第三节 实验室灭菌、消毒技术
消毒与灭菌是两个不同的概念，消毒是通过物理或化学方法杀死或除去部分微生物，如病原微生物、微生物营养体等，而对于芽孢或孢子则不起作用，因此它是部分和表面的；而灭菌是通过物理或化学方法杀死或除去所有的微生物，因此它是全部和彻底的。
一、物理方法
常用于消毒灭菌的物理因素有热力、紫外线、电离辐射、超声波、微波、等离子、超声波、过滤等。
高温可使微生物细胞内的蛋白质和酶类发生变性而失活，从而起到灭菌作用，所以利用高温进行灭菌是实验室最常用而又方便有效的方法。常用的高温灭菌方法可以分为干热灭菌法和湿热灭菌法。
干热灭菌法有灼烧灭菌法和干热空气灭菌法。灼烧灭菌也称灼烧灭菌，是直接用火焰把微生物烧死，灭菌简便、彻底、迅速、可靠，但使用范围有限，常用于各种金属的接种工具、镊子、试管口、瓶口、棉塞等的灭菌。对于玻璃、瓷制品，灼烧前应充分干燥，以免炸裂。利用酒精灯灼烧灭菌玻璃品时，由于酒精燃烧会产生水，灼烧时间过长容易使玻璃炸裂。干热空气灭菌法是利用烘箱热空气进行烘烤灭菌，操作时逐渐升温至140～160℃，保持2～3 h即可达到灭菌目的。干热空气灭菌具有速度快、方便，是实验室中常用的一种方法，但仅适用于金属、玻璃器皿，不适用于培养基和塑料等器皿。
湿热灭菌法是指用饱和水蒸气、沸水或流通蒸汽进行灭菌的方法，以高温高压水蒸气为介质，由于蒸汽潜热大，穿透力强，容易使蛋白质变性或凝固，最终导致微生物的死亡，所以该法的灭菌效率比干热灭菌法高，是实验室和大规模生产过程中最常用的灭菌方法。在同样的温度下，湿热灭菌的效果比干热灭菌好，这是因为一方面细胞内蛋白质含水量高，容易变性；另一方面高温水蒸气对蛋白质有高度的穿透力，从而加速蛋白质变性而迅速死亡，因此灭菌效力高。湿热灭菌法可分为：巴氏消毒法、煮沸灭菌法、流通蒸汽灭菌法、间歇蒸汽灭菌法和高压蒸汽灭菌法，其中高压蒸汽灭菌法是最常用的灭菌法。
高压蒸汽灭菌的原理是：水的沸点随压力的增加而提高。把待灭菌的物品放在一个可密闭的加压蒸汽灭菌锅中，当水在密闭的容器中煮沸时，其蒸汽不能逸出，致使压力增加，水的沸点和温度也随之提高。在蒸汽压达到103.4 kPa时，加压蒸汽灭菌锅内的温度可达到121℃，在这种情况下，微生物（包括芽孢）在15～20 min便会被杀死，从而达到物品灭菌的目的。如灭菌的对象是砂土、石蜡油等面积大、含菌多、传热差的物品，则应适当延长灭菌时间。
高压蒸汽灭菌在发酵工业、医疗保健、食品检测和微生物学实验室中最为常用，它适用于各种耐热、体积大的培养基的灭菌，也适用于玻璃器皿、工作服等物品的灭菌。在高压蒸汽灭菌中，要引起注意的一个问题是，在恒压之前，一定要排尽灭菌锅中的冷空气，否则表上的蒸汽压与蒸汽温度之间不具对应关系，会大大降低灭菌效果。
在灭菌过程要注意：不同的微生物或同种不同菌龄的微生物对高温的敏感性不同，多数微生物的营养体和病毒在50～65℃，10 min就会被杀死，但各种孢子、特别是芽孢最能抗热，其中抗热性最强的是嗜热脂肪芽孢杆菌，要在121℃，12 min才被杀死，对同种微生物来讲，幼龄菌比老龄菌对热更敏感。微生物的数量多少显然会影响灭菌的效果，数量越多，灭菌时间越长。培养基的成分与组成也会影响灭菌效果。一般地讲，蛋白质、糖或脂肪存在，则提高抗热性；pH在7附近，抗热性最强，偏向两极，则抗热能力下降；而不同的盐类可能对灭菌产生不同的影响；固体培养基要比液体培养基灭菌时间长。灭菌包的大小也会影响灭菌效果，灭菌包不宜过大（以不大于50 cm×30 cm×30 cm为宜），不宜过紧，各包裹间要有间隙，使蒸汽能对流、渗透到包裹中央。
