4.2 课后习题详解
1如果一个相对分子质量为12000的蛋白质，含10种氨基酸，并假设每种氨基酸在该蛋白质分子中的数目相等，问这种蛋白质有多少种可能的排列顺序？
答：已知蛋白质中氨基酸平均相对分子质量为120，则该蛋白质中氨基酸数目为12000/120＝100，所以该蛋白质可能的排列顺序有10100种。
2有一个A肽，经酸解分析得知为Lys、His、Asp、Glu2、Ala以及Val、Tyr和两个NH3分子组成。当A肽与FDNB试剂反应后，得DNP-Asp；当用羧肽酶处理后得游离缬氨酸。如果我们在实验中将A肽用胰蛋白酶降解时，得到两种肽，其中一种（Lys、Asp、Glu、Ala、Tyr）在pH6.4时，净电荷为零，另一种（His、Glu以及Val）可给出DNP-His，在pH6.4时，带正电荷。此外，A肽用糜蛋白酶降解时，也得到两种肽，其中一种（Asp、Ala、Tyr）在pH6.4时呈中性，另一种（Lys、His、Glu2以及Val）在pH6.4时，带正电荷。问A肽的氨基酸序列如何？
答：（1）该A肽的氨基酸序列为：Asn-Ala-Tyr-Glu-Lys-His-Gln-Val
（2）具体分析过程如下：
①FDNB法测定N-末端氨基酸，A肽与FDNB试剂反应后得DNP-Asp，表明N-末端为Asp-。
②羧肽酶法测定C-末端残基，处理后得游离缬氨酸，表明C-末端为-Val。
③胰蛋白酶只断裂赖氨酸或精氨酸残基的羧基形成的肽键，得到的是以Arg和Lys为C-末端残基的肽段。用胰蛋白酶降解得到两种多肽，其中一段含Lys，表明该A肽结构为Asp-（ ）-（ ）-（ ）-Lys-（ ）-（ ）-Val。
④由（His、Glu以及Val）可给出DNP-His，又pH6.4时带正电荷即Glu应为Gln，酸水解使Gln→Glu，此片段序列为His-Gln-Val。
⑤糜蛋白酶断裂Phe、Trp和Tyr等疏水氨基酸残基的羧基端肽键。用糜蛋白酶降解A肽得到两种肽（Asp、Ala、Tyr）和（Lys、His、Glu2以及Val），结合③和④可得其结构为Asp-Ala-Tyr-Glu-Lys-His-Gln-Val。
⑥又（Asp、Ala、Tyr）在pH6.4时呈中性，则Asp应为Asn，酸水解使Asn→Asp＋NH4＋，所以此A肽的氨基酸序列为Asn-Ala-Tyr-Glu-Lys-His-Gln-Val。
⑦利用（Lys、Asp、Glu、Ala、Tyr）在pH6.4时净电荷为零及（Lys、His、Glu2以及Val）在pH6.4时带正电荷能验证推断正确。
3某多肽的氨基酸序列如下：
（1）如用胰蛋白酶处理，此多肽将产生几个肽？并解释原因（假设没有二硫键存在）。
（2）在pH7.5时，此多肽的净电荷是多少单位？说明理由（假设pKa值：α-COOH4.0；α-NH3＋6.0；Glu和Asp侧链基4.0；Lys和Arg侧链基11.0；His侧链基7.5；Cys侧链基9.0；Tyr侧链基11.0）。
（3）如何判断此多肽是否含有二硫键？假如有二硫键存在，请设计实验确定5，17和23位上的Cys哪两个参与形成？
答：（1）①4个肽。
②原因：胰蛋白酶只断裂赖氨酸或精氨酸残基的羧基形成的肽键，得到以Arg和Lys为C-末端残基的肽段。所以上述多肽可以得到Glu-Val-Lys、Asn-Cys-Phe-Arg、Trp-Asp-Leu-Gly-Ser-Leu-Glu-Ala-Thr-Cys-Arg和His-Met-Asp-Gln-Cys-Tyr-Pro-Gly-Glu-Glu-Lys这4个肽段。
（2）①在pH7.5时，此多肽的净电荷是－2.5单位。
②理由：pH7.5时4个Glu和2个Asp共带6个负电荷，2个Lys和2个Arg带4个正电荷，1个His可以被看作带半个正电荷，其他氨基酸均不带电荷，1个α-COOH带1个负电荷，所以净电荷为－2.5单位。
（3）如果用胰蛋白酶处理此多肽产生4个肽段，则其不含二硫键；若用胰蛋白酶处理此多肽产生3个多肽，则其含有二硫键。假如有二硫键存在，则经胰蛋白酶处理后得到的3个肽段所带电荷不同，因此可用离子交换层析、电泳等方法将肽段分开，鉴定出含二硫键的肽段，测定其氨基酸顺序，便可确定二硫键的位置。
