第三章　骨及软骨组织工程和软组织生理及修复　Bone and Cartilage Tissue Engineering ＆ Soft Tissue Physiology and Repair

华中科技大学同济医学院附属协和医院　郑启新

第一节　骨组织工程学　Bone Engineering

由于创伤、疾病或者其他因素等所致的组织、器官(包括骨、软骨)缺损或者功能丧失严重影响人体生活质量甚至威胁生命。目前多用自体、异体或者异种组织或者器官移植来治疗，也有用人工组织或者器官，但是这些组织或者器官存在来源有限、免疫排斥反应或者无生物活性等缺点。为了解决人体组织、器官缺损修复的难题，医学及材料学领域的专家进行了不断地探索。1987年美国材料专家Langer和Vacanti提出了“组织工程学”的概念，即在一种有良好生物活性的支架材料上种植人体活细胞，在生长因子作用下生长成为有生物活性的组织或者器官。组织工程的概念是应用生命科学和工程学的原理和技术，构建一个有生物活性的组织，植入人体内修复组织缺损，重建组织或者器官的功能;或者作为体外装置，暂时替代器官功能，以提供生存质量。组织工程学理论是“复制”组织或器官，解决组织和器官缺损的难题，是一场有意义的医学革命。它研究的主要内容包括:种子细胞、支架材料和细胞生长因子(图3-1-1)。

支架材料

组织工程支架材料是指能与组织活体细胞结合，为细胞提供生长空间并能植入生物体的材料，它是组织工程的最基本框架。组织工程支架材料必须具备良好细胞相容性(即能与细胞直接结合)和组织相容性(即与植入生物体结合)，同时，它还必须具备足够的力学性能(强度、弹性等)、适当的结构(三维空间结构，如海绵状或纤维网状，其孔隙率和孔径合适)和生物稳定性(对非降解材料要求植入后保持稳定的结构和组织结合能力，对可降解材料则要求其降解产物无局部或全身毒副作用)。因此，组织工程支架材料在使用前必须经过严格的理化性能和生物相容性检测。

目前骨组织工程支架材料主要包括:高分子材料、无机材料、天然生物材料和复合材料。

(一)高分子材料

1.聚乳酸(PLA)

由丙交酯开环聚合而成。植入体内后能逐渐降解生成乳酸，参与机体代谢，最终生成H2O和CO2而排出体外。PLA有L-聚乳酸、D-聚乳酸和DL-聚乳酸三种异构体，三者的理化性能有差别。

2.聚羟基醋酸(PGA)

由乙交酯开环聚合而成，降解速度比PLA快，降解后生成羟基醋酸，也参与机体代谢。

3.PLA和PGA共聚物

为了改变单一聚合物的降解速度和机械性能，常将PLA和PGA复合成共聚物，改变材料的分子量及组成成分，以调节其理化性能。PLA/PGA共聚物是目前临床上应用广泛的可降解植入材料之一。由这种材料制成的海绵状支架具有良好的三维空间结构，为骨细胞提供适宜的生存空间，同时可提供所需的形态，构建组织工程骨。

(二)无机材料

无机材料主要包括陶瓷、玻璃、碳纤维及复合材料。其中应用最广泛的是陶瓷材料。陶瓷材料分为:生物惰性陶瓷(乳氧化铝陶瓷)、生物活性陶瓷(羟基磷灰石陶瓷)、生物降解陶瓷(β-磷酸三钙)。

1.生物惰性陶瓷在材料结构上稳定，具有较高力学性能，植入机体后缺乏生物活性，与机体组织内有一层结缔组织相隔，结合性差。

2.生物活性陶瓷中含有钙、磷等元素或羟基等基团，植入骨组织后，其表面与组织接触能通过代谢或元素置换与机体骨组织达到键合，X线衍射显示材料中的化学性羟基磷灰石与骨组织中生物性羟基磷灰石结合。材料与骨组织间无其他组织。

3.生物降解陶瓷主要为磷酸三钙，植入机体内后可通过体液的溶解和巨噬细胞降解的机制被逐渐吸收而被替代。

生物陶瓷具有良好的生物相容性和较高强度，可制成多孔海绵状结构，与人体骨结构相似，在骨组织工程中应用广泛。

(三)天然生物材料

1.同种或异种骨

经过冻干、脱钙、煅烧、脱蛋白等处理后，同种或异种骨(主要是松质骨)保持原有三维孔状结构，可作为骨组织工程支架材料(图3-1-2)。

2.胶原

是一种蛋白质，广泛存在于人和脊椎动物的结缔组织中。提取的异种胶原具有良好生物相容性和降解性。降解产物无明显的毒副作用。胶原可制成膜状或海绵状材料作为支架材料。

3.甲壳素和壳聚糖

来源于动物的天然多糖。可制成纤维状、膜状或海绵状，可完全水解。

(四)复合材料

复合材料是由两种或者以上不同材料优化组合而制成的支架材料，充分发挥各类材料的优点。常用的材料有:

1.陶瓷材料与聚合物的复合 如PLA与HA或TCP的复合，这样当PLA降解时，HA或TCP可以缓解植入局部的酸性环境，同时复合材料中降解的钙和磷可参与新骨形成。

2.PLA和PGA的复合 这种复合材料可调控降解速度和力学性能。

支架材料的组织相容性和表面活性

与细胞的直接结合是支架材料的最基本特征，材料必须为细胞的附着和生长提供良好的生物界面，而目前常用的支架材料所提供的生物界面尚不能令人满意。因此，对材料表面进行改性是组织工程研究的主要领域之一。常用的表面改性方法有表面修饰法、化学改性法、杂化改性法、等离子体喷壁法等(图3-1-3)，其中表面修饰备受关注，它是通过在材料表面固定一些细胞因子或者改变材料表面的局部结构而提高材料的细胞相容性(图3-1-4)。

(一)在生物材料表面固定蛋白质进行表面修饰

在材料表面固定蛋白质最简单的方法是物理吸附，其吸附力依靠离子键、疏水作用或范得华力。一种比较可靠但较复杂的方法是通过化学键共价固定蛋白质。这种共价固定方法通常是以双功能交联剂(如硅烷、氧化硅基连接剂)为中介，交联剂的一端通过硅烷醇键连接在金属或玻璃表面，另一端有一可变的悬吊基团结合蛋白质。有些学者利用具有高度亲和力的配体，通过受体-配体反应固定蛋白质，如:植物血清素、抗生物素蛋白、蛋白G、蛋白A。通过配体固定蛋白质类似于共价键固定。

