第一节 NGS对肺癌分子病理学及诊断的检测分析

1．发现新的肺癌相关基因

我们都已经认识到，肿瘤的发生是多种遗传学变异累积的结果，这些变异可能是遗传性改变也可能是体细胞的突变。原癌基因的激活、抑癌基因的失活以及DNA修复基因的异常都会导致细胞脱离正常的生长调控，进而发展成肿瘤。原发肿瘤的增殖进化可能会引发更多的遗传学改变，克隆扩增产生出具有侵袭力的肿瘤细胞亚群，进而转移至全身各个脏器，最终导致个体死亡，即为“肿瘤分支进化生长”理论。2017版美国国立综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network, NCCN）指出，可以利用NGS检测相关基因突变并进行遗传咨询。在过去的十年间，NSCLC驱动基因的检测取得了显著进展，尤其是肺腺癌，约60%的驱动基因被确定，肺鳞癌驱动基因的检出率也在逐年提高。有研究还报道了罕见驱动基因突变。如Vaishnavi等利用NGS技术检测了35例泛阴性（EGFR-/KRAS-/ALK-/ROS1-）的肺腺癌样本，发现了新的NTRK1融合基因，体外实验也证实其具有致癌性，表明 NTRK1融合基因可能是新的肺腺癌驱动基因[1]。

2．肺癌早期诊断

Izumchenko E等人应用NGS技术对非典型腺瘤样增生、原位腺癌和微浸润腺癌组织的进展区域进行检测评估，分析肺腺癌发生过程中与驱动基因相关的遗传信息变化，揭示腺癌早期就会出现基因的克隆扩增。另外还鉴定出一些有效的遗传信息改变，如KRAS基因突变、p53和EGFR的活性缺失，这些驱动基因可能会使局部扩增的亚克隆向恶性方向发展，提示在肺部恶性肿瘤形成的任一阶段，都有可能出现基因突变。通过NGS鉴定肺癌前期病变位点的基因突变，可使肺癌防治前移至预防阶段，并能提高肿瘤的确诊率，有利于进一步制订正确的治疗策略，避免疾病进展[2]。

3．识别可用药的分子靶标

应用NGS测序可对肺癌进行精准分子分型，指导靶向治疗。不同病理类型的肺癌，基因突变谱明显不同，精准医疗模式下更依赖于基因检测的结果。2017版NCCN指南推荐检测的基因包括：EGFR、BRAF、MET、ALK、ROS1、RET和HER2。相比传统的检测方法如免疫组化法、荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）和突变扩增阻滞系统（amplification refractory mutation system, ARMS）, NGS可同步检测多个基因及其不同的突变形式（点突变、融合、扩增）。与含铂类的细胞毒性化疗方案相比较，EGFR-TKI治疗能使EGFR突变的晚期肺癌患者获得更高的反应率和更长的无进展生存期。但是EGFR 突变有很多种，包括经典的19-Del和L858R，以及非经典的G719X、L861Q、S768I等，不同的突变获得的疗效也不尽相同。研究表明， EGFR-TKI对19-Del突变患者的疗效要显著优于L858R突变组。除G719X和L861Q外，其他非经典的EGFR 突变均对一代TKI不敏感，需要使用二代TKI。类似的情况还出现于ALK的突变。ALK 抑制剂对有ALK 重排的NSCLC患者显示出良好的疗效，但ALK 重排同样有很多形式，例如棘皮动物微管相关类蛋白-4（echinoderm microtubule associated protein like 4, EML4）基因与ALK 基因的重排（EML4-ALK）的不同变体对克唑替尼的敏感度各不相同。肺癌突变协会报道含有明确突变的患者采用特定的分子靶向治疗，相比不含这些特定突变的人群具有更好的预后，也印证了识别、靶向致病性分子变异的必要性。临床中，NGS技术检测基因突变位点的应用正日益增多。由美国国家癌症研究所资助的Lung-MAP临床试验中，研究人员正在探索利用NGS技术的多基因分析来指导分子靶向治疗。英国发起的一项国家肺基质试验，同样也是应用NGS技术对单个或联合的遗传学标志物进行检测分析，然后依据检测结果将NSCLC患者分成21个亚组进行靶向治疗[3]。

4．鉴定耐药机制，调整治疗策略

由于靶向药的独特作用机制和肺癌的不断进化，靶向治疗的患者从一开始就面临继发耐药的风险。第一代EGFR-TKI出现耐药主要是继发T790M突变（50%~65%）[4]，目前已经可以采取第三代TKI奥西替尼进行治疗（反应率超过2/3），但第三代TKI同样面临获得性耐药的问题。Thress KS等研究团队通过NGS检测7个奥西替尼继发耐药的NSCLC患者，发现了新的耐药机制——EGFR-C797S突变[5]。基础研究显示，C797S和T790M突变的结构关系都可以分为反式和顺式。如果两种突变位于 EGFR 两个不同的等位基因上（反式），患者会表现出对第三代TKI耐药，但对第一代和第二代TKI联合用药敏感；如果两者位于EGFR的同一条等位基因上（顺式），那么所有的TKI无论单独或联合用药均不能产生效果。另外一种情况，如果是野生型T790M突变的患者又出现了C797S突变，则表现为对第三代TKI耐药，但对第一代TKI敏感[6]。由此可见，NGS有助于解析复杂的耐药机制，并能精准指导后续用药选择。2016年，Nature 上就有报道，通过NGS检测分析，有针对性的联合使用EGFR酪氨酸激酶别构抑制剂EAI045与西妥昔单抗，在体外L858R/T790M、L858R/T790M/C797S细胞模型和动物实验中均显示出有效的抗肿瘤活性[7]。