4今有一个七肽，经分析它的氨基酸组成是：Lys、Pro、Arg、Phe、Ala、Tyr和Ser。此肽未经糜蛋白酶处理时，与FDNB反应不产生α-DNP-氨基酸。经糜蛋白酶作用后，此肽断裂成两个肽段，其氨基酸组成分别为Ala、Tyr、Ser和Pro、Phe、Lys、Arg。这两个肽段分别与FDNB反应，可分别产生DNP-Ser和DNP-Lys。此肽与胰蛋白酶反应能生成两个肽段，它们的氨基酸组成分别是Arg、Pro和Phe、Tyr、Lys、Ser、Ala。试问此七肽的一级结构是怎样的？
答：（1）此肽未经糜蛋白酶处理时，与FDNB反应不产生DNP-氨基酸，说明此肽不含游离N-末端氨基酸，即此肽为环肽。
（2）糜蛋白酶可断裂Phe、Trp和Tyr等疏水氨基酸残基的羧基端肽键。由该肽经糜蛋白酶作用后产生两个肽段（Ala、Tyr、Ser）和（Pro、Phe、Lys、Arg）可知结构：-（ ）-（ ）-Tyr-和-（ ）-（ ）-（ ）-Phe-。
（3）由（2）得到的两肽段与FDNB反应，分别产生DNP-Ser和DNP-Lys，可知该两肽段的N末端分别为Ser和Lys，结合（2）可知结构：-Ser-Ala-Tyr-和-Lys-（ ）-（ ）-Phe-。
（4）胰蛋白酶只断裂Arg或Lys残基的羧基参与形成的肽键。由该肽与胰蛋白酶反应能生成两个肽段（Arg、Pro）和（Phe、Tyr、Lys、Ser、Ala）可知结构：-Pro-Arg-和-（ ）-（ ）-（ ）-（ ）-Lys-。
综上所述可知此七肽为一环肽，其一级结构是-Phe-Ser-Ala-Tyr-Lys-Pro-Arg-。
5三肽Lys-Lys-Lys的pI值必定大于它的任何一个个别基团的pKa值，这种说法是否正确？为什么？
答：正确。当该三肽处于等电点时，其解离集团所处的状态是：C-末端是COO-（pKa＝3.0），N末端NH2（pKa≈8.0），3个侧链为3（1/3ε-NH3＋）（pKa＝10.53），因此pI值＞最大的pKa值（10.53）。
6一个多肽可还原为两个肽段，它们的序列如下：链1为Ala-Cys-Phe-Pro-Lys -Arg-Trp-Cys-Arg-Arg-Val-Cys；链2为Cys-Tyr-Cys-Phe-Cys。当用嗜热菌蛋白酶消化原多肽（具有完整的二硫键）时可得下列各肽：（1）（Ala、Cys2、Val）；（2）（Arg、Lys、Phe、Pro）；（3）（Arg2、Cys2、Trp、Tyr）；（4）（Cys2、Phe）。试指出在该天然多肽中二硫键的位置。
答：已知嗜热菌蛋白酶断裂Leu、Ile、Phe、Trp、Tyr及Val等疏水性强的氨基酸残基的N端，根据题中已知条件可进行以下分析：
（1）消化原多肽得到（Ala、Cys2、Val），说明链1在2位Cys后及11位Val前断裂，2位Cys与12位Cys之间有二硫键。
（2）由链1序列及肽段（2）组成可得肽段（2）的序列为：-Phe-Pro-Lys-Arg-。
（3）由肽段（1）（2）组成可知肽段（3）（Arg2、Cys2、Trp、Tyr）中必有Cys来自链2，另一Cys为链1中8位Cys，因此可知链1中8位Cys与链2中一个Cys之间有二硫键。
（4）嗜热菌蛋白酶能水解Tyr、Phe等疏水氨基酸残基的N端，故肽（Cys2、Phe）来自链2，结合肽段（3）含Tyr，可知形成的二硫键为链1中8位Cys与链2中3位Cys之间，肽段（4）中（Cys2、Phe）说明链2中1位Cys与5位Cys之间有二硫键。
综上可得该多肽中二硫键位置如图4-2所示，
图4-2
7一个十肽的氨基酸分析表明其水解液中存在下列产物：
并观察下列事实：（1）用羧肽酶A和B处理该十肽无效；（2）胰蛋白酶处理产生两个四肽和游离的Lys；（3）梭菌蛋白酶处理产生一个四肽和一个六肽；（4）溴化氢处理产生一个八肽和一个二肽，用单字母符号表示其序列为NP；（5）胰凝乳蛋白酶处理产生两个三肽和一个四肽，N-末端的胰凝乳蛋白酶水解肽段在中性pH时携带-1净电荷，在pH12时携带-3净电荷；（6）一轮Edman降解给出下面的PTH衍生物：
图4-3
写出该十肽的氨基酸序列。
答：（1）该十肽的氨基酸序列为：Ser-Glu-Tyr-Arg-Lys-Lys-Phe-Met-Asn-Pro。
（2）具体分析过程如下：