到目前为止，蛋白质的固定方式主要集中在二维模型。光阻技术、光化学技术、自聚集形成单层有机膜技术等蛋白质固定方法已得到广泛应用。

1.光阻技术

光阻技术以硅烷为偶联剂，将蛋白质固定在二氧化硅或金属表面。首先在底物表面离心铸造一层光致抗蚀剂，再覆盖一层掩膜，紫外线辐射使光致抗蚀剂分解，暴露底物的特定区域。氨基硅烷(促进黏附)可与这些已暴露的区域结合。然后用丙酮对作底物进行声处理，除去剩余的光致抗蚀剂，暴露底物的剩余区域，可以与甲基或烷基硅烷(疏水性或抑制黏附)结合。由于硅烷末端悬吊基团的不同，与不同的蛋白质结合产生异源性单层界面或蛋白质的特定结合区域。这种方法可以减少蛋白质的非特异性吸附;但残余溶剂和光致抗蚀剂可以使蛋白质变性，降低蛋白质的活性。

2.光化学技术

该技术固定蛋白质是利用化学不稳定性物质，在紫外光辐射时被激活，可结合目标分子的特性。通过光化学技术固定蛋白质有以下四种方式:

(1)将结合有光化学物质的底物在蛋白质溶液中孵育，紫外光辐射，被激活的光化学物质与溶液中的蛋白质结合。

(2)底物先与光化学物质孵育，然后用紫外光辐射，激活光化学物质，其一端与底物结合，另一端的悬吊基团与蛋白质结合。

(3)将带有“笼子基团”的底物用紫外光照射，除去“笼子基团”，暴露底物的活性区域，结合蛋白质。

(4)将底物与含有几种光化学物质的交联聚合物以及蛋白质溶液共同孵育，紫外光照射，被激活的聚合物能结合底物和蛋白质，将蛋白质固定在底物表面。光化学技术与传统的蚀刻技术相比，它所用的溶液、缓冲液及反应试剂对蛋白质的活性影响较小;而且，在同一底物表面，这些化学物质可被重复利用固定多种蛋白质。

3.自聚集形成单层有机膜技术(SAM)

当烷基硅烷或链烷巯基分子在二氧化硅或金属表面时，它们能自聚集形成单层有机膜。分子链的一个端基与底物表面结合，另一个端基呈游离状态。反应端基的变化和单层有机膜的连接反应或表面能也发生变化，从而在表面制成混合性有机单层，蛋白质可以固定在亲水性或促进黏附的单层有机膜上。

随着蛋白质固定技术的发展，蛋白质定位和蛋白模型技术正受到大家的关注。这两个方面的发展也促进了免疫诊断学和生物传感技术的进步。作为蛋白质固定学科新的分支，纳米模型和三维蛋白固定技术已成为广大学者研究的主题。

(二)在生物材料表面固定氨基酸及其衍生物进行表面修饰

对于有些细胞，材料表面固定氨基酸单分子聚合物，如聚赖氨酸和聚鸟氨酸，可以增强细胞的黏附性。在材料表面固定的氨基(模拟肝素结合肽的活性)，可以与细胞膜表面的蛋白多糖结合，促进细胞的黏附。多聚鸟氨酸和三鸟氨酸含有丰富的带电基团，将其固定在材料表面，增加材料的表面电荷浓度，提高细胞的黏附力。另有研究表明，将带正电荷的赖氨酸和精氨酸残基固定在材料表面，在热灭活牛血清白蛋白存在条件下能增强人包皮成纤维细胞的黏附能力。总之，通过固定氨基酸可以提高材料的表面电荷浓度，增加黏附细胞的数量和增强细胞的黏附力。

(三)在生物材料表面固定多肽进行表面修饰

组织工程中将多肽固定在生物材料表面，制成受体专门性材料，可促进受体介导的细胞对材料的黏附来提高其生物相容性，促进细胞黏附、扩展。多肽固定在材料表面通过两种方式:共价键和非共价作用。共价键的形成一般包括材料表面的反应部分和氨基酸侧链或氨基、羧基末端。各种不同的技术已经被用来将多肽共价固定在材料表面。如:将多肽GRGDY共价固定在聚(乳酸-共-赖氨酸)表面，可以促进牛动脉内皮细胞扩展。一些物质，如白蛋白，本身没有黏附活性，但容易吸附在材料表面，而多肽又容易和白蛋白共价结合;所以将多肽-白蛋白复合物吸附在材料表面，对材料进行表面改性。还有学者将疏水性氨基酸结合到多肽末端，然后再吸附到材料表面。羟基磷灰石是一种植入材料，它本身不支持细胞附着，但羟基磷灰石的钙可以与Asp或Glu的羧基结合。Fujisawa等人根据这一特性设计了富含酸性氨基酸Glu的仿生肽Glu7-Pro-Arg-Gly-Asp-Thr，将其吸附在羟基磷灰石表面，改变它的生物相容性，实验证明可以促进成骨细胞的附着与扩展。

Robin A等学者将PLA熔化，制成PLA膜。通过固相化学法合成保护性GRGDS肽，以1-乙烯-3-(3-二胺丙基)碳化二亚胺(EDC)和1-eq N-羟琥珀酰亚胺(NHS)作为偶联剂，聚赖氨酸(PLL)与保护性GRGDS肽结合。除去PLL-GRGDS的Boc末端基团及侧链上的保护性基团。PLL-GRGDS可结合到PLA表面。异双官能反应物Sulfo-LC-SPDP的N-羟琥珀酰亚胺基团和胶原单体的胺基反应生成稳定的酰胺键，它的2-吡啶基二硫化物基团和GRGDSPC肽的半胱氨酸残基的硫氢基反应形成二硫键。所以，以Sulfo-LC-SPDP为中介可以将GRGDSPC肽固定在胶原表面。在硅烷的无水己烷溶液中，硅烷与二氧化硅共价结合，异双官能交联剂N-琥珀酰亚胺-3-马来酰亚胺丙酸(SMP)的一端与硅烷结合，另一端的马来酰亚胺基团与半胱氨酸残基的硫氢基共价结合，这样含RGD序列和半胱氨酸残基的细胞黏附肽就共价固定在二氧化硅底物表面。

在材料表面固定多肽可以增强它的生物相容性，促进种子细胞附着、扩展、细胞骨架的组织以及局灶黏附的形成。通过固定RGD肽进行表面修饰的材料能显著增加细胞运动的持续时间。G.Maheshwari等人将YGRGD肽固定在无黏附活性的材料上，制成具有不同的表面配体浓度及不同的簇状空间分布特征，观察NR6成纤维细胞的黏附、移动情况，结果发现NR6成纤维细胞的移动速率依赖于配体空间分布。在相同的表面配体浓度时，簇状固定的YGRGD肽更能提高NR6成纤维细胞的移动速率;而非簇状固定的YGRGD肽即使在最高的表面配体浓度时，也几乎不支持NR6成纤维细胞的移动。而且，固定的RGD肽能与细胞膜表面的受体-整合素特异性结合;整合素是一种跨膜蛋白，由α亚单位和β亚单位构成的异二聚体，激活后可以调节跨膜信号以及胞浆内信号的传导。但是，将多肽固定在材料表面可由于空间阻碍而降低肽的活性。添加氨基酸残基或其他基团，或将多肽固定材料上也会改变肽原来的功能，表现为肽活性的降低，所以在固定多肽时应注意添加基团的溶解度、复合物的二级结构、三级结构改变以及空间阻碍效应。