高压蒸汽灭菌对培养基无机盐、碳水化合物、氨基酸、渗压剂、植物激素和培养基渗透压、pH等会产生一定的影响，因此在使用时要考虑高温是否会对培养的营养成分造成破坏。高压蒸汽灭菌对培养基成分的影响主要有以下几个方面：
第一，灭菌后培养基pH普遍下降，主要是由于糖分和其他营养成分在高温下分解为小分子的酸性物质所致。
第二，产生混浊或沉淀，这主要是由于一些离子发生化学反应而产生混浊或沉淀。例如Ca2+与
结合，就会产生磷酸钙沉淀。
第三，不少培养基颜色加深，特别是糖和蛋白质一起灭菌，所以一般葡萄糖是采取单独灭菌，然后按需要浓度添加。
第四，体积和浓度有所变化，特别是延长灭菌时间时这一现象更严重，对于挥发性的液体，如酒精、甲醇不能采用高压蒸汽灭菌。
第五，营养成分有时受到破坏，特别是生物素和生长激素等不耐高温的物质，不适合高压蒸汽灭菌。
使用高压灭菌锅前除了认真阅读使用说明书外，还需注意：①每次使用前检查灭菌锅内的水量，向锅内加水以达水位标记为度，切忌空烧或加水不足，中途烧干而引起爆炸事故。②正确叠放物料：放入锅内灭菌的培养基、物料等，在叠放时需留缝隙，使蒸汽畅通，若叠放紧密，将阻碍蒸汽穿透，物料内外温度不均匀，造成“死角”，致使灭菌不彻底。布类物品应放在金属类物品上，否则蒸汽遇冷凝聚成水珠，使包布受潮，阻碍蒸汽进入包裹中央，严重影响灭菌效果。③排尽冷空气：加热灭菌时打开排气阀，使锅内冷空气排出，当水沸腾有大量蒸汽冲出时再关闭排气阀。若灭菌锅内留有冷空气，受热后它很快膨胀，压力上升，使压力与温度产生差异，即压力高、温度低，形成假性蒸汽压，造成灭菌不彻底。④灭菌后自然降压：灭菌结束后任其自然缓慢降温减压，若排气减压太快，锅内产生负压，会使瓶、袋内压力瞬时大于锅内压力，造成料袋鼓气膨胀拉薄、胀破，或棉塞沾污、脱落等情况发生。灭菌时棉塞被冷凝水弄湿，则失去滤菌目的，同时易导致霉菌滋生。为防止潮湿，棉塞应朝外或朝上放置，避免与锅壁接触而被壁周下流的冷凝水沾湿，也可在瓶口上包扎薄膜或套上小型塑料袋。
过滤灭菌是利用滤材阻留作用除去微生物的方法，它是利用细菌不能通过一定孔径滤器的性质，将液体或气体用加压或减压的方法，通过微孔滤器，滤除细菌。过滤灭菌不能杀灭微生物及其芽孢，所以过滤灭菌法称为滤过除菌法更为科学。
过滤法除菌常用于空气过滤和某些加热易挥发（如甲醇、乙醇等）或改变性质的液体（如生物素、抗生素等）的除菌。其效果取决于过滤材料的结构、特性、滤孔大小等因素，过滤除菌应选择孔径小于1μm的滤器。滤器的种类很多，可分为液体滤器和空气滤器。
空气过滤除菌的原理是微粒随气流通过滤层时，由于滤层纤维的层层阻碍，使气流出现无数次改变运动速度和方向的绕流运动，引起微粒与滤层纤维间产生惯性冲击、拦截、布朗扩散、重力沉降、静电引力等作用，进而把微粒滞留在纤维表面上，实现过滤的目的。灭菌过的容器一般用棉花塞堵在出口处，实际上就是起到过滤除去空气中的微生物，使进入容器的空气中没有微生物污染的作用。微生物学实验室使用的超净台也是用空气过滤法除菌。
用于空气过滤的介质有纤维状物或颗粒状物、过滤纸、微孔滤膜等各种类型。纤维状或颗粒过滤介质主要有棉花、玻璃纤维、活性炭等，棉花是较常用的空气过滤介质，要求有弹性，纤维长度适中；玻璃纤维直径小，不易折断，过滤效果好；活性炭要求质地坚硬，颗粒均匀。纤维状或颗粒过滤介质简单，经济实用，但存在体积大，装填费时费力，松紧度不易掌握，空气压降大等缺点。纸类过滤介质主要是玻璃纤维纸或有机合成纤维，6张叠在一起使用，过滤效率高，压降小，缺点是强度不大，在受潮后更是如此。微孔滤膜类过滤介质的空隙小于0.5μm，甚至小于0.1μm，能将空气中的细菌真正滤去，也即绝对过滤，绝对过滤易于控制过滤后的空气质量，节约能量和时间，操作简便。微孔滤膜类过滤介质的价格相对较贵，所以通常在空气过滤之前应将空气中的油、水除去，以提高微孔滤膜类过滤介质的过滤效率和使用寿命。
