第一篇 生物分子结构与功能
第一章 蛋白质的结构与功能
1.1 复习笔记
一、蛋白质的分子组成
1蛋白质的一般组成
氨基酸是蛋白质的基本结构单位，蛋白质可在酸、碱或蛋白酶的作用下水解得到氨基酸。所有蛋白质均含有C、H、O、N四种元素，有的蛋白质还含有P、S等元素。
2氨基酸的结构
组成人体蛋白质的20种氨基酸均属于L-α-氨基酸（甘氨酸除外），其分子中的4个基团——氨基、羧基、氢原子和R基团均连在同一个α-碳原子上，其中R基团为侧链基团，其通式如图1-1所示。
图1-1 α-氨基酸的结构通式
3氨基酸的分类
组成人体蛋白质的20种氨基酸依据其侧链结构和理化性质可分为以下5类：
（1）非极性脂肪族氨基酸：有甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）、脯氨酸（Pro）。
（2）极性中性氨基酸：有丝氨酸（Ser）、半胱氨酸（Cys）、甲硫氨酸（Met）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酰胺（Gln）、苏氨酸（Thr）。
（3）芳香族氨基酸：有苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp）。
（4）酸性氨基酸：有天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）。
（5）碱性氨基酸：有精氨酸（Arg）、赖氨酸（Lys）、组氨酸（His）。
4氨基酸的理化性质
（1）两性解离及等电点（pI）
①两性解离
所有氨基酸都含有碱性的α-氨基和酸性的α-羧基，因此既可发生酸性解离也可发生碱性解离，为两性电解质。
②等电点
a．定义：氨基酸分子所带正负电荷相等时溶液的pH值称为氨基酸的等电点（pI）。当溶液pH＝pI时，氨基酸主要以两性离子形式存在；pH＜pI时，氨基酸主要以正离子形式存在；pH＞pI时，氨基酸主要以负离子形式存在。
b．pI的计算：通常氨基酸的pI是由α-羧基和α-氨基的解离常数的负对数pK1和pK2决定的，即pI＝1/2（pK1＋pK2）。
（2）含共轭双键的氨基酸有紫外吸收特征
①定义
在近紫外区，色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）均有特征吸收峰。其中Trp的最大吸收波长为280nm；Tyr的最大吸收波长为275nm；Phe的最大吸收波长为257nm。
②意义
含有Trp、Tyr和Phe的蛋白质具有紫外吸收能力，一般最大光吸收在280nm波长处，故可通过测定蛋白质溶液280nm的光吸收值来分析溶液中蛋白质的含量。
（3）茚三酮反应
在弱碱性溶液中，氨基酸与茚三酮水合物共热时，氨基酸被氧化脱羧、脱氨，而茚三酮则被还原，其还原物与氨基酸加热产生的氨结合，再与另一分子茚三酮作用生成蓝紫色化合物的反应称为茚三酮反应。此蓝紫色化合物在570nm处有最大吸收峰。该反应生成的蓝紫色混合物吸收峰值的大小与氨基酸释放出的氨量成正比，因此可作为氨基酸定量分析的方法。
二、蛋白质的分子结构
1蛋白质分子结构的基础
（1）肽键
蛋白质分子是由许多氨基酸通过肽键相连而成的生物大分子。其中肽键是一种酰胺键，是由一个氨基酸的α-氨基和另一个氨基酸的α-羧基脱水缩合形成的化学键，通常用羰基碳和酰胺氮之间的单键表示，参与肽键的6个原子Cα1、C、O、N、H、Cα2位于同一平面，构成肽单元。
图1-2 肽键组成示意图
（2）肽
肽是指由一氨基酸的羧基和另一氨基酸的氨基脱水缩合形成的化合物，又称肽链。通常将十个以下氨基酸残基组成的肽链称为寡肽，更长的肽链则称为多肽。肽链中的氨基酸分子因脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基。
（3）体内存在的重要的生物活性肽
①谷胱甘肽（GSH）
谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽，其分子中半胱氨酸的巯基是该化合物的主要功能基团，该肽具有以下生物活性：
a．巯基具有还原性，故GSH可作为还原剂保护体内的蛋白质和酶分子；
b．清除体内的过氧化物，而本身被氧化成氧化型谷胱甘肽（GSSG）；
c．具有嗜核特性，与嗜电子毒物（如致癌物）结合，解除其毒性。