种子细胞

在组织工程研究中，种子细胞决定组织工程化材料的性质，掌握种子细胞的分离、培养、生长调控技术和建立标准种子细胞系，了解培养细胞的形态、功能、培植是十分重要的。目前骨种子细胞的来源主要有骨、骨膜、骨髓、骨外组织和早期胚胎，其中多为骨膜来源的成骨细胞和骨髓间充质干细胞。

骨膜来源的成骨细胞用两种培养方法获得:一是酶消化法，即将骨膜剪碎，加入0.25%胰蛋白酶消化30分钟，0.1%胶原酶适度消化，然后收集细胞培养;二是组织块培养法，即将骨膜剪碎成约1mm× 1mm×1mm大小块状，放入培养瓶内，加入培养液和血清，在37℃、5%CO2环境中培养，待成骨细胞从骨膜边缘长满后去除组织块，用胰蛋白酶消化再传代培养。

骨髓间充质干细胞(MSC)的培养是通过穿刺或者冲洗骨髓腔获得骨髓，通过加入分离液和离心获得细胞悬液，然后逐渐随换液去除悬浮生长的造血细胞而得到骨髓间充质干细胞。在培养液中分别加入维生素C、β甘油磷酸钠、地塞米松和1，25-(OH)2维生素D可以诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化。

骨髓间充质干细胞因其具有干细胞的特征，在体外培养中具有较强的增殖能力和多向分化潜能，且自身取材容易，因此在骨组织工程中具有广阔的应用前景。目前研究主要集中在对MSC的分离纯化、大规模培养和调控方面。

(一)MSC分离培养的细胞免疫学基础

相差显微镜观察发现体外培养MSC团与成纤维细胞类似，进一步研究其细胞周期发现所培养的MSC中约10%处于S期、G2期和M期，其余90%则处于G0期、G1期。尽管到目前为止还不能确定细胞周期中每一期的检测点和长短，但G0/G1期占整个细胞群的比例达90%则说明了MSC的高分化潜能。传代培养时，MSC表现出了高度的扩增能力，且仍保持着细胞的染色体核型和端粒活性。

许多实验室研究表明MSC能表达多种表面抗原。1991年，Simmon等发现鼠IgM单克隆抗体STRO-1不与CFU-GM、BFU-E、CFU-Mix等造血定型祖细胞作用;骨髓单核细胞中形成CFU-F的均为STRO-1+细胞;长期体外培养发现STRO-1+细胞具有多分化潜能，并对体外培养的造血细胞起支持作用。1992年，Haynesworth等用人骨髓基质细胞免疫小鼠筛选出3个杂交瘤系SH2、SH3、SH4，其产生的抗体识别人MSC，但不与骨髓造血系细胞、骨髓基质成纤维细胞反应，也不与成骨细胞和骨细胞反应。1999年Pittenger等用流式细胞仪对培养的人MSC进行鉴定，发现培养至14天的MSC仍为SH2、SH3阳性，而CD14、CD34、CD45等造血系标志检测为阴性。1997年，Joyner等用单克隆抗体Hop-26选择骨髓单核细胞，发现Hop-26可与0.59+/－0.27%的单核细胞结合，但不与造血系细胞、成骨细胞、脂肪细胞及纤维组织等作用，免疫检测发现Hop-26特异性地结合CFU-F。

其他的学者也相继发现抗Sca-1、麦胚凝集素、大豆凝集素、抗MAB1470，抗α-平滑肌肌动蛋白(时间依赖性)等可以和BMSC亲和。另外，MSC还可以表达细胞因子(IL-1α、IL-6、IL-7、IL-8、IL-11、IL-12、SCF、LIF、M-CSF等);细胞因子受体(IL-1R、IL-3R、IL-7R、G-CSFR、PDGFR等);黏附分子(整合素亚基　α3、α4、α5、β、整合素　αvβ3、αvβ5、ICAM-I、CD44等);细胞外基质(Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型胶原等)，但这些抗原或是具有间质细胞的抗原特征，或是具有上皮细胞、肌细胞的特征，无特异性。

早期的学者认为培养的MSC具有同质性，然而，随着研究的深入，越来越多的学者趋向于异质性的观点，认为培养的细胞由未定型间充质干细胞和定型间充质干细胞组成。在MSC培养过程中，如用5-FU抑制细胞生长，即可发现培养的细胞群中存在少量处于G0/G1期的静息细胞亚群。该群细胞体积小、呈非颗粒状(RS-1)，细胞RNA含量低，不与细胞周期特异性抗原Ki-67作用，形成克隆能力差，且高水平表达ODC抗酶基因。Colter等在培养中发现，除了成熟的骨髓基质细胞(mMSC)和RS-1以外，极低密度传代时，细胞群中可见到另外一群体积小、呈颗粒状的细胞。RS-2直径约7μm，核/浆比例高。在对数生长期，RS-2数量减少，RS-1数量增加，mMSC则迅速扩增。出现这种现象的一种可能是滞留期RS-1生成RS-2，对数生长期RS-2生成mMSC，对数生长期末RS-2再生成RS-1;另外一种可能是mMSC生成再循环干细胞(RS cells)。

最近Colter等又利用流式细胞仪对RS细胞和mMSC可能的多种表面抗原进行了研究，发现RS细胞可特异表达或部分表达VEGFR、TRK(C-14)、转铁蛋白受体、脂调素-2、CD-4、CD-107、CD-117等，而mMSC则特异表达或部分表达CD-10、CD-147、STRO-1、PDGFR、EGFR等。它们虽都可以表达脂调素-5、HLA-1、CD31、CD38、CD44、CD49e、CD59、CD81、CD90等抗原，但无特异性。实验中还发现RS细胞和mMSC均不表达CD1a、CD11B(Mac-1)、CD14、CD27、CD34、CD43、CD45和CD133等造血系细胞表面特异性抗原。

(二)MSC的分离

常用的分离MSC的方法有全骨髓法和离心法。全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，如造血系细胞、内皮细胞等，达到分离纯化干细胞的目的。离心法即根据骨髓中细胞成分比重不同，提取单核细胞进行贴壁培养。尽管Prockop观察认为造血系细胞在培养过程中不贴壁死亡或随换液弃去，2～3周可以消失，但Kitano在实验中发现，造血系细胞存在可达2个月之久。另外，由于CFU-F细胞在全骨髓中比例很低，约每10万个有核细胞中含有1个，单纯采用以上方法难以获得纯的MSC。

