第三章 实验室检查

随着科学技术的不断发展，临床检验技术发生了翻天覆地的变化，新的检验技术在医疗、教学以及科研中发挥了重要作用。尤其近些年来开发的新的检验项目在临床诊断、治疗和预防中得到了广泛应用。本章结合骨科专业特点，重点介绍与骨科专业较密切的检验项目。

第一节 与骨科相关的血液学检查

一、骨科常规检查

（一）白细胞计数和分类

1．急性化脓性细菌感染

通常白细胞增加到＞15×109/L，其中＞80%的细胞是粒细胞。另外，核左移是其特征性的表现，且有时候是其唯一的特征。

2．组织坏死和无菌性炎症

粒细胞计数仅有轻度上升，核左移少见。

3．慢性炎症

正常的白细胞计数或轻度上升，常是单核细胞增多。

（二）红细胞沉降率

红细胞沉降率（erythrocyte sedimentation，ESR）简称血沉，是传统且应用较广的指标，用于诊断疾病时虽然缺乏特异性，但操作简单，具有动态观察病情、监测疗效的价值。

二、关节液及脑脊液检查

（一）关节液检查

检查关节液的目的主要是了解关节状况与其相对应疾病之间的联系，以及区分炎性渗出和非炎性渗出，以便做出排除诊断。

1．采集标本要求

标本采集应使用普通肝素进行抗凝（使用肝素锂和草酸盐抗凝易导致关节液形成结晶，从而造成显微镜镜检出现假阳性），并及时送检。

2．检查内容

（1）常规检查：

外观（体积、颜色、透明度、黏滞度）、黏蛋白凝块形成试验、pH。

（2）特殊检查：

1）临床生化检查：

总蛋白、葡萄糖、乳酸、尿酸、酶。

2）血液学检查：

细胞计数、细胞分类。

3）显微镜检查（关节液原液）：

①变性细胞：在细胞浆内它们含有淡绿色至橄榄绿色颗粒，这些颗粒含有免疫球蛋白、类风湿因子、纤维蛋白质和抗核因子。②结晶体的观察：除一般生物光学显微镜检查外，最好用偏振光显微镜作鉴定。临床常见尿酸盐、焦磷酸钙磷灰石、脂类和草酸钙结晶。③淀粉样蛋白：可发现含有淀粉样蛋白的滑膜内壁细胞碎片。

（3）免疫化学检查：

类风湿因子、抗核因子、免疫球蛋白、补体、细胞因子。

（4）细菌学检查：

革兰染色、培养。

3．临床意义

关节液检查的临床价值在于区分为四大类型：非炎性渗出液、炎性渗出液、化脓性渗出液、损伤性渗出液。通过上述检查进行关节疾病的鉴别诊断。

（二）脑脊液检查

1．适应证

凡有以下条件之一者，为进行脑脊液检查的适应证：①有脑膜刺激症状；②疑有颅内出血时；③有剧烈头痛、昏迷、抽搐或瘫痪等症状和体征而原因不明者；④疑有脑膜白血病；⑤中枢神经系统疾病进行椎管内给药治疗、手术前进行腰麻、造影等。

2．标本采集

将抽取的脑脊液分别收集于3个无菌小瓶中，每瓶2～3ml，第一瓶因可能含少量红细胞，宜做细菌学检查；第二瓶做化学或免疫学检查；第三瓶做细胞计数。标本采集后立即送检，以免因放置过久细胞破坏、葡萄糖分解或形成凝块等影响检查结果。

3．检查内容

（1）理学检查：

1）颜色正常：

脑脊液为无色水样透明液体，在病理情况下，可呈不同颜色改变。

2）透明度正常：

脑脊液清晰透明。当含较多的细胞或细菌时则可变为混浊，混浊程度因细胞量或性质不同而异。

3）凝固物正常：

脑脊液不含纤维蛋白原，因此不会凝固。当脑脊液中有炎症渗出物时，因纤维蛋白原和细胞数增多而形成凝块。

（2）化学检查：

蛋白质、葡萄糖、氯化物、酶学检查。

（3）显微镜检查：

1）白细胞计数及分类：

计数正常脑脊液中无红细胞，仅有少数白细胞，外伤及穿刺损伤血管时脑脊液中可有不同数量的红细胞出现。

2）细胞学检查：

以离心沉淀涂片、玻片离心法或醋酸纤维膜浓集法收集脑脊液中的细胞成分，可提高肿瘤细胞的检出率。

（4）细菌学检查：

正常脑脊液中无细菌，在中枢神经系统感染时可找到相应的病原菌。

1）直接涂片法标本要求：

用无菌管留取，常温下，15分钟内送到实验室。将脑脊液离心制成涂片，经革兰染色查找脑膜炎奈瑟菌，肺炎球菌等，经抗酸染色查找结核分枝杆菌，墨汁染色查找新型隐球菌。

2）细菌培养标本要求：

最好在用药之前采集标本，如果标本量较多，可将标本注入血培养瓶中；如果标本量较少，常温下15分钟内送到实验室，不得将标本放入冰箱中保存。

三、骨科血凝学检查

骨科手术是临床引起静脉血栓栓塞（venous thromboembolism，VTE）最常见的原因，静脉血栓栓塞可分为深静脉血栓和肺栓塞。手术激活凝血及术后制动导致静脉瘀滞引起，很多影响因素如炎症、肿瘤、遗传性易栓症、抗磷脂综合征、激素替代治疗、化疗都是静脉血栓形成的危险因素。且大多数静脉血栓患者是没有症状的，有症状VTE∶无症状VTE=1∶10。

骨科患者术后存在高血栓发生风险，这种风险可以持续增加到术后90天左右，预防性抗凝治疗可以显著降低静脉血栓的发生率（见图2-3-1，图2-3-2）。静脉血栓的不良结局是形成肺栓塞导致患者死亡。