②多肽类激素及神经肽
如促肾上腺皮质激素（39肽）、促甲状腺素释放激素（3肽）、催产素（9肽）、加压素（9肽）等。
2蛋白质的分子结构
蛋白质复杂的分子结构一般分成4个层次，即一级、二级、三级和四级结构。其中后三者统称为高级结构或空间构象，即一条或数条多肽链上所有原子和基团在三维空间上的排布。
表1-1 蛋白质的分子结构及维系键
（1）蛋白质的一级结构
蛋白质的一级结构是指多肽链中氨基酸的排列顺序。其中维持蛋白质一级结构的主要化学键是肽键，另外蛋白质分子中所有二硫键的位置也属于一级结构。蛋白质的一级结构是理解蛋白质结构、作用机制、有类同功能的蛋白质相互关系的基础。
（2）蛋白质的二级结构
常见的蛋白质二级结构有α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲。氨基酸残基的侧链影响二级结构的形成。
①α-螺旋结构
a．定义
α-螺旋是指蛋白质分子中多个肽键平面通过氨基酸α-碳原子的旋转，使多肽链的主链围绕中心轴呈有规律的螺旋式上升、盘旋形成的构象。
b．特点
第一，螺旋的走向为顺时针方向，即右手螺旋，氨基酸侧链伸向螺旋外侧；
第二，每3.6个氨基酸残基螺旋上升一圈（即旋转360°），螺距为0.54nm；
第三，相邻螺圈之间形成氢键，氢键的方向与螺旋长轴基本平形。肽链中的全部肽键都可形成氢键，以稳固α-螺旋结构。
②β-折叠
β-折叠是指两条或多条伸展的多肽链（或一条多肽链的若干肽段）侧向集聚，通过相邻肽链主链上的N-H与C＝O之间有规则的氢键，形成的锯齿状片层结构。
表1-2 β折叠结构与a-螺旋结构对比
③β-转角
β-转角是指肽链出现180°左右转向回折时，形成的U形有规律的二级结构，由第一个氨基酸残基上的C＝O隔两个氨基酸残基，与第四个氨基酸残基上的-N-H形成的氢键来维持其稳定性。β-转角的结构较特殊，第二个残基常为脯氨酸。
④无规卷曲
无规卷曲，泛指那些不能被归入明确的二级结构，如折叠片或螺旋的多肽区段，是一类没有规律的松散结构。
（3）蛋白质的三级结构
蛋白质的三级结构是指多肽链在二级结构的基础上进一步折叠、盘绕成复杂的空间结构。三级结构涉及蛋白质分子或亚基内所有原子的空间排布，但不涉及亚基之间的关系。主要靠非共价键来维持。蛋白质三级结构的形成和稳定主要靠次级键，如疏水作用、盐键、氢键和范德华力。
（4）蛋白质的四级结构
蛋白质的四级结构由具有三级结构的蛋白质分子亚基按一定方式（以非共价键相连）聚合起来成蛋白质大分子。亚基，又称亚单位，是指具有三级结构的多肽链。在四级结构中，各亚基间的结合力主要是氢键和离子键。
（5）超二级结构和结构域
①超二级结构和模体（motif）
a．超二级结构是指由2个或以上具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个有规则的二级结构组合，如αα，βαβ，ββ等。
b．模体表示具有特定功能的或作为一个独立结构域一部分的相邻的二级结构的聚合体，一般被称为功能模体或结构模体，相当于超二级结构。如锌指结构。
②结构域
结构域是在二级结构的基础上，多肽链进一步折叠形成的结构紧密稳定，并各行其功能的区域。具有较为独立的三维结构。
三、蛋白质结构与功能的关系
1蛋白质一级结构是高级结构与功能的基础
（1）一级结构是空间构象和蛋白质生物学功能的基础；
（2）一级结构相似的蛋白质具有相似的高级结构与功能；
（3）氨基酸序列提供重要的生物进化信息；
（4）重要蛋白质的氨基酸序列改变可引起疾病，如血红蛋白质异常病变导致镰刀型贫血病。
2蛋白质的高级构象决定蛋白质的功能
以血红蛋白（Hb）与肌红蛋白（Mb）举例说明，血红蛋白亚基与肌红蛋白亚基相似，也具有相似的功能；此外，蛋白质构象改变也可引发疾病，如朊病毒蛋白构象异变引发疯牛病。
（1）血红蛋白与肌红蛋白的结构比较
二者都含有血红素辅基，血红素是铁卟啉化合物。
①肌红蛋白是由一条肽链和一个血红素辅基组成的结合蛋白。
②血红蛋白是一个由4个亚基（两个α亚基和两个β亚基）组成的四聚体。α和β亚基的三级结构几乎与肌红蛋白相同，只是肽链稍微短一点。一分子Hb可结合4分子氧。
（2）血红蛋白的构象变化
肌红蛋白的功能是贮存和转运O2到肌肉细胞中。而血红蛋白是红细胞内运输氧的特殊蛋白质。血红蛋白的别构效应是说明蛋白质三维结构与功能关系的典型例子。
