第二章　肝癌微环境

第一节　肝癌微环境的理化性质

肝癌微环境(microenvironment)是由肝癌细胞及其周围环境所组成的高度异质性且随着肝癌发展而不断进化的微小生态系统,主要由肝癌细胞、肝癌相关成纤维细胞、免疫细胞、内皮细胞、细胞外基质蛋白、多种生长因子、蛋白水解酶、炎症因子及其特殊的理化特征(如低氧、低pH)等共同组成。 本节将详细介绍肝癌微环境的理化性质及其在肝癌发生发展过程中所发挥的作用。

一、缺氧微环境

缺氧是肝癌微环境代表性的理化特征之一,不仅可以改变肝癌细胞的生物学特性,同时也是引起肝癌预后不良的主要因素。 缺氧诱导因子-α(HIF-α)作为缺氧环境下的关键调控分子之一,可以调控众多与肝癌发生发展密切相关的靶基因的表达,进而影响肝癌进展的多个环节,包括增殖、存活、侵袭、转移、血管生成、新陈代谢等。 因此,研究肝癌中缺氧微环境的形成原因及其所发挥的作用,对于更深入认识肝癌发生发展的分子机制至关重要。

(一)肝癌微环境中缺氧形成的原因及结局

正常情况下,组织内的氧供可以满足细胞代谢的需要,大多数组织的生理氧浓度为4%～8%。 在肿瘤组织中,肿瘤细胞过度生长消耗了大量的氧气和营养,再加上肿瘤组织自身脉管系统功能及结构上的异常,使得肿瘤内部血流减少,肿瘤的氧供明显少于氧的需求,最终导致了缺氧微环境的形成。 缺氧环境下,肿瘤细胞可以产生一系列适应性改变,而这一适应性过程直接受到缺氧诱导因子(hypoxiainducible factors,HIFs)的调控。

目前研究发现,HIFs 包括HIF-1、HIF-2 及HIF-3 三种亚型,属于PAS[per-arylhydrocarbon receptor nuclear translocator(ARNT)-Sim]家族的bHLH(basic helix-loop-helix)转录因子。 HIFs 是由氧调节的α亚基和稳定表达的β 亚基组成的异源二聚体,HIF-1、HIF-2 及HIF-3 这三种亚型它们含有相同的HIF-1β 亚基。 HIF-1β 属于结构性亚基,又称芳香烃受体核转运体(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator,ARNT),其表达不受氧浓度变化的调节。HIF-α 是HIF 的功能性亚基,包括HIF-1α、HIF-2α及HIF-3α,它们含有共同的氧依赖降解区(oxygendependent degradation domain,ODDD),其生物活性受到氧浓度的调控。 HIF-1α 广泛表达于全身组织中,常氧条件下主要位于胞浆中,缺氧条件下被转运到细胞核行使功能;HIF-2α 蛋白主要分布于心肌细胞、上皮细胞、肝细胞、胰腺细胞、肾成纤维细胞及神经胶质细胞中,在常氧或缺氧条件下,HIF-2α 都表达于细胞核内;HIF-3α 蛋白在人体的心脏以及肺组织中表达较高,目前对于HIF-3α 的研究还不明确,有报道称HIF-3α 极有可能是一种选择性的剪切体,并作为HIF-1α 和HIF-2α 的负向调控分子发挥作用。

HIFs 的活性主要是由HIF-α 亚基所决定的,HIF-α 的活性受到氧浓度变化的精细调节。 常氧条件下,位于HIF-α 羧基端的第803 位天冬酰胺被天冬酰胺羟化酶(抑制HIF 的因子,称为FIH)所羟化,导致HIF 不能与转录共激活因子p300/CBP 相互作用。 而脯胺酰羟化酶(prolyl hydroxylases,PHDS)可以使HIF-α 氧依赖降解功能域的第564 位和第402 位的脯氨酸发生羟化反应,随即HIF-α 被pVHL 肿瘤抑制蛋白所识别,然后与cullin2、转录延伸因子B/C 以及RBX1 形成蛋白复合体,该复合体具有E3 泛素化酶的活性,最终HIF-α 泛素化被蛋白酶体降解。 相反,缺氧条件下,HIF-α 可逃避特异性羟化酶的修饰,并进入细胞核与HIF-1β 形成异源二聚体,结合到相应靶基因启动子区的缺氧反应元件(hypoxia-responsive elements,HREs)(5’ RCGTG 3’)上,与其他转录相关分子相互作用共同调控靶基因的表达。 这些靶基因所编码的蛋白参与调控细胞生命活动的多个环节,包括细胞的黏附与迁移、侵袭与转移、增殖与存活、血管生成、无氧糖酵解、红细胞的生成、pH 的调节等(图2-1-1)。