（一）高凝状态指标

大量证据表明骨科患者术后存在高凝状态，其原因应该是由于手术激活了凝血系统，同时抗凝系统消耗、纤溶能力不足等。患者是出血还是血栓形成，取决于凝血-抗凝-纤溶系统的平衡，以及血管及血小板功能。所以评价术后患者凝血状况，有助于早期发现高凝患者，防止血栓形成。评价凝血状态，应使用综合性指标，即整体实验（globle test）。主要的整体实验有血栓弹力图、TAT。另外，反应凝血激活的实验还有游离纤维蛋白单体FM，组织因子微颗粒、纤溶系统活化标志t-PAIC、PAP、D二聚体等。下面分别介绍。

1．血栓弹力图

采用微量全血，体外实验模拟体内凝血状态。承载血样的测试杯以4°45'的角度左右旋转。连接于悬垂丝的杯盖置于血液标本中。当血液是液态时，测试杯的转动不会影响杯盖；凝血块一旦形成，将杯盖和测试杯连为一体，测试杯的旋转带动杯盖和悬垂丝一起转动，悬垂丝在旋动过程中切割磁力线产生电流，将悬垂丝的扭力转化为电信号，电脑软件处理后，便形成，TEG曲线（图2-3-3）。

（1）样品类型：

TEG检测可选择如下两种样品类型：①自然全血：未加抗凝剂的全血，取样后4分钟内进行检测；②枸橼酸化全血：以3.2%的枸橼酸钠抗凝管采取枸橼酸抗凝血。

（2）TEG主要技术参数：

见图2-3-4。

1）R值：

反应时间，指从检测开始到第一块纤维蛋白凝块形成（描记图幅度达2mm）所需的时间，主要反映凝血因子的功能。R值能因抗凝药及凝血因子缺乏而延长，因血液呈高凝状态而缩短。

2）K值：

凝血块的形成时间，指从R值终点至描记图幅度达20mm所需的时间，是凝血块形成初期动力学指标。K值的长短主要受纤维蛋白原影响，K值因纤维蛋白原水平增高而缩短；因纤维蛋白原缺乏或功能不足而延长。

3）α角（angle角）：

凝血块生成速率，指从描记图分叉点至最大曲线弧度作切线与水平线的夹角，是凝血块形成初期动力学指标，与K值密切相关，反映凝血块形成的速率。当患者处于严重低凝状态时，凝血块幅度达不到20mm，此时K值无法确定。因此，α角比K值更有价值。α角的大小主要受纤维蛋白原影响，α角因纤维蛋白原水平增高而增大；因纤维蛋白原缺乏或功能不足减小。

4）MA值：

TEG描记图的最大振幅（mm），反映血小板和纤维蛋白形成的最大凝血块强度。MA值主要受血小板影响，MA值减小提示血小板缺乏或血小板功能低下；MA值增高提示血小板功能增强。

5）LY30：

在MA值确定后30分钟内凝血块溶解百分比（%），反应凝血块的纤溶活性。LY30增大提示纤溶亢进。

6）EPL：

LY30的预估值（%），EPL增大提示纤溶亢进。

7）TEG-ACT：

为Rapid TEG检测所特有参数，通过TEG R值计算出TEG-ACT的值。TEGACT值因抗凝药及凝血因子缺乏而延长，因血液呈高凝状态而缩短。

不同类型的血液标本，TEG的参数名称相同，但正常值范围不同（表2-3-1）。

2．凝血酶-抗凝血酶复合物

凝血酶作用于纤维蛋白原时，纤维蛋白原转变成纤维蛋白而形成血栓。如果能够评价凝血酶的产生量，即可了解凝血激活的程度。由于产生的凝血酶在血液中半衰期极短，只有几秒钟，很快就会被抗凝物质中和掉，故直接测定凝血酶非常困难，取而代之的便是检测凝血酶和其代表性抑制因子抗凝血酶（AT）1∶1结合的凝血酶-抗凝血酶复合物（TAT）。TAT的产生直接证实了凝血系统的启动，而血栓形成的前奏是凝血系统的激活和抗凝系统的消耗，因此TAT的检测可以早期预测血栓的形成和复发。

（1）样本采集及影响因素：

1）在采血极为困难的患者，采血花费时间长的标本，有时出现TAT呈高值的假象。

2）使用新鲜的枸橼酸钠血浆作为样本，避免反复冻融。

（2）参考区间：

不同检测系统参考区间有差异，TAT的参考区间通常为＜4.0ng/ml，各实验室引用参考区间时应进行验证，必要时建立本实验室的参考区间。

（3）临床意义：

TAT升高见于DIC、DIC前状态；深部静脉血栓症（DVT）、肺栓塞（PE）；部分房颤、二尖瓣狭窄症合并房颤；其他凝血激活状态，提示血栓风险。但是用华法林进行抗凝血疗法时，TAT可能会降至正常下限。

在大量胸腔积液及大量腹水潴留的患者，FDP及 D-二聚体增高，有时难以判定是否是DIC。此时，TAT如果正常，可考虑排除DIC。

3．纤溶酶-α2纤溶酶抑制物复合物

纤溶酶是纤溶系统的关键因子，其本身不被激活，在血液中半衰期又极短，故不能被直接测定。肝脏产生的α2纤溶酶抑制物（α2 plasmin inhibitor，α2 PI）是纤溶酶最重要的抑制因子，α2 PI与血液中存在的纤溶酶以1∶1的比例迅速结合，形成纤溶酶-α2纤溶酶抑制物复合物（plasmin-antiplasmin，PAP），抑制纤溶。因此，PAP是忠实反映纤溶状态的纤溶系统分子标志物，可评价机体内纤溶激活的程度。PAP在血液中的半衰期较长，为6小时，可以被直接测定。