随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化。1994年，Vlasselaer等用流式细胞仪分离MSC，发现其出现在FSChigh-SSChigh部分，这部分细胞经Sca-1抗体和麦胚凝集素再次选择，经选择细胞出现在Sca-1+和麦胚凝集素高亲和部分，可分化为成骨细胞，表达碱性磷酸酶。但经分选的细胞成骨活性低。培养发现分选的细胞中大多数不贴壁，并在24小时内死亡，可能是分选过程中机械剪切力和高能激光造成了MSC的损伤，并影响了其生化特性。1999年，Encina等用抗STRO-1包被的免疫磁珠从人的骨髓基质中分离出间充质祖细胞，继续培养，其中98%的细胞分化为成骨细胞，表达碱性磷酸酶，产生骨钙素，矿化。最近，Oreffo用Hop-26选择分离人骨髓基质细胞，培养第8天发现CFU-F中61%～77%的细胞为Hop-26+，第11天见有大量的克隆形成，呈典型的成纤维细胞样，传代培养并未改变Hop-26+细胞的增殖能力，经地塞米松等诱导可表达成骨标记。

(三)MSC的二维培养

1.低氧张力下的培养

机体外部环境中的氧张力(约140mmHg)多显著高于哺乳动物组织中的氧张力，如人动脉血氧张力为95～100mmHg，骨髓中氧张力为27～49mmHg，相当于氧浓度的4%～7%。尽管机体内存在谷胱甘肽过氧化物酶，超氧化物歧化酶，过氧化氢酶等保护因素，但当机体内氧浓度异常增高时，细胞及组织功能不可避免地受到损害，因此，可以设想，在体外进行细胞培养时，如氧浓度低于20%，则会更有利于细胞功能的存留。

20世纪90年代初期Deren等在体外采用低氧张力培养牛骨膜细胞，不仅细胞增殖速度得到明显提高，而且细胞碱性磷酸酶的表达也大大增强。后来，Lennon等在体外培养鼠MSC时，将95%空气、5%CO2和5%O2、5%CO2、90%N2两种培养条件进行对比研究，发现实验组原代培养中MSC的贴壁率及存活力提高，克隆数明显高于对照组。相差显微镜观察发现实验组第一代培养中细胞克隆大，克隆数量多，且克隆数多少并未影响细胞增殖速度。另检测发现第一代培养中细胞碱性磷酸酶的表达增强，原代培养中的细胞则更趋向于成骨和成软骨。

2.极低密度传代培养

不同的实验室在进行MSC培养时细胞传代密度有所不同，尽管均可获得在外部形态上都成纺锤形的成纤维细胞块，且都具有多分化潜能，但是彼此间的扩增速度、扩增倍数以及所得细胞群的异质性均存在较大差异。大多数实验室认为高密度传代培养细胞生长缓慢，通常的解释是培养过程中细胞与细胞间的接触抑制，但是否由于培养的细胞在培养过程中分泌的某种物质导致这一结果，尚在进一步的探索之中。

Bruder等采用较低密度(5000/cm2)传代培养人MSC时，发现两周左右细胞集落融合，细胞数扩增3～5倍。有研究发现，极低密度(0.5～12/cm2)传代更有利于细胞增殖。在0.5～12/cm2范围内，尽管每100个细胞所形成的克隆数相同，但克隆的大小却截然不同。对比发现，1.5/cm2或3.0/cm2传代培养所形成的克隆大，10天左右细胞扩增2000倍，对数生长期12小时即扩增一倍;而6/cm2或12/ cm2传代培养所形成的克隆小，其中12/cm2传代10天仅扩增60倍左右，对数生长期倍增时间为24个小时。另外，实验中还发现，按1.5/cm2密度传代培养可持续传代50代，而按5000/cm2密度传代培养仅传代15代。

最近，Javazon等又对极低密度下人与鼠MSC的培养进行对比研究，结果表明:①后者对极低密度传代培养更敏感。同等密度(2/cm2)传代12天，前者细胞扩增2000倍，而后者细胞扩增达4000倍。②细胞扩增更迅速。③培养过程中须频繁更换培养液。④细胞扩增时形成融合。⑤成熟的骨髓基质细胞能产生RS细胞和单细胞源性克隆。认为两者差异的原因可能是:自鼠取得的骨髓样本中本身已含有较多的祖细胞;鼠MSC在培养过程中已发生转化。

(四)基因转染的MSC培养

对MSC进行细胞学研究，发现它是一种相对静止、更新率低的群体，外源基因导入后可以持续表达较长时间，一些学者试图通过对转染了筛选基因的MSC进行培养，从而达到纯化该细胞的目的。

Kitano等以反转录病毒为载体，携带LacZ和neo基因靶向体外培养的鼠MSC，经G418筛选后的细胞在原代培养中形成了大的成纤维细胞克隆，检测未发现造血系细胞的污染，细胞表达低水平的分化标记，但仍保持原始表型，保留着向脂肪细胞和成骨细胞分化的潜能。在实验中，Kitano还发现运用不同的包装细胞，所得的实验结果也不一样。分别用ψ-CRIP和ψ-CRE培养的上清液处理人MSC后，前者形成的克隆数为70.3个/1×107，其中8.3个为大克隆(＞700个细胞)，后者形成的克隆数仅为3.1个/1×107，且均为小克隆(＜20个细胞)。另外，基因转染原代培养过程中，第1、2、5天分别开始用G418进行筛选，结果表明第1、2天开始筛选所得的细胞形成的克隆大，第5天开始筛选所得的细胞分化潜能低下，且形态多变，认为细胞的筛选应在基因转染的早期进行。

(五)MSC的三维培养

二维培养技术已普遍应用，尽管逐步得到改善，但仍存在难以克服的缺陷。

1.贴壁的表面积有限，细胞产量低。

2.无菌操作过程烦琐，容易污染。

3.代谢产物逐渐积累，排除不及时易引起细胞生长不良甚至退化。

4.细胞离开了体内同细胞外基质共同构成的三维立体结构，生物学行为受到影响，容易变异。

因此，有人提出三维培养的设想。1998年，Qiu对鼠骨髓基质细胞进行三维培养，扫描电镜检测发现微载体cytodex-3表面大量细胞覆盖，并相互桥接在一起，组成了三维多细胞聚合物。聚合物中可见矿化结节，免疫组织化学染色可见碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原。Glowacki用胶原海绵作为载体进行三维灌注培养，减少了代谢产物的聚集，结果发现细胞外基质含量提高，所培养的细胞活性和功能均加强。但cytodex-3和胶原海绵均为实心载体，表面积比较小，细胞难以大规模扩增。

(六)存在问题与展望

MSC体外培养的研究已进行30余年，取得了很大的进展，但由于其本身的研究还不系统全面，仍处于探索阶段，有些问题亟待解决。

1.MSC培养过程中的异质性，影响了干细胞分离纯化的效果 如何有效地获得大量同质性的MSC，有待于对其细胞学特点和异质细胞群中各类细胞标志物的进一步研究。

2.对MSC在细胞工程和组织工程方面的利用研究，都希望得到大量的未分化干细胞成分 理论上讲，在体外设法诱导或用外源基因导入等技术，可使干细胞实行对称性有丝分裂，无限扩增而不分化，但其结果是细胞形态和生理可能发生改变。