(二)HIF-α 在肝癌发生发展中的作用

HIFs 在肝癌发生发展的多个环节中都发挥关键作用,包括增殖与生长、细胞干性的维持、糖酵解途径的调节、血管新生、上皮向间质的转化以及侵袭转移的调节。 下面我们详细阐述HIF 重要的靶基因在肝癌发生发展中的作用。

1.在肝癌生长增殖中的作用

肝癌细胞与正常肝细胞的区别在于肝癌细胞的增殖速率加快而细胞死亡率降低,造成这种差别的原因在于分泌型细胞生长因子的表达增加。 通常,细胞自身可以表达这些细胞因子的同源膜受体,导致自分泌信号通路的激活。 在这些分泌型细胞生长因子中,有很多都是由HIF 的靶基因所编码的,包括转化生长因子-α(TGF-α)、胰岛素样生长因子-2(IGF-2)、血管内皮生长因子(VEGF)、内皮素1(EDN1)以及红细胞生成素(EPO)等。

2.在肝癌代谢过程中的作用

HIF-1 可以诱导多种葡萄糖转运体蛋白(GLUT1、GLUT3)以及糖酵解酶(ALDOA、ENO1、GAPDH、HK1、HK2、PFKL、PGK1、PKM2、LDHA)的表达。 同样,丙酮酸脱氢酶激酶(PDK1)的表达也受到HIF-1 的调控,PDK1 可以使三羧酸循环中的关键酶丙酮酸脱氢酶磷酸化而使其失活,最终抑制线粒体的氧化代谢。 此外,HIF-1 通过活化线粒体自噬相关分子BNIP3 和BNIP3L,从而阻断有氧代谢。

3.在肝癌血管新生中的作用

HIF-1 可以调节多种与血管新生相关的分子,包括血管内皮生长因子(VEGF)、基质来源因子(SDF1)、胎盘生长因子(PGF)、血小板源性生长因子(PDGFB)以及血管生成素(ANGPT),通过这些血管新生相关的分子的调节,HIF-1 可实现对肿瘤血管新生的调控。

4.在上皮向间质转化过程中的作用

HIF-1 可以活化上皮抑制分子(ID2、SNAI1、SNAI2、TCF3、ZEB1、ZEB2)的表达,这些分子可以直接抑制E-钙黏蛋白以及其他促进细胞黏附和上皮细胞表型的关键蛋白的表达。 HIF-1 还能通过上调TGF-α 和VIM来促进间质表型的产生。

5.在肝癌侵袭转移中的作用

HIF-1 可以活化与细胞外基质降解和重塑相关的靶基因的表达,从而促进肝癌细胞向远端的转移,这些靶基因编码的蛋白主要包括与基质降解相关的酶,如CTSC、MMP2、MMP9、MMP14 和PLAUR 等,以及与基质重塑相关的酶,如LOX、LOXL2 和LOXL4 等。 在肝癌细胞血管浸润的过程中,关键分子VEGF 和ANGPT2 同样受到HIF-1 的调控。 此外,HIF-1 还可以通过调节细胞表面蛋白L1CAM 和分泌型蛋白ANGPTL4 的表达,从而促进肝癌细胞向远端肺组织的转移。

总之,缺氧作为肝癌微环境重要的理化性质,在肝癌的恶性转化过程中发挥重要作用。 深入探索缺氧微环境在肝癌发生发展中的作用机制,有利于揭示肝癌生长和演进的分子机制,为肝癌的临床治疗提供新的靶向策略。