（1）样本采集及影响因素：

1）在采血极为困难的患者，采血花费时间长的标本，有时出现假高值的现象。

2）使用新鲜的枸橼酸钠血浆作为样本，避免反复冻融。

（2）参考区间：

不同检测系统参考区间有差异，PAP的参考区间通常为＜0.8μg/ml，各实验室引用参考区间时应进行验证，必要时建立本实验室的参考区间。

（3）临床意义：

PAP升高见于DIC、DIC前状态；DVT、PE等血栓性疾病的早期诊断。PAP的监测还可用于心肌梗死等易栓患者的血栓再复发的监测；进行纤溶疗法（t-PA、尿激酶）时，抗凝治疗监测等。

4．组织型纤溶酶原激活剂-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物

组织型纤溶酶原激活剂-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物（tPAI·C）是由血管内皮细胞释放到血液中的t-PA，与生理性抑制因子PAI-1迅速以1∶1比例结合而形成的。血液中PAI-1浓度为t-PA浓度的5倍，远远高于t-PA，可认为释放到血液中的t-PA几乎都与PAI-1形成了复合物，因此tPAI·C是纤溶系统的分子标志物。血管内皮细胞受到损害时，t-PA和PAI-1都被释放，同时tPAI·C也是反映血管内皮细胞指标的分子标志物。

（1）样本采集及影响因素：

1）t-PA/PAI-1复合物有早晨8时左右呈最高值、下午到傍晚呈低值的倾向，因此采血时间要固定。

2）因血浆冷冻融化造成检查值有时可能不同，最好避免冷冻融化。

（2）参考区间：

不同检测系统参考区间有差异，tPAI·C的参考区间通常男性＜17.0ng/ml，女性＜10.5ng/ml，各实验室引用参考区间时应进行验证，必要时建立本实验室的参考区间。

（3）临床意义：

tPAI·C升高见于DIC，各种动静脉血栓症（DVT、急性心肌梗死等），是VTE以及心肌梗死的风险指标。血管内皮细胞损伤，tPAI·C也可升高。

以上凝血酶-抗凝血酶、纤溶酶-α2纤溶酶抑制物复合物、组织型纤溶酶原激活剂-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物的代谢激活过程见图2-3-5。

（二）易栓症

对于静脉血栓的患者，有一部分是由遗传性易栓症引起。对于年轻发病、有家族聚集、反复发生以及少见部位发生的静脉血栓，要考虑易栓症的因素。在我国，易栓症主要是蛋白C（protein C，PC）、蛋白S（protein S，PS）及抗凝血酶缺陷导致。

蛋白C系统包括 PC、PS、血栓调节蛋白（thrombomodulin，TM）和内皮细胞蛋白 C受体（endothelial protein C receptor，EPCR）。蛋白C以无活性的丝氨酸蛋白酶原形式存在于血浆中，PC可与凝血酶或凝血酶-凝血调节蛋白复合物结合而被激活形成活化的蛋白C（activated protein C，APC）。其中后者激活效率高出前者1000～20000倍。活化的PC在PS存在的前提下，选择性切割与灭活磷脂表面的凝血因子Ⅴa和Ⅷa，抑制血液凝固的形成。

1．蛋白C检测

（1）样本采集及影响因素：

枸橼酸钠抗凝全血。

（2）参考区间：

PC：Ag，（102.5±20.1）%；PC：A，（100.24±13.18）%。

（3）临床意义：

蛋白C抗原活性增加：主要见于代偿性增加如冠心病、糖尿病、肾病综合征、妊娠后期等；蛋白C抗原活性减低：可见于先天性PC缺陷和获得性PC缺陷。

1）先天性PC缺陷：

患者表现为反复不明原因的血栓形成。Ⅰ型患者PC：Ag含量与活性均降低，Ⅱ型患者PC：Ag正常而活性降低。

2）获得性PC减少：

常见于DIC、呼吸窘迫综合征，肝功能不全、手术后及口服双香豆素抗凝剂等。

2．蛋白S检测

（1）样本采集及影响因素：

枸橼酸钠抗凝全血，游离PS标本，制备好的上层血浆应当天检测，否则会影响实验结果。

（2）参考区间：

总PS，（96.6±9.8）%；游离PS，（100.9±11.6）%。

（3）临床意义：

PS检测应和PC检测同时进行。PS水平降低，可分为先天性PS缺陷症和获得性PS缺乏。先天性PS缺陷者常伴发严重的深静脉血栓栓塞。单纯PS缺乏患者少见，常与PC缺陷共存。获得性PS缺乏见于DIC、肝功能障碍、口服双香豆素类抗凝药物、妊娠等。

3．抗凝血酶

乙酰肝素-抗凝血酶系统（heparin-antithrombin system）或抗凝血酶系统（antithrombin system）是体内最重要的抗凝系统，它的组成包括抗凝血酶和肝素（heparin）。抗凝血酶（antithrombin，AT）是血液循环中最重要的抗凝物，它是血浆中重要的多功能生理性抗凝因子，主要抑制凝血酶、因子Ⅹa，同时也抑制Ⅶa、Ⅸa、Ⅻa、纤溶酶、胰蛋白酶和激肽释放酶的活性，在体内起着重要的抗凝调节作用。

（1）样本采集及影响因素：

样本采用枸橼酸钠抗凝而不能用肝素抗凝血浆。保存待检血浆从冰箱中取出后应立即置于37℃水浴中予以融化，但不能反复冻融。

（2）参考区间：

AT：Ag，（290±30.2）mg/L；AT：A，（108.5±5.3）%。

（3）临床意义：

1）生物学变异：

不同年龄和性别AT含量和活性不同。新生儿AT：Ag仅为成人的一半，直到出生后6个月才达到成人水平，成年后随年龄增长有降低趋势。青年男性高于青年女性；老年女性比老年男性高。妊娠后期女性的AT含量降低。