条件永生化基因的引入或许会克服这一困难。1998年，Hicok将SV40的变异型温敏基因tsA58导入MSC，形成了细胞的条件永生化，即在34℃环境下，细胞能持续增殖，分化受到抑制;在39.5℃环境下，细胞增殖减慢，出现分化，且在不同的诱导条件下，或表达成骨标记，或表达成脂标记。但是，长期培养发现这些细胞并不能保留其分化能力，可能是细胞永生化的逆转受到了抑制。如何避免扩增的干细胞朝多方向分化，仍有待于研究。

3.基因转染的MSC的培养为我们获取纯的干细胞提供了新的空间，但转染的外源基因是否会影响MSC的分化潜能，纯化后的MSC长期传代能力如何，目前尚存争议Kitano在实验中发现原代培养的细胞分化潜能下降、传代培养所形成的克隆数减少。而Oreffo在体外长期培养(＞9个月)基因转染的MSC，发现其仍具有良好的分化潜能，注入鼠皮下后，可在骨组织中检测到含有标记基因的MSC，并最终分化为成骨细胞。另外，如何提高基因转染效率也是一个需要进一步研究的问题。

生长因子

促进成骨的生长因子有很多，通常存在于骨基质中，参与骨的改建和修复。在骨组织工程研究中，这些生长因子可以与支架材料复合，在体外构建组织工程化骨(图3-1-5)，促进种子细胞增殖或植入骨缺损区内，修复骨缺损。

(一)骨形态发生蛋白(BMP)

BMP能诱导间充质细胞(或干细胞)分化成成骨细胞或软骨细胞。将BMP与磷酸三钙陶瓷人工骨复合后植入小鼠背部肌带4周时可有新骨在支架材料内形成。植入到兔桡骨骨缺损区后其修复效果明显优于对照组。

(二)转化生长因子β(TGF-β)

在骨和血小板中含有量最为丰富，可调节骨代谢、促进成骨细胞的增殖，但是其生物活性可能有种属特异性。

(三)成纤维细胞生长因子(FGF)

对成骨细胞具有促进增殖的作用，促进新骨形成。

(四)血小板源性生长因子(PDGF)

可促进成骨细胞的有丝分裂，同时对成骨细胞有较强的趋化作用。

(五)胰岛素样生长因子(IGF)

可刺激成骨细胞分裂，增加成骨细胞数量，同时可促进骺板的成骨作用。

(六)表皮生长因子(EGF)

可增加成骨细胞活性和膜内成骨过程。

组织工程化骨的构建及应用

组织工程化骨的构建有两种方法:一是将支架材料与成骨因子在体外复合培养后植入骨缺损区，通过成骨因子的信号的作用下植入区来源的成骨细胞形成新骨(即细胞因子型组织工程)，如将多孔材料TCP陶瓷与BMP复合后植入骨缺损区(图3-1-6)。另一种方法是通过体外下分离培养技术获得足够数量的成骨性种子细胞，与支架材料在体外复合后直接植入或者培养一段时间后再植入骨缺损区(即细胞型组织工程)。支架材料上也可以预先吸附生长因子(如BMP、TGF-β1等)。

作者的研究小组进行了组织工程化骨构建的系列研究:①将牛BMP与磷酸三钙陶瓷复合构建成复合材料植入家兔的桡骨骨缺损中，8周左右缺损修复，效果优于单独植入磷酸三钙;②将含锌煅烧骨、多孔TCP陶瓷、脱蛋白骨等与MSC体外复合培养72小时后植入裸鼠肌肉内，4周是发现植物内有新骨形成。取新鲜的小牛骨松质骨部分，锯成骨条，放入水中，煮沸，部分脱去骨中的有机质。将骨条植入氢氧化钠、过氧化氢溶液中浸泡以进一步去除有机质，置干燥箱中干燥。然后放入电炉中煅烧，缓慢升温至800℃，维持6小时。将煅烧后的骨条浸入焦磷酸钠溶液中，水浴，干燥，进行第二次煅烧，缓慢升温至1200℃，维持1小时。制备成经两次煅烧的牛松质骨。测定其主要成分为β-磷酸三钙，抗压强度和抗折强度分别为(3.84±0.40)MPa和(3.92±0.29)MPa，扫描电镜下材料微孔互相交通，孔径200～850μm。含锌煅烧牛松质骨是根据材料的率，将单纯煅烧骨100g浸于500ml 0.25mol/L的氯化锌溶液中，60℃水浴1小时，干燥后再经1200℃高温煅烧，制成含锌(0.4%wt)煅烧骨。取新西兰大白兔自双侧股骨大转子部穿刺抽取骨髓。加入基础培养基(DMEM，10%小牛血清)，放在培养箱中培养(5% CO2，37℃)。4天后全量换液，PBS漂洗，除去红细胞及未贴壁细胞。以后根据细胞生长情况及培养基颜色换液，大约3天换液1次，细胞长满瓶底后0.25%胰蛋白酶进行消化传代。继续用诱导培养基(基础培养基;β-甘油磷酸钠10mol/ml、L-维生素C 50μg/ml、地塞米松10～8mol/L)培养，使细胞向成骨细胞分化。细胞碱性磷酸酶染色ALP染色后，诱导培养组细胞胞浆内见大量黑色或褐色颗粒沉淀。钙化结节茜素红染色和四环素荧光染色:染色显示有较多的深红色矿化结节，散在分布，形态各异。反射荧光显微镜下，矿化结节呈强烈的金黄色荧光改变。复合培养1周扫描电镜观察，细胞均匀地分布在煅烧骨表面及孔洞内，与煅烧骨表面贴附紧密。4周时，新生骨沿煅烧骨表面排列，内部孔隙可见类骨基质沉积，成骨细胞较多，某些部位可见软骨样组织形成。8周时，见大量新骨形成，充满煅烧骨的孔隙，为板层骨，有成骨细胞和骨陷窝，周围有大量骨基质。

目前组织工程化骨已经初步应用于临床修复骨缺损。随着种子细胞的培养及调控、支架材料的研制、支架材料与种子细胞相互作用等问题的解决，组织工程化骨可能大规模用于临床。

组织工程化骨的血管化

骨是一种微血管网十分丰富的器官，因此构建组织工程化骨应具备良好的血管网，以给种子细胞传输营养物质和排出代谢产物，以便保持组织工程化骨的正常活性。组织工程化骨血管网的建立是一个复杂的过程，与支架材料、种子细胞和生长因子都密切相关。

组织工程的支架材料不仅是要起着细胞的黏附、增殖、分化的支架的作用，而且要有合适的三维结构，有利于营养物质和氧气的渗透交换，为新生血管长入提供通道，并可作为生长因子缓释剂的载体(图3-1-7)。