液体过滤除菌是将要消毒的液体通过致密的过滤材料，以物理阻留的原理，去除其中的微生物。滤膜过滤器是使用最广泛的液体过滤器，滤膜一般由醋酸纤维素、硝酸纤维素、尼龙、多聚碳酸酯、聚偏氟乙烯、聚醚砜树脂（PES）、聚四氟乙烯（PTFE）、陶瓷等合成纤维材料制成。滤膜的孔径一般为0.2μm，它可以滤除绝大多数微生物的营养细胞，过滤法的最大缺点是不能滤除病毒。一般情况下采取正压过滤，正压过滤较之负压过滤具有流速高、过滤快、不易污染、可避免蛋白质产生大量气泡等优点。选择滤膜时要注意膜是否耐酸碱、有机溶剂、高温等。
紫外线灭菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA链的交联，从而抑制了DNA的复制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成[O]，再使O2氧化生成臭氧（O3）或使水（H2O）氧化生成过氧化氢（H2O2）。O3和H2O2均有杀菌作用。紫外线穿透力不大，所以，只适用于无菌室、接种箱、手术室内的空气及物体表面的灭菌，紫外线灯距照射物以不超过1.2 m为宜。为了加强紫外线灭菌效果，在打开紫外灯之前可在无菌室内（或接种箱内）喷洒3%～5%石炭酸溶液，一方面使空气中附着有微生物的尘埃降落，另一方面也可以杀死一部分细菌。无菌室内的桌面、凳子可用2%～3%的来苏水（甲酚溶液）擦洗，然后再开紫外灯照射，即可增强杀菌效果，达到灭菌目的。
紫外线灭菌是用紫外线灯进行的，波长为200～300 nm的紫外线都有杀菌能力，其中以260 nm的杀菌力最强，在波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率与强度、时间的乘积成正比。紫外线杀菌灯管又名外置电极紫外线杀菌灯管，其系统基于电磁感应的原理，即套在灯管外面的电极在接通电源后，在高频高压的情况下，在放电区产生交流磁场，变化的磁场会在灯管内产生感应电流，在含汞的情况下，使低压汞和惰性气体的混合蒸气产生放电，辐射出紫外线。紫外线杀菌灯的发光谱线主要有254 nm和185 nm两条。254 nm紫外线通过照射微生物的DNA来杀灭细菌，185 nm紫外线可将空气中的O2变成O3，臭氧具有强氧化作用，可有效地杀灭细菌，臭氧的弥散性恰好可弥补由于紫外线只沿直线传播、消毒有死角的缺点。
一般紫外灯管都采用石英玻璃制作，因为石英玻璃对紫外线各波段都有高达80%～90%的透过率，是做杀菌灯的最佳材料。石英玻璃在炼制的时候，如果添加足够数量的钛（Ti）元素，就能使透过它的紫外线在200 nm以下发生截止，而对254 nm紫外线透过基本无影响。适当控制钛元素的添加量，就可有效地控制185 nm紫外线的逸出量，根据这一特点，紫外灯管可以制作成低臭氧（无臭氧）、臭氧、高臭氧等三种紫外线杀菌灯管。石英玻璃与普通玻璃在性能上有很大的差别，主要是热膨胀系数不同，一般不能封接铝盖灯头，所以石英玻璃紫外灯管的灯头材质多采用胶木、塑料或陶瓷灯头，而普通玻璃用铝盖灯头。