2）AT水平增高：

见于某些出血性疾病如血友病、再生障碍性贫血、心瓣膜病伴心力衰竭和肝大患者等；口服抗凝药、黄体酮类药者也可见增高。

3）AT水平减低：

可分为获得性AT减低和遗传性AT缺乏。

获得性AT减低包括：①合成不足：见于肝功能严重受损患者如肝硬化、重症肝炎、肝癌晚期，常与肝功能受损程度或病情严重程度相关；②丢失增加：常见于肾病综合征，AT活性减低与并发血栓形成有关；③消耗过多：见于血栓前状态和血栓性疾病，如心绞痛、心肌梗死、脑血栓形成，DIC、术后，口服避孕药，DVT或PE、妊娠高血压综合征等。

遗传性AT缺乏分为两型：①交叉反应物质阴性型（CRM-），表现为抗原和活性同时减低；②交叉反应物质阳性型（CRM+），表现为抗原含量正常，但AT活性减低，它是由于AT的结构和功能发生异常导致其对肝素的亲和力降低，对凝血酶或因子Ⅹ的灭活能力明显减弱，因此测定AT：A减低。

（三）抗栓治疗监测

临床常用的抗凝药物有肝素和低分子量肝素，剂量过多会引起出血，现介绍它们的监测方法。

1．普通肝素

普通肝素（unfraction heparin，UFH）是一种从动物中得到的硫酸化多糖，存在于哺乳动物肥大细胞分泌的颗粒中，治疗用肝素常提取自猪小肠黏膜和猪肺，由不同大小的片段构成，平均分子量为12kDa。

肝素的抗凝作用需要抗凝血酶和肝素辅因子Ⅱ的参与，通过抑制凝血因子Ⅱ和Ⅹ产生抗凝作用。

（1）药物作用：

1）加速抗凝血酶和肝素辅因子Ⅱ（HC-Ⅱ）对凝血酶的灭活作用，可提高其灭活作用数百倍到1000倍。

2）增强抗凝血酶对其他活化凝血因子的中和作用，如因子Ⅹa、因子Ⅸa、和因子Ⅺa等。

3）促进内皮细胞释放t-PA，增强纤溶活性。

4）抑制血小板活性，诱导血小板减少。

（2）适应证：

1）用于静脉血栓形成、动脉血栓、各种原因引起的DIC等的综合治疗。

2）预防外科大手术后的血栓形成，如腹部、盆腔、骨科手术后，术后长期卧床者或术前已有血栓前状态者。

3）预防血栓再发生。

4）作为心脏外科、血管外科手术、断肢/断指再植等手术术中抗凝的首选药物。

（3）副作用：

1）出血：

肝素的主要副作用为出血，其发生率约7%～10%，严重出血后果严重，可危及生命。因此，在以下情况禁用或慎用：活动性消化性溃疡、脑血管意外、脑外科手术、恶性高血压、视网膜血管病变、活动性肺结核伴咯血及有其他器官损害性出血风险的疾病、出血性疾病或有出血倾向者、严重心、肝、肾功能不全者等。

2）肝素诱导的血小板减少症（HIT）：

为肝素诱导血小板免疫性活化，伴有严重的急性动、静脉血栓形成。

3）骨质疏松：

可能与长期较大剂量使用肝素有关。

4）过敏反应：

比较少见，与肝素的动物来源有关。

（4）实验室监测：

1）血小板计数：

用药前及用药后每周监测1～2次，若低于50×109/L时需进行肝素诱导的血小板减少症临床风险评估。

2）APTT：

通常在应用肝素6小时后监测APTT。低剂量肝素（每次给药5000～7000IU，每天2次）不需监测；治疗剂量一般将APTT延长至基线水平的1.5～2.0倍；肝素化的患者（血浆肝素浓度＞1IU/ml），应用全血凝固时间（clotting time，CT）或活化凝血时间（activated clotting time，ACT）进行监测。

3）全血凝固时间：

肝素给药前测定CT，给药后定期复查，如给药后CT延长小于给药前2倍，提示肝素用量不足；若达到2倍，提示肝素用量已达标准；若超过2～3倍，提示肝素过量，应调整剂量或停药。

4）抗凝血酶：

主要用于大剂量肝素、持续应用肝素时以及肝素抗凝效果不佳时的监测。由于应用肝素会消耗抗凝血酶（antithrombin，AT），在AT没有恢复时停用肝素，不能有效控制血栓形成的风险。AT＜70%时肝素抗凝作用减低，AT＜50%时抗凝作用明显减低，AT＜30%时抗凝药物无效。

2．低分子肝素

低分子肝素（low molecular weight heparin，LMWH）是从普通肝素中提取的，平均分子量为6.5kDa。相对于普通肝素，LMWH链短，能够促进因子Ⅹa的灭活，从而减弱凝血酶的抑制。LMWH具有良好的剂量效应关系，生物利用度高，较少发生血小板减少症。LMWH疗效确切，使用方便，目前得到临床广泛应用。

磺达肝癸钠为比低分子量肝素更小的戊糖分子，其作用机制及监测方法与低分子肝素类似。

（1）药物作用：

低分子肝素是普通肝素裂解出的一组低分子量片段，其主要作用与普通肝素相似，但具有更安全和副作用更少的特点。

1）抗因子Ⅹa的作用增强，一般认为抗因子Ⅹa作用与药物抗凝及抗血栓形成能力具有更为密切的关系。

2）LMWH由于去除了部分血小板结合点，故用药后诱发血小板减少及功能异常的风险降低。

3）皮下注射吸收高（约为90%，普通肝素不足50%），半衰期长（抗因子Ⅹa作用持续24小时，普通肝素仅为0.6小时）。

4）具有更强的促纤溶活性的能力。

（2）适应证：

同普通肝素。尽管临床上多数情况不需要监测，但以下情况需要监测，如多种抗栓药物联合使用、肝肾功能不全、妊娠/产褥期、创伤/手术前需要及时清除药物、更换抗栓药物、用药剂量大/对药物有抵抗、高龄（＞75岁）或低龄（婴幼儿）、消瘦（＜50kg）/肥胖（＞70kg）、有出血的慢性病史、抗栓治疗中发生血栓/血栓扩展。