为有利于内皮细胞的黏附和新生血管的长入，骨组织工程的支架材料必须满足一定的要求，首先要有良好的生物相容性，包括表面相容性和结构相容性。Rubin等证明生物惰性但表面相容性和结构相容性差的聚乙烯材料，不论其形状大小、植入时间长短、是否应用促进血管形成的因子，在血管长入方面都明显比HA对照组要差。而且所用材料的性能和孔隙比具有促血管形成的生长因子bFGF对血管生长的影响更大。Pieper等在胶原材料中加入骨基质成分糖胺聚糖(硫酸乙酰肝素和硫酸软骨素)，在植入体内2、4周时可减少材料周围的异物反应和促进血管形成。其原因是生物材料良好的生物相容性和生物活性可以减少植入体内时的异物反应，而异物反应的炎性细胞的作用和形成的纤维包膜对血管的长入是不利的，同时糖胺聚糖等物质可能为血管的形成提供信号。

载体材料还要有合适的三维结构，一般现在对组织工程材料的要求是孔隙率90%以上，孔径100～500μm，孔隙交通，材料随新生组织长入逐步降解，降解速度和组织新生的速度匹配，这些都有利于血管的长入。Kuboki Y等研究表明多孔HA材料促进血管化和成骨细胞的黏附、增殖、分化的最佳孔径是300～400μm。在孔径90～120μm的HA中先诱导软骨形成然后再骨化，而大于350μm的HA中可以直接诱导骨组织形成。这个最佳孔径就是最适合血管长入的孔径范围。

在骨的生长和改建中有一个复杂的通讯网络起作用，其中包括有内皮细胞、成骨细胞、破骨细胞、巨噬细胞、基质细胞等，通过这个网络传导全身系统信号和局部信号对生理变化起反应。骨的微血管在这个过程中起中枢的作用，调节骨的细胞的生理反应。

在组织工程化骨的构建中，血管内皮细胞和成骨细胞的联合培养优于成骨细胞的单独培养。实验证明成骨细胞和内皮细胞间共同培养时，在细胞的调控和功能上相互促进，这是因为细胞有旁分泌作用。Villars等把成骨前体细胞(人骨髓基质细胞: HBMSE)单独培养或者和内皮细胞(人脐静脉细胞: HUVEC)按不同的方式混合培养(直接或非直接接触)，实验表明，HBMSC合成和表达VEGF，对HUVEC培养起促进作用，并且当HBMSC和HUVEC直接接触培养时ALP的活性提高，这表明两种细胞间不仅存在分泌的细胞因子的相互作用，还涉及细胞膜蛋白的细胞间通讯的直接作用。

新生血管需要内皮细胞生长，内皮细胞可取自血管的内皮，也可以由骨髓基质细胞分化而来。Hattori等在鼠的骨髓基质中培养出内皮细胞，用RT-PCR方法验证了存在VEGF的受体VEGFR-1，2，Tie-1，2和von Willebrand factor(冯·威利布兰德因子，VWF)，并且转导入ts-SV40 T-antigen基因形成了永生化内皮细胞系。

骨髓基质细胞含有数种前体细胞，能分化成内皮细胞，并且能分泌促血管生长因子，如VEGF、bFGF，在大鼠的角膜模型中植入骨髓基质细胞可见血管形成。用骨髓基质细胞分离、培养内皮细胞和促进血管形成的效果是肯定的。目前，已经有人用直接注射自体骨髓基质细胞的方法治疗心肌缺血，并且已经进入临床试验阶段。

由此考虑，在骨组织工程的种子细胞的选择上，利用骨髓基质细胞，使之定向分化为成骨细胞和内皮细胞，并使二者相互促进发挥作用，可能是一个有前景的研究方向。

生长因子在血管化过程中起着重要作用。促进血管形成的生长因子有VEGF，FGF，BMP，TGF-β等。

血管内皮细胞生长因子(VEGF)在血管形成中是一个基本的调节因子，它在胚胎的血管形成过程中是必不可少的，并且为长骨生长和软骨化骨所需。VEGF可以强烈地刺激内皮细胞分裂增殖，促进血管形成。很多细胞包括成骨细胞可以合成分泌VEGF。

碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是骨和软骨组织中的一种成分，它可以促进成骨细胞和软骨细胞的分裂增殖，在培养中抑制软骨细胞的最终分化。在异位成骨中，bFGF可以通过增加受体床的新生血管形成改善血供条件，并且能帮助多能性间充质细胞趋化和增殖。

Leunig等通过实验研究bFGF的作用，在体外，bFGF抑制软骨细胞的分化，降低软骨板的生长速度，但是在鼠皮下植入的体内实验中，bFGF通过促进血管化加快新骨的形成，这也从另一方面说明了血管化对新骨的形成的作用。

关于TGF-β和BMP的促血管形成作用有争论，Suwa等认为BMP加入到HAP中可以显著地刺激新血管形成，逐渐形成丰富的血管网包裹HAP，加速骨缺损的愈合，而且HA复合BMP可以显著刺激未分化的间充质细胞分化为成血管内皮细胞和成骨细胞。但是Levine和Yamashita等认为BMP对血管形成只有轻微或没有作用。Cheung WH等认为在骨骺板中的TGF-β1有抗血管形成作用，并且其抗血管形成作用可以用抗TGF-β1抗体来消除。但Ramoshebi等发现用TGF-β1可以使鸡的尿囊绒膜上有明显的血管形成。

血管的形成是多种因素共同作用的结果，单独大剂量地使用某一种促血管形成的生长因子如VEGF可能形成血管瘤或有缺陷的血管组织，联合应用多种生长因子不仅有助于正常血管组织的形成，而且因子间会有协同作用。Ramoshebi等发现单独用大剂量的TGF-β1(20ng)，bFGF(500ng)或BMP-7(1000ng)可以在鸡的尿囊绒膜上有明显的血管形成，联合应用低剂量的TGF-β1(5ng)，bFGF(100ng)和BMP-7(100ng)同样有明显的血管形成，而单独使用某种小剂量的细胞因子时血管明显减少。这些表明生长因子间对血管形成有协同促进作用。

促血管形成的生长因子的使用和其他的局部应用的调节因子一样，在使用的过程中应该保持足够的局部浓度和作用时间，并且释放平稳。因此促血管形成的生长因子的局部缓释使用应该是最好的选择。Elcin等用壳聚糖-白蛋白微球作为载体制作ECGF缓释剂，在体外3周时仍可保持(0.5 wt%)/ day的平稳释放，植入大鼠腹股沟区7天后有大量的新生血管形成，对照组(直接注射ECGF)在同等时间无明显新生血管形成。

生长因子也可以通过基因转染技术，将促血管的生长因子转入种子细胞，使种子细胞能持续地自动产生高效能的生长因子。

在动物体内预制血管化组织工程骨的试验中，常用的方法是把材料植入到血管网周围或将血管埋植入材料中，利用自身血管长入材料。Alam等硅树脂制成下颌骨形状，从中间剖开，装载骨基质材料和rhBMP-2，植入鼠的大腿内侧，将包含隐静脉的肌蒂夹在材料中。4周后可形成外形和下颌骨一样的带血管蒂的肌骨瓣，组织学显示材料内新骨形成，有丰富的血管网。