5．预测免疫治疗反应

免疫靶向治疗是对抗肺癌的重要武器之一。《NCCN临床实践指南：非小细胞肺癌》（2017.V6）提出，PD-1拮抗剂派姆单抗被推荐用于PD-L1阳性（＞50%）, EGFR、ALK、ROS1 阴性或基因突变状态无法确定的晚期NSCLC的一线药物治疗（Ⅰ类证据）。但目前与PD-1/PD-L1治疗相关的有效预测因子并不明确。Rizvi及其团队在研究中利用NGS技术发现抗PD-1治疗的预后与吸烟及肿瘤突变负荷（tumor mutation burden, TMB）有关[8]。NGS作为检测TMB的主要技术手段，在预测免疫治疗反应以及定制个体化免疫治疗方面具有深远意义。

6．循环肿瘤标志物的应用

肿瘤具有异质性，单一部位的组织活检信息并不能说明肿瘤的整体状态，但要对患者体内的每处肿瘤组织都进行取样几乎是不可能的。此外，由于年龄、血液系统等因素的限制，一些患者也不适合做组织活检。不过随着科技进步和计算机生物信息技术的发展，现在已经可以采用高灵敏的NGS技术来检测肺癌患者血浆及体液中游离DNA（cell-free DNA, cfDNA）的体细胞突变和拷贝数变异。有研究显示，与健康人或者慢性呼吸系统炎症患者相比，NSCLC患者血浆中含有更高浓度的cfDNA。循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）是cfDNA的一种，它是肿瘤细胞释放到外周循环中的基因组片段，携带有肿瘤特异的遗传信息，对其进行基因检测分析也近似于检测肿瘤本身分子层面的变化。相比传统的组织活检，非侵袭性的cfDNA液体活检具有操作方便、检测周期短等优势，并且可以实时、动态、纵向追踪晚期患者的肿瘤负荷及驱动基因突变情况，检测治疗过程中可作用的分子靶点和抵抗性亚克隆，以便及时切换治疗方案，也避免了重复组织活检等问题。

很多临床试验都已经证实，NGS技术能对血浆中的ctDNA进行高敏感度、高特异性的检测，其在液体活检中扮演着日益重要的角色。目前已经开发出很多超高灵敏度的NGS技术，比较具有代表性的是深度测序肿瘤个体化建档法（cancer personalized profiling by deep sequencing, CAPP-seq），灵敏度可达0.02%[9]。该技术采用捕获测序法对NSCLC进行检测，Ⅰ期和Ⅱ~Ⅳ期患者对检测的敏感性分别达到50%和100%，特异性均在96%以上。根据受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve, ROC曲线）计算出的曲线下面积，Ⅱ~Ⅳ期为0.99，所有分期为0.95，说明CAPP-seq具有十分强大的检测能力。靶向错误矫正测序是2017年新发表的技术，此技术采用高精度的NGS方法来检测肿瘤患者血浆中的cfDNA，灵敏度达0.1%~0.2%[10]，检出率超出一般检测方法50%。可见，随着NGS技术的发展，液体活检也有可能应用于早期肺癌的诊断。通过NGS分析循环肿瘤细胞（circulating tumor cell, CTC）和建立人源性肿瘤异种移植模型（patient-derived tumor xenograft, PDX），可以替代临床实践中难以取样的肺癌组织，在一定程度上模拟人体肿瘤的生物学行为，为临床提供可靠的肿瘤体内生长指标。PDX模型还能模拟机体对抗药物的反应，可以起到药物筛选平台的作用，有助于研发新药。

7．研究肺癌进化

英国在2014年启动了关于非小细胞肺癌的大型前瞻性临床研究（TRAcking non-small cell lung Cancer Evolution through therapy therapy [Rx], TRACERx），监测NSCLC患者从诊断到死亡的过程中肿瘤的克隆演化。该研究首先使用多区域外显子测序建立了肺癌的进化树，然后用多重PCR分析突变谱，再通过检测血浆中克隆与亚克隆的单核苷酸变异（single nucleotide variants, SNV）来追踪进化树的分支，结果取得了显著进展，说明利用NGS可以对准确跟踪肿瘤进展中的亚克隆有帮助[11]。

在肺癌发生过程中，DNA甲基化是一个早期事件，甚至在驱动基因突变之前就已产生，可作为肺癌早期筛查的理想标志物。国内有研究人员应用靶向ctDNA甲基化的高通量测序技术，开展了肺部结节辅助诊断的研究。通过对10000个肿瘤特异性CpG甲基化区域进行NGS检测，构建了良恶性肺结节甲基化诊断模型。实验表明该方法在Ⅰa期肺癌检测中的灵敏度可达81.5%，可检测到最小直径为0.5cm的肿瘤，证明在早期肺癌的辅助诊断中使用NGS甲基化检测具有可行性。