（3）副作用：

由于LMWH大部分需要从肾脏清除，如肾损害严重，会造成LMWH在体内的蓄积，引发出血风险。因此应用LMWH时需要了解患者肾脏功能，当肌酐清除率＜30%时，需减量或停用。此外，治疗剂量LMWH导致HIT的风险较普通肝素低，尚未见发生骨质疏松的报道。

（4）实验室监测：

1）血小板计数：

用药前及用药后每周1～2次，若低于50×109/L需停药。LMWH导致HIT的风险显著低于普通肝素。

2）APTT、ACT和AT：

应用常规治疗剂量的LMWH不需要监测APTT、ACT和AT。但对以下人群须监测：妊娠妇女、儿童及高龄患者（＞75岁，血栓形成及出血风险同时增加）、肝肾功能不全、具有较大出血风险的患者（消化道溃疡、空洞性结核）、术前需要及时停止抗凝的患者和已经存在出血或有出血倾向的患者等。

3）抗因子Ⅹa活性测定：

用于较大剂量的LMWH的监测。注意抗Ⅹa活性，是监测低分子肝素浓度的实验，应避免与凝血因子Ⅹ活性试验混肴，后者是用于检测因子Ⅹ缺陷的试验。在皮下注射3～4小时后采集血样检测，一般维持血浆浓度在0.2～0.6IU/m l抗Ⅹa活性。在急性静脉血栓形成时需维持水平在0.5～1.5IU/ml抗Ⅹa活性。

第二节 骨科相关生物化学及免疫学检查

一、急性时相反应蛋白检查

急性时相反应蛋白（acute phase reaction protein，APRP）是伴随组织损伤、局部缺血、急性感染与炎症反应而升高的一组血浆蛋白质，由糖皮质激素介导、肝细胞合成和分泌。

（一）C反应蛋白

C反应蛋白（C reactive protein，CRP）是一种由肝脏合成的，能与肺炎球菌C多糖体起反应的APRP。其主要的生物学功能是通过与配体结合，激活补体和单核-吞噬细胞系统，从而使带有配体的病原体或病理细胞被清除掉。

1．标本采集及影响因素

血清或全血标本检测，轻度黄疸、溶血、脂血不干扰检测。

2．检测方法

主要包括免疫透射比浊法、免疫散射比浊法等。

3．临床意义

（1）该检测目前已经成为医院的一项常规检测项目，用来反映机体的感染情况，辅助感染性疾病的诊断。感染急性期，CRP浓度可迅速升高至上千倍；疾病治愈后，其含量又可急速下降。病毒感染时，其浓度变化不大，故也可以作为细菌感染和病毒感染的鉴别指标。

（2）并发感染的鉴别：细菌的内毒素是急性时相反应的最有效的刺激剂，因此最高水平的CRP可发生在革兰阴性菌感染时，数值有时高达500mg/L。革兰阳性菌感染和寄生虫感染通常引起中等程度的反应，数值在100mg/L左右。病毒感染引起的反应最轻，通常不超过50mg/L，极少超过100mg/L，故CRP检测可作为细菌感染与病毒感染的鉴别指标，但其特异性不如PCT。手术和创伤CRP轻度升高，CRP一般在10～50mg/L。

（3）评价疾病活动性和监测疗效：CRP 10～50mg/L提示轻度炎症，CRP≥100mg/L提示较严重的细菌感染；在治疗过程中若CRP持续在高水平，则提示治疗无效。

（二）降钙素原

1．标本采集及影响因素

检测标本为血清或血浆，由于检测试剂中含有单克隆鼠抗体，因此某些接受单克隆鼠抗体治疗或诊断的患者样本结果可能会受影响。

2．检测方法

ELISA方法、电化学发光方法、胶体金免疫层析方法等。

3．临床意义

降钙素原（procalcitonin，PCT）是无激素活性的降钙素前肽物质，健康人血浆中PCT含量极低。当全身性细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒血症和多脏器功能衰竭时它在血浆中的水平特异性升高，增高的程度与感染的严重程度及预后相关。而在无菌性炎症、自身免疫、过敏和病毒感染时，PCT水平不会增高或仅有轻度变化。血清PCT的升高与细菌感染密切相关，在全身性、系统性严重感染中，PCT早期即可升高，经抗生素治疗控制感染后，血中PCT水平会下降。在病毒性感染及局部细菌感染而无全身表现的患者PCT仅轻度升高。因此，PCT已被用作全身严重感染或败血症时的一个重要的观察指标，在全身性细菌感染和脓毒血症的辅助诊断、预后判断、疗效观察等方面有较高的应用价值。

二、人类白细胞抗原B27检查

人类白细胞抗原（HLA）是一组位于人体细胞膜表面能够识别“自己”或“非己”的抗原分子，由位于6号染色体短臂上的一组主要组织相容性复合体基因（MHC）编码。这些基因包含很多基因座位，如HLA-A、HLA-B、HLA-DR等，每个基因座位又包含很多等位基因。其中人类白细胞抗原B27（HLA-B27）就是HLA-B基因座位上的一个重要的等位基因。