①血红蛋白存在两种主要构象态：T态和R态。氧结合引起血红蛋白构象发生变化。
a．T态又称紧张态，R态又称松弛态。O2对R态血红蛋白的亲和力明显高于T态，并且氧的结合更稳定了R态。缺氧时T态更加稳定，因此T态是去氧血红蛋白的主要构象，作为T态的去氧血红蛋白有专一的氢键和盐桥起着稳定作用。
b．R态是氧合血红蛋白的主要构象。
c．T态结合O2后转变成R态，并使分子内一些盐桥断裂。
②当氧与血红蛋白分子中1个亚基血红素的铁结合后，血红蛋白发生别构效应使它所在亚基的盐键破裂，从而使原来结合变得松散，易与氧结合；盐键的断裂使β-亚基与氧结合的速度加快。氧合反应最后使盐键全部断裂，整个血红蛋白的分子就成为氧合血红蛋白的构象，大大提高了氧的结合。
（3）血红蛋白和肌红蛋白的氧合曲线
①血红蛋白含4个亚基，具有别构作用。血红蛋白的氧合具有正协同性同促效应，即一个O2的结合增加同一血红蛋白分子中其余亚基与O2的亲和力，它的氧合曲线呈S形。
②肌红蛋白只有一条多肽链，没有别构作用，它的氧合曲线是直角双曲线（图1-3）。
故Mb易与O2结合，而Hb与O2的结合在O2分压较低时较难。
图1-3 肌红蛋白和血红蛋白的氧合曲线
四、蛋白质的理化性质
1蛋白质的两性电离、等电点和电泳
（1）蛋白质为两性电解质，其分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定pH条件下的溶液中都可解离成带负电荷或正电荷的基团。
（2）蛋白质的等电点
①蛋白质的等电点（pI）是指蛋白质所带的正电荷数与负电荷数相等时溶液的pH。
②蛋白质溶液的pH大于等电点时，该蛋白质颗粒带负电荷，反之则带正电荷。
（3）电泳：蛋白质在溶液中解离成带电颗粒，在电场中可以向与电荷相反的电极移动的现象。
2蛋白质的胶体性质
蛋白质的分子都很大，在水中形成胶体溶液，故具有胶体溶液的性质：丁达尔效应、布朗运动以及不能透过半透膜。维持蛋白质稳定的因素是胶体颗粒表面所带的电荷和水化膜。
3蛋白质的变性
（1）蛋白质变性作用与凝固作用的定义
①蛋白质变性是指天然蛋白质受物理或化学因素的影响，分子内部的高度规则性的空间排列发生变化，致使其原有性质和功能发生部分或全部丧失的现象。
②凝固作用是指天然蛋白质变性后，所得的变性蛋白质分子互相凝聚或互相穿插缠结在一起的现象，是蛋白质变性后进一步发展的不可逆的结果。
（2）变性蛋白质的特征
蛋白质变性后，其理化性质及生物学性质会发生改变，如溶解度降低、黏度增加、结晶能力消失、生物学活性丧失、易被蛋白酶水解等。
（3）蛋白质变性的实质
蛋白质变性的实质是蛋白质分子中的次级键（主要是二硫键和非共价键）被破坏，引起天然构象解体，而一级结构仍保持完好。
（4）引起变性的因素
①物理因素：高温、高压、紫外线、电离辐射及超声波等。
②化学因素：强酸强碱、有机溶剂、重金属盐、去污剂等。
（5）蛋白质的复性
若引起变性的程度较温和，去除变性因素后，蛋白质重新恢复或部分恢复其构象和功能的过程称为复性。
4蛋白质沉淀
（1）加酸沉淀蛋白质
加酸使达到蛋白质的等电点，溶解度减低而沉淀，浓酸可使蛋白质成为不溶性变性蛋白质而沉淀。
（2）加中性盐沉淀蛋白质（盐析）
向蛋白质溶液中加入高浓度的中性盐使其沉淀析出的现象称为盐析，常用（NH4）2SO4、Na2SO4、NaCl等作为蛋白质盐析剂。
（3）加有机溶剂沉淀蛋白质
乙醇、丙酮能吸水，破坏蛋白质胶粒上的水化层，而使蛋白质沉淀。低温时，用丙酮脱水，还可保存原有的生物活性，但用乙醇脱水，时间较长后可使蛋白质变性沉淀。
（4）加重金属盐沉淀蛋白质
蛋白质在碱性溶液中带负电荷，可与重金属离子如Zn2＋、Cu2＋、Hg2＋、Pb2＋、Fe2＋等作用，产生重金属蛋白盐沉淀，故重金属中毒时，可口服大量牛奶、生蛋清等，有解毒作用。
（5）加生物碱试剂沉淀蛋白质
生物碱试剂如单宁酸、苦味酸等都能沉淀蛋白质。其沉淀原理是一般生物碱试剂皆为酸性物质，而蛋白质在酸性溶液中带正电荷，故能与带负电荷的酸根相结合，成为溶解度很小的盐类而析出沉淀。
5蛋白质的紫外吸收
蛋白质中含有Trp、Tyr和Phe时，也具有紫外吸收能力，一般最大光吸收在280nm波长处，且蛋白质的A280与其浓度成正比关系，因此可通过测定蛋白质溶液280nm的光吸收值来分析溶液中蛋白质的含量。
6蛋白质的呈色反应
（1）茚三酮反应