①羧肽酶A和B同时作用能释放除Pro以外的任何C-末端残基。用羧肽酶A和B处理十肽无效，说明该十肽C-末端残基为-Pro。
②梭菌蛋白酶只断裂Arg残基的羧基端肽键。由梭菌蛋白酶处理该十肽后得一个四肽和一个六肽，则可知该十肽第4位或第6位为Arg。
③溴化氰只断裂由Met残基的羧基形成的肽键。由其处理该十肽后得一个八肽和一个二肽，说明该十肽第8位或第2位为Met；又用单字母表示二肽为NP，即-Asn-Pro-，故该十肽第8位为Met。
④Edman化学降解法分析N-末端基，根据其降解所得衍生物的结构，可得N—末端氨基酸残基结构式为：—NH-CH（-CH2OH）-C（＝O）—，还原为—NH-CH（-CH2OH）-COOH—，可知此氨基酸残基为Ser；因此该十肽的结构应该为Ser-（ ）-（ ）-（ ）-（ ）-（ ）-（ ）-Met-Asn-Pro。
⑤胰蛋白酶专一断裂Lys或Arg残基的羧基形成的肽键，该十肽经胰蛋白酶处理产生两个四肽和游离的Lys，因此②中的Arg只有位于第4位，才能形成两个四肽和游离的Lys，第5位、第6位只能为Lys，即十肽为Ser-（ ）-（ ）-Arg-Lys-Lys-（ ）-Met-Asn-Pro。
⑥胰凝乳蛋白酶断裂Phe、Trp和Tyr等疏水氨基酸残基的羧基端肽键，处理该十肽后，产生两个三肽和一个四肽，结合该多肽的氨基酸残基组成，可得该十肽第3位或第7位为Tyr或Phe，第2位为Glu或Gln。
⑦由N-末端的胰凝乳蛋白酶水解肽段在中性pH时携带-1净电荷，在pH12时携带-3净电荷，可知第2位应为Glu，第3位为Tyr，所以此十肽的第7位为Phe。
综上所述可知该十肽的氨基酸序列为Ser-Glu-Tyr-Arg-Lys-Lys-Phe-Met-Asn-Pro。
8一个四肽，经胰蛋白酶水解得两个片段，一个片段在280nm附近有强的光吸收，并且Pauly反应和坂口反应（检测胍基的）呈阳性。另一片段用溴化氰处理释放出一个与茚三酮反应呈黄色的氨基酸。写出此四肽的氨基酸序列。
答：（1）此四肽的氨基酸序列为：Try-Arg-Met-Pro。
（2）具体分析过程如下：
①胰蛋白酶专一断裂Lys和Arg残基的羧基形成的肽键。该肽经胰蛋白酶处理后得两个肽段，故该四肽中含Lys或Arg。
②由肽段在280nm附近有强的光吸收且Pauly反应和坂口反应呈阳性，可知该肽段含Tyr和Arg。
③溴化氰专一断裂Met残基的羧基形成的肽键。另一肽段用溴化氰处理后得到与茚三酮反应呈黄色的氨基酸，故肽段序列为-Met-Pro-。
综上可得该四肽的氨基酸序列为Try-Arg-Met-Pro。
9蜂毒明肽（apamin）是存在蜜蜂毒液中的一个十八肽，其序列为CNCKAPETALCARRCQQH，已知蜂毒明肽形成二硫键，不与碘乙酸发生反应。
（1）问此肽中存在多少个二硫键？
（2）请设计确定这些（个）二硫键位置的策略。
答：（1）卤化烷试剂碘乙酸能与巯基发生反应，该多肽不与碘乙酸发生反应说明此肽中不含游离的—SH，且其序列组成有4个—Cys残基，所以应存在两个二硫键。
（2）二硫键的位置可能有3种情况：
①1位Cys与3位Cys之间和11位Cys与15位Cys之间；
②1位Cys与11位Cys之间和3位Cys与15位Cys之间；
③1位Cys与15位Cys之间和3位Cys与11位Cys之间。
第①种情况，用胰蛋白酶断裂将得到两个肽段和游离的Arg；第②种和第③种，用胰蛋白酶处理将得到一个肽段和Arg；通过二硫键部分氧化可以把后两种情况区别开来。
10叙述用Merrifield固相化学方法合成二肽Lys-Ala。如果你打算向Lys-Ala加入一个亮氨酸残基使成三肽，可能会掉进什么样的“陷坑”？
答：（1）Merrifield固相化学方法合成二肽Lys-Ala：
①将Ala先和氯甲基聚苯乙烯树脂反应，共价的挂接在树脂上；
②除去Ala的N-末端保护基，使Lys（其氨基预先用叔丁氧甲酰基保护）以DCC为缩合剂，接到Ala的氨基上；
③将树脂悬浮在无水三氟乙酸中，通入干燥的HBr，使肽与树脂脱离，同时切除一些保护基，即完成合成。
（2）Merrifield的方法可以使肽链按控制顺序从C端向N端延长，由于Lys的侧链含有一个—NH3＋，所以新加入的Leu可能被接在Lys的侧链残基上。