1．标本采集及影响因素

抗凝全血。

2．检测方法

检测方法有很多种，大多数实验室常采用的方法有ELISA方法、流式细胞仪检测法、PCR法等。

3．临床意义

研究发现HLA-B27抗原表达与强直性脊柱炎有高度的相关性，超过90%的强直性脊柱炎患者HLA-B27抗原表达阳性，而正常人群中仅有5%～10%的阳性率。故HLA-B27的检测是强直性脊柱炎诊断和鉴别诊断中的一个重要指标。

三、血清蛋白电泳和免疫固定电泳检查

（一）血清蛋白电泳

在pH8.6的缓冲液中，血清中各种蛋白质都电离成负离子，溶液中带负电荷的粒子在直流电场作用下，向正极方向泳动。由于各种蛋白质等电点不同，致使在相同pH条件下不同蛋白质所带电荷量存在差异，同时各种蛋白质的分子大小、分子形状也各不相同，带电荷越多、直径越小或越接近球形的蛋白质移动越快。利用这种原理对不同蛋白组分进行分离鉴定的技术，叫血清蛋白电泳（serum protein electrophoresis，SPE）。

1．标本采集及影响因素

检测标本为血清。

2．检测方法

血清醋酸纤维素膜电泳和血清琼脂糖凝胶电泳是临床常用的血清蛋白电泳检测技术。毛细管电泳或高效毛细管电泳是指以毛细管为分离柱的一种电泳方式，由于毛细管置于冷却系统中有效地冷却降温，故可加以直流高压作为驱动力，使样品在高压电场中快速泳动，具有高效、快速、高分辨率等优点，是达到高效分离的一类新型电泳技术。

3．参考区间

血清蛋白电泳一般分成5个主要区带，从正极起依次为白蛋白、α1、α2、β、γ球蛋白。分离后的蛋白质区带经染色后，由光密度扫描仪对各区带进行吸光度检测，各组分采用各区带的百分含量（%）表示。由于染色剂和电泳条件不同，以及不同人群间可能存在生物学变异，因此参考区间也存在差异，各实验室应建立自己的参考区间。

4．临床意义

不同疾病时，SPE区带会出现相应的变化，通过SPE的检测，有助于对疾病进行辅助诊断。正常情况下，SPE图谱上γ区带表现为颜色浅淡且宽的弥散区带，主要成分是免疫球蛋白。当出现M蛋白（monoclonal protein）时，M蛋白带表现为γ区带或γ～β区带之间出现狭窄浓集的异常窄区带。M蛋白的电泳位置可大致反映免疫球蛋白的类型，但若要确切区分其类型，需要进一步做免疫固定电泳来确证。

（二）免疫固定电泳（immunofixation electrophoresis，IFE）

1．标本采集及影响因素

检测标本可以是血清、尿液、脑脊液或其他体液。

2．检测方法

包括蛋白电泳和免疫沉淀两个过程。具体方法是将抗血清直接加于电泳后蛋白质区带表面，如果有对应的抗原存在，则会在相应的区带位置，发生抗原与相应抗体的沉淀反应，形成的复合物嵌于固相支持物中，通过染料染色后，可观察是否有某种单克隆免疫球蛋白存在，同时判断其类型。

3．临床意义

M蛋白在免疫固定电泳中显示为狭窄而界限明确的区带，而多克隆增生或正常γ-球蛋白区带是弥散分布的，用于对多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）进行进一步的鉴定和分型。

四、骨质疏松相关标志物检查

（一）骨代谢指标

1．骨标志物定义

骨生化转换标志物（biochemicalmarkers of bone turnover）、骨代谢标志物（bonemetabolic markers）是在骨转换过程中骨组织自身的代谢产物（分解与合成），简称骨标志物（bonemarkers）。骨标志物反映的是全身骨骼的动态状况，代表骨转换的总体速率。

2．骨代谢指标

严格地讲，骨标志物不完全等同于骨代谢指标，后者还应包括调节骨代谢的一些主要激素，如甲状旁腺激素、活性维生素D和降钙素等。

3．标本采集及影响因素

检测标本可以是血清、血浆或尿液。血液标本的采集应在清晨空腹进行，尿液标本应留取晨起第一次或第二次尿液。长期监测的患者，应每次均在相同的时间段空腹采集标本，以尽量减少昼夜节律和饮食对检测结果的影响。血液标本采集应注意避免溶血，采集后需要及时送检。

4．检测方法

检测的方法很多，如放射免疫测定法、ELISA方法、化学发光免疫测定法、HPLC等。采用的方法不同、试剂不同，结果间会存在差异。对于连续监测或判断疗效的患者建议在同一家检测机构或医院，使用同一检测系统进行检测，以保证检测结果的可比性。

5．参考区间

不同实验室由于检测方法、检测仪器、适用人群等条件的不同，结果不具有可比性，开展检测的实验室宜验证厂家提供的参考范围或建立自己的参考范围，并定期进行评审和确认。

6．临床意义

近几年来骨代谢指标检测的兴起，在辅助骨质疏松症诊断、监测疗效、增加患者治疗依从性、预测骨折风险、协助用药方案选择、代谢性骨病的鉴别诊断等方面起到了积极有效的作用，受到了临床医生的关注和认可，突显出实验室检测指标助力临床诊疗的优势。

（二）骨标志物的分类及介绍

骨标志物主要分为骨形成标志物和骨吸收标志，前者代表成骨细胞活动和骨形成时的代谢产物，后者代表破骨细胞活动和骨吸收时的代谢产物，特别是骨基质降解产物。

1．骨形成标志物

（1）骨性碱性磷酸酶（bone alkaline phosphatase，BALP）：

是通过葡萄糖基磷脂酰肌醇连接在成骨细胞膜表面的胞外酶，水解焦磷酸盐，提供无机磷，是合成骨矿化物质羟磷灰石的必需物质，是骨组织矿化的主要调节因子，部分释放入血。BALP在反映成骨细胞活动状况和骨形成上有较高的特异性，优于骨钙素。

