素、氨基糖苷类)可以引起严重肾毒性。间接作用:干扰正常菌群，导致二重感染(难辨梭菌肠炎)和耐药菌感染。
临床医师应该认识到:了解了抗菌药物的特性和副作用还不够，还需要充分考虑宿主因素，在抗菌药物治疗方面做到个体化。①肝肾功能状况:常常需要根据肝肾功能受损状况减少抗菌药物剂量，但是当与酶诱导剂如利福平联用时，需要增加药物剂量;②年龄:儿童抗菌药物需要根据公斤体重调整剂量，老年人血清肌酐水平并不能直接反映肾功能状态，需要适当减少剂量;③遗传因素:细胞色素P450受遗传基因影响，但是应用于临床还需要大量临床数据的支持;④妊娠和哺乳:相对安全的药物包括青霉素、头孢菌素、大环内酯，而氟喹诺酮、氨基糖苷毒性大，应该避免使用;⑤宿主既往抗菌药物过敏史和最近90天抗菌药物使用史。如果有，应该避免使用该种药物。
4.常见的不合理使用抗菌药物的情况［11］
( 1)没有明确感染性疾病证据，长时间经验性使用抗菌药物。当诊断不明确时，不要盲目升级换代抗菌治疗，要仔细询问病史和查体，仔细鉴别。要记住:很多非感染性疾病，包括自身免疫病、恶性肿瘤，可能具有与感染性疾病类似的症状。
( 2)没有感染临床表现，针对阳性细菌培养结果使用抗菌药物。记住:抗感染治疗的目标是感染性疾病，不是细菌。如果没有相应感染临床表现，阳性细菌培养结果往往代表定植，不需要治疗。
( 3)当有体外药敏结果时，不及时降阶梯。经验性抗感染治疗有效，应该根据阳性药敏结果及时更换窄谱抗菌药物。这样既减少二重感染机会，也降低了抗菌药物花费。
( 4)长时间预防使用抗菌药物。这种情况常常见于手术后，用于预防感染性疾病的发生。
( 5)过度依赖一种或少数几种抗菌药物。过度依赖某几种抗菌药物容易导致细菌耐药发生。
需要注意的是，对于感染性疾病，虽然抗感染治疗是重要的，但是并非所有情况都是最重要的治疗手段。例如以下几种情况:①对于肝脓肿、腹盆腔脓肿等感染，外科清创、引流常常比抗感染药物更加重要。②免疫调节治疗:细菌性脑膜炎［12］、结核性脑膜炎［13］以及HIV相关肺孢子菌病，糖皮质激素辅助治疗能减少过度炎症反应;器官移植患者术后发生严重感染，常常需要权衡利弊，暂时减少免疫抑制剂的用量;放、化疗发生严重粒细胞缺乏，集落刺激因子( G-CSF、GM-CSF)通过升高白细胞增强机体抗感染能力;在严重感染时，补充免疫球蛋白可能有辅助治疗价值［14］。
总之，合理使用抗菌药物，鉴别诊断和病原学诊断是“精髓”，治疗“感染菌”，而非“定植菌”，抗菌药物只能用在有细菌感染的患者身上，其他情况下使用抗菌药物则“弊大于利”:抗菌药物不能替代洗手;抗菌药物不能替代无菌操作;抗菌药物不能替代引流和清创;抗菌药物不能作为“鉴别诊断”的工具。
(曹彬)
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