体外构建血管化骨比较复杂，目前进行了一些试验探索。Frerich等将骨髓基质细胞在体外扩增，种植到微载体上。将微载体置入含内皮细胞的纤维基质上，在体外培养。6周后显示毛细血管样结构增加到140mm/mm3。进一步的试验表明，高压氧可以明显增加毛细血管样结构的形成。

利用显微制造技术和计算机辅助设计、计算机辅助制造技术在体外合成血管化组织是组织工程的一个新的发展方向。Carnegie Mellon大学正在进行这方面的研究。基本原理是利用显微制造技术在薄膜材料上根据组织特异性构建出相应的材料结构，如毛细血管的沟槽和骨小梁结构，再种上相应的细胞，如血管内皮细胞和成骨细胞，然后将多层薄膜层叠固定，制造出含血管网的骨组织。

第二节　软骨组织工程学　Cartilage engineering

支架材料

目前软骨组织工程支架材料主要包括人工合成高分子材料、天然高分子材料和复合材料。

(一)人工合成高分子材料

PLA、PGA以及PLGA等人工合成高分子材料均具有生物可降解性、可塑性好。PLGA为PLA和PGA的共聚物，高度多孔的PLGA泡沫能为软骨细胞提供三维生长空间，是一种理想的支架材料。

(二)天然高分子材料

壳聚糖、藻酸盐、纤维蛋白凝胶、琼脂糖凝胶、透明质酸、胶原、明胶、胶原明胶、胶原海绵、胶原-糖胺聚糖复合物等天然高分子材料均可作为软骨组织工程支架，其中胶原和纤维蛋白的应用较为广泛。

(三)复合材料

常用的复合材料有:

1.天然材料与人工合成高分子材料的复合如壳聚糖与PLA、PGA的复合。

2.天然材料与天然材料的复合 如胶原与壳聚糖的复合，这种复合材料可调控降解速度和力学强度。

随着分子自组装、纳米技术的发展，自组装多肽材料也开始应用于软骨组织工程支架的研究。这种材料在一定条件的水相环境中可以形成一定形状的三维支架材料，可以通过注射技术运送到体内，其降解性好，降解产物为氨基酸单体，可以作为生物体营养物质的来源，很少引起毒副作用及免疫反应，从而成为一种新型的软骨组织工程支架材料。

种子细胞

软骨组织工程种子细胞主要有:软骨细胞、骨髓间充质干细胞和胚胎干细胞。

(一)软骨细胞

软骨细胞是软骨组织中单一细胞成分，软骨细胞的分离来自软骨。在无菌条件下取出关节软骨、骺软骨或肋软骨，用PBS漂洗3次，然后将软骨切成薄片，再将软骨片剪成1～2mm3大小的碎块，用0.25%胰蛋白酶按10∶1比例加入消化30分钟，吸去胰蛋白酶按10∶1比例加入Ⅱ型胶原酶消化4～6小时。为避免胶原酶对细胞的毒性作用，可在此阶段采用分阶段收集分离的软骨细胞。分离出的软骨细胞用PBS或Hank液漂洗3次，制成细胞悬液，然后加入培养液接种在培养瓶上，在37℃5%CO2条件下培养。

采用单层培养(二维培养)的软骨细胞经过传代后其形态和功能将发生一系列变化，Ⅱ型胶原蛋白分泌减少，增殖能力逐渐下降。Benya等于1982年发现软骨细胞在琼脂糖凝胶三维环境中能够保持表型稳定和未分化状态，三维环境有利于软骨细胞增殖、分化、表型稳定和基质合成，这促进了软骨组织工程的发展。为了解决软骨细胞体外大规模培养问题，近年来开始应用微载体培养软骨细胞或其他细胞。微载体可由Ⅱ型胶原蛋白、葡聚糖Cytodex 3构成，悬浮在培养液中的微球为细胞提供了广阔的黏附面积，使细胞有大量空间进行增殖。

(二)骨髓间充质干细胞

MSC有多向分化潜能，也可以作为软骨组织工程种子细胞。从成人一次骨髓穿刺中获取的骨髓间充质干细胞可在体外连续培养30代以上，数量扩增100万倍以上，仍保持向软骨细胞分化的能力。用不同生物活化因子诱导MSC，结合相应的生物材料，可构建出工程化骨软骨复合体，因此，MSC是一种比较理想的种子细胞。

(三)胚胎干细胞

胚胎内细胞团和桑葚胚中部分细胞具有分化成各种组织器官的潜能，这部分细胞被称为胚胎干细胞。在BMP-2和BMP-4的作用下，ESC可分化为软骨细胞。ESC作为种子细胞除具有增殖能力外，还具有再生潜能，可维持整个生命过程中细胞的更新和正常的功能，但使用ESC作为软骨组织工程种子细胞，体外培养及诱导条件要求严格，还存在自发分化、致瘤性和伦理学问题。

生长因子

BMP和TGF-β可诱导间充质细胞分化成软骨组织。TGF-β1即软骨诱导因子A，是软骨组织工程的首选生长因子，具有多重生物效应:①促进软骨基质合成。适当剂量的TGF-β1能促进关节软骨细胞增殖和合成软骨特异性Ⅱ型胶原及蛋白多糖，还能使多糖硫酸程度更高，更加复合软骨的生理特点。TGF-β1能诱导MSC向软骨细胞和成骨细胞分化，从而可很好地再生关节软骨和软骨下骨板。关节内反复注射或者通过基质材料控释TGF-β1，可促进关节软骨缺损的修复。但是大剂量反复注射则可引起滑膜增生和骨赘形成。②抑制软骨分解代谢。关节软骨缺损修复远期疗效不佳的一个重要原因是，在创伤或骨关节炎等疾病引起的关节软骨缺损的病理过程中，有许多炎性介质参与软骨基质的降解，如白介素(IL-1、IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、干扰素(IFN-γ)、一氧化氮(NO)、基质金属蛋白酶(MMPs)等，而TGF-β1能抑制所有这些炎性介质的活性，并能促进MMPs抑制剂(TIMP)表达，从而抑制软骨分解代谢，提高修复质量。③TGF-β1还是一种强烈的免疫抑制剂，其作用比环孢素强很多倍，从而使同种异体移植更为安全。

FGF-2(bFGF)对软骨细胞既是有丝分裂原又是形态发生因子，软骨组织中含有大量生物活性bFGF。培养的软骨细胞生长活跃时，只有在适当浓度的bFGF作用下才能保持其分化活性，合成软骨特异性细胞外基质，抑制其终末分化和钙化，否则很快去分化，转化为成纤维细胞外观，bFGF甚至能将一些已经成熟或者转化为成纤维细胞的细胞反分化为软骨细胞。对静止软骨细胞或者发生去分化已生长至融合的细胞，bFGF不能再恢复其软骨表型。关节内注射bFGF能使正常情况下不能修复的软骨缺损完全修复。