（2）Ⅰ型原胶原N端前肽（procollagen typeⅠN-terminal propeptide，PINP）和Ⅰ型原胶原C端前肽（procollagen typeⅠ carboxy-terminal propeptide，PICP）：

Ⅰ型胶原主要在骨组织合成，此外软组织如：皮肤、血管、肌腱等也能产生。但由于骨组织中Ⅰ型胶原含量在体内最多，并且转换率较软组织高，因此测定Ⅰ型胶原代谢物有助于反映骨形成状态。胶原合成过程中，首先合成的是原胶原（procollagen）。在原胶原的N端和C端各有一个延长肽，称为前肽。在Ⅰ型胶原成熟的过程中，分子两端的前肽分别被N端和C端蛋白酶切除，并以等摩尔浓度大部分释放入血。在一定范围内是反映成骨细胞活动、骨形成以及Ⅰ型胶原合成速度的特异指标。

（3）骨钙素（osteocalcin）：

又称骨谷氨酰基蛋白（bone glutamyl protein，BGP），是成骨细胞分泌的一种特异的非胶原蛋白。在1，25-（OH）2 D3刺激下由成骨细胞合成和分泌，与羟磷灰石有较强的亲和力。其3个谷氨酸残基需要在维生素K的参与下羧基化，只有羧基化的骨钙素才具有与钙和矿物质结合的能力，是骨基质矿化的必需物质。合成后大部分沉积在骨基质中，小部分释放入血液循环。主要生理功能是抑制异常的羟磷灰石结晶形成，维持骨的正常矿化速度。可以反映成骨细胞活性和骨形成的情况，由于骨基质降解时，其中的骨钙素也会进入血液循环，因此也是评价骨质疏松妇女骨转换率的一个有用指标。

2．骨吸收标志物

这些标志物都是骨基质的降解产物，反映骨吸收，其升高程度与破骨细胞活性的增高是一致的。

（1）抗酒石酸酸性磷酸酶5b（tartrate-resisitant acid phosphatase 5b，TRACP 5b）：

由破骨细胞产生和分泌，能抵抗酒石酸的抑制，故称为抗酒石酸酸性磷酸酶。因其电泳时位于第5泳带，所以又称5型抗酒石酸酸性磷酸酶。5型TRACP有两种同工酶，人破骨细胞分泌的是5b，是骨吸收的一项生化指标，主要反映破骨细胞活性和骨吸收状态。由破骨细胞刚分泌到血液中的TRACP5b是有活性的酶，但当TRAP5b在血液循环中被清除之前已无活性，并被降解为碎片。这样TRACP5b不会因肝、肾功能受损而在血液中积蓄。

（2）Ⅰ型胶原吡啶交联终肽：

主要包括吡啶啉（pyridinoline，PYD）和脱氧吡啶啉（deoxypyridinoline，DPD），DPD只存在于骨和牙齿中，而PYD存在于骨、软骨、韧带和血管壁中，是Ⅰ型胶原分子之间构成胶原纤维的交联物，起稳定胶原链的作用。骨吸收时Ⅰ型胶原被降解，DPD和PYD释放入血并从尿中排出，是反映骨胶原降解和骨吸收的指标。

（3）Ⅰ型胶原C端肽和N端肽：

是Ⅰ型胶原分解的产物，是很好的骨吸收标志物。国际骨质疏松基金会（IOF）推荐Ⅰ型原胶原N-端前肽（PINP）和血清Ⅰ型胶原C末端肽（S-CTX）是敏感性较好的骨标志物。

（三）与骨代谢相关的其他指标检查

为了帮助进行鉴别诊断，对已诊断或临床怀疑骨质疏松的患者除了做相关影像学检查外，实验室检查还应包括：血、尿常规，肝肾功能，钙、磷、碱性磷酸酶，血清蛋白电泳等。同时可酌情进行以下检查：血沉、性激素、25-（OH）D/1，25-（OH）2 D、甲状旁腺素、尿钙磷、甲状腺功能、皮质醇、血气分析、血尿轻链、肿瘤标志物等。

第三节 骨科相关病原微生物学检查

一、概述及骨感染常见病原菌

骨感染主要包括骨髓炎和关节感染，前者包括急性及慢性骨髓炎，后者主要指骨关节及人工关节，通常由血源性播散、创伤或手术引起，是一类危害儿童和成人健康的重要疾病。临床医生可根据疾病的临床表现，实验室检查、影像学特征等进行诊断，其中病原学检查不仅是判断感染与否的直接证据，而且关系到患者的后续治疗。微生物学标本的规范送检和检测是获得准确病原学诊断的重要依据，鉴于人体很多部位存在大量的定植或污染的微生物，对临床医生采集标本和判断致病菌会带来干扰，稍不注意，就会导致对致病菌的误判，所以有必要介绍相关概念。

1．正常菌群

在正常人体体表、与外界相通的腔道，如口腔、鼻咽腔、肠道、泌尿生殖道存在各种细菌。这些细菌在人体免疫功能正常的条件下对人体有益无害，称为“正常菌群”（表2-3-2）。

2．病原菌

细菌进入正常人体组织，抵抗宿主的防御能力，在机体内繁殖，引起宿主的组织损伤和功能障碍，这种能引起人类疾病的细菌称为病原菌。伤口感染分离出的病原菌（表2-3-3）。

3．内源性感染

从原来寄居于皮肤、肠道、口、咽和泌尿生殖道部位的正常菌群转移至其他部位造成的感染，称为“内源性感染”。

4．外源性感染

外环境中的微生物进入正常人体组织所致的感染，称为外源性感染。

二、骨科感染病原学检查项目及标本采集注意事项

（一）标本直接镜检

标本直接涂片检查：可通过革兰染色镜检，观察中性粒细胞的有或无、数量及细胞浆中吞噬的细菌颜色、形态，初步判断有无感染、感染类型及是哪类病菌引起的感染。抗酸染色可检查是否有分枝杆菌的感染。墨汁染色可检查有无隐球菌的感染。