蛋白质经水解后产生的氨基酸可发生茚三酮反应，即与茚三酮水合物共热时，会发生反应，生成蓝紫色化合物。
（2）双缩脲反应
蛋白质和多肽分子中的肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，生成紫红色或蓝紫色复合物的反应称为双缩脲反应。该反应是肽和蛋白质所特有的反应，氨基酸不出现此反应。且反应颜色的深浅与肽或蛋白质的含量成正比，因此可利用该反应测定蛋白质的含量和检测蛋白质的水解程度。
五、蛋白质的分离、纯化
分离纯化蛋白质的依据：蛋白质分子大小不同、蛋白质溶解度差异、蛋白质特异性免疫识别、蛋白质电离性质不同、亲和层析。
1根据蛋白质分子大小不同分离
（1）透析
透析是一种基于蛋白质不能透过半透膜的性质，利用透析袋将其与其他小分子化合物分离的方法。
（2）超滤法
应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的称为超滤法。
（3）超速离心法
在重力作用下，蛋白质在溶液中逐渐沉降，直至其浮力与离心所产生的力相等时，沉降停止。不同蛋白质其密度与形态各不相同，因此在一定的超速离心条件下，蛋白质分子因分子大小、密度、形态等不同而以不同的速度沉降，每一种蛋白质分子会形成一条特定的区带。该方法可用来分离纯化蛋白质、测定蛋白质的分子量。
（4）凝胶过滤法（凝胶层析）
凝胶过滤法所用的介质为凝胶珠，其内部为多孔网状结构，当分子大小不同的蛋白质溶液加于层析柱时，小分子蛋白质能进入凝胶珠的孔内，在凝胶珠内滞留较长时间，大分子蛋白质不能进入孔内而直接流出，因此根据流出时间的不同可将大小不同的蛋白质分子分离。
2根据蛋白质溶解度的差异进行分离
（1）盐析
盐析是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和且水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀。
（2）丙酮沉淀
丙酮沉淀是一种常用的蛋白质浓缩方法。使用丙酮沉淀时，须在0～4℃低温下进行，且丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积；蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离，否则蛋白质会变性。此外，还可用乙醇沉淀。
3根据蛋白质特异性免疫识别分离（免疫沉淀）
蛋白质具有抗原性，利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。此法可用于特定蛋白质的定性和定量分析。
4根据蛋白质电离性质不同分离
（1）电泳
蛋白质在高于或低于其pI的溶液中会解离成带电的颗粒，在电场中会向正极或负极方向移动。不同的蛋白质所带电荷不同、分子量不同，因此在电场中的移动速度也不同，这种利用蛋白质在电场中移动速度的快慢来分离各种蛋白质的技术称为电泳。依据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳（常用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE）、等电聚焦电泳等。。
（2）离子交换层析法
离子交换层析是指以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法，蛋白质对离子交换剂的结合力取决于彼此间相反电荷基团的静电吸引，而这又和溶液的pH有关。
5应用亲和原理进行蛋白质分离
亲和层析是根据蛋白质能与特异的配体相结合而设计的方法，将待纯化蛋白质的特异配体通过连接臂连到不溶性的载体上后以适当的缓冲液装入层析柱中。当蛋白质混合物流经此柱时，待纯化的蛋白质可特异地结合到相应的配体上，其他的蛋白质则不被结合，最后通过洗涤除去未结合的杂蛋白。
六、氨基酸序列以及蛋白质空间结构的测定
应用化学或反向遗传学方法可分析多肽链的氨基酸序列；应用物理学、生物信息学原理可进行蛋白质空间结构测定，如采用圆二色光谱测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量，X射线衍射法和核磁共振技术研究蛋白质三维空间结构。
七、蛋白质的分类
蛋白质的分类如表1-3所示。
表1-3 蛋白质的分类