组织工程化软骨的构建及应用

组织工程化软骨的构建也包括两种方法:一是将支架材料与软骨细胞复合直接植入到软骨缺损区;另一种是将特定形状的可降解支架材料与软骨细胞复合后植入到裸鼠或者体内皮下，经数周后形成特定形状的软骨，再移植到体内所需部位。如用此种方法构建成耳廓软骨或气管软骨，用于修复耳廓或者气管的缺损。目前如何制备组织工程化软骨用于临床是研究的主要目标之一。传统的培养方法很难制备出高质量的工程化软骨以满足临床需求。和传统的方法相比，生物反应器培养系统具有以下优点:①通过有效的混合方式使种子细胞在三维支架材料中均匀分布;②动态流体环境能使营养物质充分扩散至整个细胞/支架三维复合物中，使所有细胞都能均匀获得充分的营养;③可充分模拟体内生理环境，通过各种生化和流体力学刺激信号对细胞生长进行有效的调控。目前人们已经研制出多种模拟体内环境的培养系统:如模拟微重力旋转生物反应器、固体旋转生物反应器、搅动混合旋转培养瓶系统、连续灌注培养系统、环绕混合培养形态等。软骨细胞/材料复合物在静止培养皿中培养时，仅下层可形成软骨基质，在环绕混合培养皿中培养时，方可形成均匀的细胞外基质，而在旋转生物反应器中可培养出厚度达5mm以上的人工软骨，各种生化和力学指标均显著高于前两种方法，但是和正常软骨组织相比仍存在一定的差异。在旋转生物反应器中培养6周时，总胶原含量占正常软骨的39%，其中90%为Ⅱ型胶原，水渗透性为正常的4倍，而平衡模量仅占正常软骨的18%;培养7个月时，总胶原含量占正常的38%，其中75%为Ⅱ型胶原，水渗透性和平衡模量与正常相当。说明这种培养系统虽能显著提供新生软骨质量，但还需进一步改进。

在骨、软骨组织工程的研究中，如何能保持生长因子的有效的生物活性和对种子细胞的调控是一个亟待解决的难题，是用外源性生长因子调控种子细胞存在一些问题:需要复杂的纯化过程，故价格较昂贵;生长因子半衰期短，局部使用时可以被稀释，故需反复使用或加大剂量，从而增加了成本和副作用。基因治疗给上述问题的根本解决带来了可能。

基因治疗是将外源性生长因子的基因导入目的细胞中并使它有效表达，达到治疗的目的。在组织工程研究中，可将促进骨软骨细胞生长的基因导入种子细胞，达到持续促进细胞分化增殖的目的。基因治疗用于组织工程的优点是:①受体细胞可持续高效表达目的基因以调控期自身及其他效应细胞的生长以获得人们所需的特定功能替代;②转基因细胞合成分泌的内源性蛋白经过了适当的翻译后修饰过程，具有更多的可识别的配体，能更有效地同细胞受体结合，因此其表达产物活性更高，所需产物量更小(ng或pg水平)，大大减少了外源性重组蛋白大剂量(mg或μg水平)反复使用的副作用;③质粒DNA和载体制备容易、稳定性好、半衰期长，价格远远低于纯化的重组蛋白;④免疫排斥反应亦可借助此技术得到解决。可对胚胎干细胞进行基因操作或将有免疫抑制作用的基因转入种子细胞内，也可改变抗原表面决定簇或者清除不需要的抗原呈递细胞。例如TGF-β1是一种强烈的免疫抑制剂，其作用比环孢素还要强烈，同时它又可以调节骨、软骨等多种细胞的增殖分化，将TGF-β1基因转入相关细胞中，不仅能获得所需的功能，而且能抑制可能的免疫排斥反应。

作者的研究小组将具有促进种子细胞增殖分化、抑制多种炎性介质活性及免疫排斥反应等多重生物学效应的TGF-β1基因转入关节软骨组织工程的种子细胞——间充质干细胞，并与具有良好生物相容性和结构相容性的涂附多聚赖氨酸的聚DL乳酸的可降解多孔支架材料复合移植，修复同种异体兔股骨髁全厚关节软骨缺损。通过体内外实验，以空载体转染MSC为对照，检测:①MSC能否作为基因治疗的受体细胞并稳定表达生物活性的TGF-β1;②基因转染的量效关系;③TGF-β1基因转染对MSC增殖分化的影响;④TGF-β1基因转染对炎性介质如白介素1(IL-1)的抑制作用;⑤基因治疗的安全性;⑥TGF-β1基因转染能否提高同种异体兔全厚关节软骨缺损的修复质量和远期疗效。

结果显示:①MSC能作为基因治疗的受体细胞并能在体外稳定表达生物活性的TGF-β1至少4周以上。②当细胞接种密度、生长状态及反应时间保持不变时，TGF-β1表达质粒与脂质体的剂量为2/3、2/6、及1/6(μg/μl)时，转染效率即TGF-β1表达量最高。③TGF-β1基因转染对MSC增殖分化的影响也与剂量有关。1μg/3μl剂量TGF-β1基因转染能获得最佳转染效率和促进MSC增殖分化效应;流式细胞仪检测显示此剂量TGF-β1基因转染能显著提高S期的DNA含量，使停滞于G0/G1期的细胞进入S期，促进MSC增殖;透射电镜观察显示此剂量实验组的MSC功能更加活跃;转基因细胞/支架材料复合培养扫描电镜观察进一步证实此剂量实验组的MSC增殖分化活性明显优于对照组。④TGF-β1基因转染能显著抑制IL-1对羟脯氨酸合成的降解作用。⑤软琼脂培养及透射电镜观察显著转基因的MSC并未向恶性方向转化，初步证明了TGF-β1基因治疗的安全性。⑥体内实验透射电镜及组织学结果显示实验组新生组织未透明样软骨，细胞外基质主要是软骨特征性的Ⅱ型胶原纤维，关节面平整，软骨下骨完全再生，与宿主骨结合紧密，未见免疫排斥反应;对照组则新生软骨质量欠佳，细胞外基质为Ⅰ、Ⅱ型混杂胶原纤维，与宿主骨整合欠佳，有不同程度的免疫排斥反应。

实验表明:利用TGF-β1生物学效应的多重性，通过转基因技术使TGF-β1持续高效发挥作用，促进种子细胞增殖分化、抑制多种炎性介质活性及免疫排斥反应，使提高关节软骨缺损的修复质量和远期疗效成为可能。

目前，组织工程化软骨已开始应用于临床修复关节软骨轻度缺损，近期疗效较好，远期疗效尚待进一步观察。但仍存在如组织工程化软骨过早退变、耐磨性较差及易纤维化等问题尚待解决。

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