除了石英玻璃紫外灯管，因成本关系与用途不同，市场上还有高硼砂玻璃紫外灯管和普通玻璃紫外灯管。高硼砂玻璃成本较低，但其紫外线穿透率＜50%，在性能上远比不上石英玻璃紫外灯。高硼玻璃灯管的紫外线强度很容易衰减，灯管使用数百小时后紫外线强度就大幅下降，仅为初始时的50%～70%。而石英灯管在使用2000～3000 h后，紫外线强度只减到初始时的80%～70%，光衰程度远远小于高硼灯。普通玻璃的紫外线穿透率比高硼玻璃要高得多，比石英玻璃略低，但光衰比石英玻璃紫外灯大，并且不能产生臭氧。
各种微生物对紫外线的耐受力有区别，如真菌孢子对紫外线耐受力最强，细菌芽孢次之，最微弱的是微生物营养体。紫外线属低能量的电磁辐射，穿透力很差，因此它一般仅限于物体表面和空气杀菌。由于紫外线会杀死细胞，因此紫外线消毒时要注意不能直接照射到人的皮肤，尤其是人的眼睛，最易受伤的部位是眼睛的眼角膜，紫外线杀菌灯点亮时不要直视灯管，由于短波紫外线不能透过普通玻璃，因此，必须要看时，应用普通玻璃（戴眼镜）或透光塑胶片作为防护面罩。如果不小心眼睛受伤，一般情况也无关大碍，就像被太阳光灼伤一样，严重的可滴眼药水或人乳，帮助复原。在有人的场合，不要使用有臭氧灯管，臭氧浓度高时会对人体产生一定的伤害。
紫外线对工作环境的温度和湿度有一定的要求：在20℃以上，照射强度较稳定；在5～20℃之间，随温度的上升照射强度增加；相对湿度60%以下时，杀菌能力较强，湿度增至70%时，微生物对紫外线的敏感性降低，湿度增至90%时，杀菌力衰减30%～40%。对水进行消毒时，水层厚度均应小于2 cm，水流动时接受90000μW·s/cm2以上的照射剂量才能使水达到有效消毒。
紫外灯管和套管表面有灰尘和油污时，会阻碍紫外线透过，因此，要保持灯管的洁净。灯管启动时，加温至稳定状态需数分钟，端电压较高。关闭后若立即重开，常常较难启动，且易损坏灯管并减少灯管使用寿命，故一般不宜频繁启动。
二、化学方法
化学方法就是利用化学药物渗透细菌的体内，使菌体蛋白凝固变性，干扰细菌酶的活性，抑制细菌代谢和生长或损害细胞膜的结构，改变其渗透性，破坏其生理功能等，从而起到消毒、灭菌作用。一般化学药剂无法杀死所有的微生物，而只能杀死其中的病原微生物，所以起到的是消毒剂，而不是灭菌剂的作用，所用的药物称化学消毒剂。有的药物杀灭微生物的能力较强，可以达到灭菌，又称为灭菌剂。但是一种化学药物是杀菌还是抑菌，常不易严格区分。有的消毒剂在低浓度时也能杀菌，如1:1000硫柳汞。由于消毒剂没有选择性，因此对一切活细胞都有毒性，它不仅能杀死或抑制病原微生物，而且对人体组织细胞也有损伤作用，所以化学方法只能用于体表、器械、排泄物和环境的消毒。常用的化学消毒剂有：石炭酸、来苏水（甲酚溶液）、氯化汞、碘酒、酒精等。化学消毒灭菌剂的选择要根据物品的性能及病原体的特性，并要严格掌握消毒剂的有效浓度、消毒时间和使用方法。
常用化学消毒灭菌方法有：
①浸泡法。选用杀菌谱广、腐蚀性弱、水溶性消毒剂，将物品浸没于消毒剂内，在标准的浓度和时间内，达到消毒灭菌目的。
②擦拭法。选用易溶于水、穿透性强的消毒剂擦拭物品表面，在标准的浓度和时间里达到消毒灭菌目的。
③熏蒸法。加热或加入氧化剂，使消毒剂呈气态，在标准的浓度和时间里达到消毒灭菌的目的。该法适用于室内物品及空气消毒，或精密贵重仪器和不能蒸、煮、浸泡的物品的消毒。常用于熏蒸法的试剂有纯乳酸和食醋，也可用甲醛或过氧乙酸等进行熏蒸消毒。
④喷雾法借助普通喷雾器或气溶胶喷雾器，使消毒剂产生微粒气雾弥散在空间，进行空气和物品表面的消毒。
⑤环氧乙烷气体密闭消毒法。将环氧乙烷气体置于密闭容器内，在标准的浓度、湿度和时间内达到消毒灭菌目的。