二、酸性微环境

八十多年前,Warburg 研究发现,即使在O2 充足的情况下,肿瘤细胞仍普遍采用糖酵解代谢途径获取所需营养物质和能量,即温伯格效应(Warburg effect)。 肿瘤细胞恶性增殖,需要极高的呼吸速率为其快速生长供能。 虽然从能量效率的角度出发,有氧呼吸是一个最佳的选择,但从肿瘤细胞本身特点而言,糖酵解代谢更能满足其需求。 肿瘤细胞线粒体异常,O2 依赖性线粒体反应受阻。 肿瘤组织内部血管结构高度紊乱并发育不全、血流断续不定,导致肿瘤缺氧。 低氧肿瘤区域氧化磷酸化受限,为满足能量物质供应,缺氧状态促进肿瘤细胞缺氧诱导因子(HIF)稳定性增加,使糖酵解代谢相关酶、葡萄糖转运蛋白及乳酸脱氢酶亚型LDH-A 和LDH-5 等表达上调,肿瘤细胞摄取糖的能力及代谢速率提高,促进了丙酮酸转化为乳酸(图2-1-2)。 同时,HIF还可以通过上调丙酮酸脱氢酶激酶-1,阻止丙酮酸进入三羧酸循环。 不仅如此,糖酵解代谢途径产生的多种中间代谢产物可用于生物合成反应,对缺氧和有氧条件下肿瘤细胞的增殖均能发挥重要作用。 所以,肿瘤细胞选择了低效能的糖酵解途径代谢。

肿瘤酸性微环境一方面扼杀微环境中正常细胞并促使肿瘤细胞不断适应细胞外低pH 环境,筛选出恶性程度更高的肿瘤细胞,促进肿瘤的抗放化疗、存活、转移等;另一方面,不断改造微环境中的非肿瘤细胞成分,促进肿瘤组织血管新生、细胞外基质降解、间质细胞驯化,导致肿瘤恶性发展。 同时,肿瘤酸性微环境可通过调节蛋白水解酶类活性(如金属基质蛋白酶、组织蛋白酶等)影响细胞外基质(ECM)降解,调控肿瘤细胞转移等生物学过程。 正常情况下,这些蛋白水解酶的表达及活性受到严格的调控,但在肿瘤酸性微环境下,低pH 则可诱导蛋白水解酶活化,水解如蛋白聚糖、明胶、Ⅳ型胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白及巢蛋白(nestin)等多种细胞外基质成分,促进肿瘤转移。 此外,酸性微环境对间质细胞如免疫相关细胞等(淋巴细胞、巨噬细胞、浆细胞)的作用开始受到广泛关注。 肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophage,TAM)是肿瘤免疫微环境中最丰富的免疫细胞,在炎性介质反应与肿瘤之间发挥重要的桥梁作用,与血管形成、肿瘤细胞转移、免疫抑制等过程密切相关。 研究表明,低pH环境可以显著抑制巨噬细胞引起的免疫反应。 人和小鼠的肿瘤特异性CD8+ T 细胞的免疫活性在pH6.0～6.5 的酸性条件下可被抑制,表现为细胞毒性活性、细胞因子的分泌、IL-2Rα(CD25)及T 细胞受体表达、STAT5 的活化以及ERK 等激酶的表达等都降低。

由此可见,肿瘤酸性微环境不仅改造了微环境的正常生理功能,同时也促进了实体瘤细胞的侵袭和转移,并诱导其拥有化疗抗性和免疫治疗抗性。将传统的癌症治疗药物与靶向酸性微环境关键调节分子相结合,无疑将为癌症治疗带来新的希望。 如使用NHE 抑制剂5-(N,N-二甲基)氨氯吡脒处理转染E7 癌基因的成纤维细胞,可抑制细胞内pH碱化及成瘤能力。 也有学者提出,假设恢复碱性pHe(extracellular pH),可降低肿瘤细胞的生存优势,并影响肿瘤细胞的侵袭及恶性转化。 因此,深入阐明肿瘤细胞pHi(intracellular pH)调节机制,从整体理解pH 稳态,将有助于探索安全而有效的抗癌疗法。