（二）标本培养

1．需氧培养

可培养出普通细菌、微需氧菌、少见菌及苛养菌。

2．厌氧培养

可培养出专性厌氧菌。

3．真菌培养

可培养出浅部和深部真菌。

4．分枝杆菌培养

可培养出结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌。

（三）标本采集、送检注意事项

1．应在抗菌药物应用前采集标本。

2．采集标本时需严格无菌操作，以防带入与感染无关的细菌，尤其避免“正常菌群”和“定植菌”的污染。

3．采集标本前要准备好无菌容器，根据标本不同选用不同的容器。

4．标本必须要直接采自病变部位，多点、多份、多次采集可增加阳性率、排除污染率。

5．尽可能在感染早期或急性期采集标本。

6．标本应立即送检，不得超过30分钟，厌氧菌培养的标本最好在床边接种。

7．检验申请单要求写明诊断，如有特殊要求应写在化验单上或直接与实验室联系。

8．对于非常凶险的感染或传染性疾病，应特别关注，嘱其反复送检。如怀疑产气荚膜梭菌、分枝杆菌、伤寒、布氏杆菌等细菌的感染，应与实验室取得联系，以便尽快、尽早发现病原微生物，以免产生严重后果。

三、与骨科感染相关的标本采集、运送及注意事项

（一）血液培养标本的采集

1．采血指征

对于疑有各类血行感染的患者在进行系统性抗生素治疗前，应进行血培养，患者出现以下体征中的一项或数项时可作为采集血培养的重要指征：

（1）寒战、发热（体温高于38℃）或低体温（体温低于36℃）。应注意老年菌血症患者可能不发热或低热。

（2）细胞增多（计数＞10×109/L，特别注意有无“核左移”）。

（3）细胞减少。

（4）血小板减少。

（5）皮肤黏膜出血。

（6）昏迷。

（7）多器官衰竭。

（8）大面积烧伤、创伤、开放性骨折。

（9）感染性心内膜炎、动脉内膜炎、伤寒、布氏菌病。

（10）埋置静脉导管3天以上，放置导尿管，气管切开及使用辅助呼吸器者。

2．采血量和采血时间

一般在患者发热初期或寒战前30～60分钟采双瓶血（需氧+厌氧），连续3次，采样部位在肘静脉。成人每次采血10ml，儿童为5ml。血液和培养液的比例一般推荐为1∶5～1∶10。

一次静脉采血注入多个培养瓶中应视为单份血培养。3份血培养足以检测所有的细菌菌血症和真菌菌血症。15%气性坏疽的患者可以检出产气荚膜梭菌。对间歇性菌血症患者，用于培养的血液应在估计寒战或体温高峰到来之前采集。当血培养明确病原菌后，应尽可能寻找潜在的感染源，如是否为血管内导管、气管切开、导尿管等。寻找到潜在的感染源、适时适地适法采集标本送检以明确并消除感染源。

3．采血应注意事项

血标本采集必须在严格防止污染的条件下进行。

（1）采血部位的消毒：

用无菌棉签浸润2%碘酊涂擦注射部位皮肤1遍，作用1分钟后再用75%的乙醇擦拭2遍。擦净残余碘，干燥后即可抽血。

（2）血培养瓶口的消毒：

用75%乙醇消毒瓶口，干燥后将血液注入瓶中并迅速轻摇，充分混匀防止凝固。培养瓶标示后连同化验单一起送检。

（二）伤口及病灶分泌物标本的采集

1．封闭性感染病灶标本的采集

患者的皮肤或黏膜表面先用2.5%～3.0%的碘酊消毒，再用75%酒精脱碘，较浅的病灶直接用无菌注射器抽取脓液，如果脓性分泌物少，抽取不到，则需用无菌盐水冲洗，收集冲洗物，将抽取的分泌物/冲洗物注入无菌试管中进行标本直接涂片及培养，或直接接种到需氧、厌氧血液培养瓶中。

2．创面标本的采集

（1）创面分类：

根据创口内可见的污染及受累程度（创口层次）将创面分为4类：清洁创口、清洁污染创口、污染创口和感染创口。

1）清洁创口：

是非外伤性的无炎症创口，未违反无菌技术以及不与生理腔道脏器相通。

2）清洁污染创口：

除切口与生理腔道相通外，其他与上述相同。

3）污染创口：

创口被来自皮肤、环境或生理腔道内的菌群或污物污染，但创口尚无污染。

4）感染创口：

指污染创口的细菌已经侵入组织内繁殖并引起组织炎症、坏死、化脓的创口。

临床医生在采集标本时，需排除定植的菌群，采集到真正的病原菌。标本直接革兰染色可帮助确认采集标本的质量：急性炎症细胞（多形核中性粒细胞）多、有胞内菌和坏死组织，提示标本质量好（图2-3-6）；鳞状上皮细胞数量过多表明标本有皮肤菌群污染。

（2）浅部开放性标本：

采集前先用无菌盐水清创，冲去污染物和坏死物，用镊子轻刮创面底部与正常组织相邻处的炎症组织，令少许炎症组织浮起，再用盐水湿润的无菌拭子采集。

（3）手术创口脓液：

先用无菌盐水清创，冲去皮肤表面坏死物和定植菌，轻压伤口附近的组织，令脓液溢出，再用无菌棉拭蘸取脓液；如果创口肿胀裂开，深部有脓肿形成，则采用注射器抽吸脓液送检。

（4）开放性窦道形成的脓肿：

由于窦道内坏死物中含有大量腐生菌群，不推荐采集瘘管脓液，应该直接采集瘘管壁组织，置于无菌容器中送检。

（5）关节液及滑膜活检：

是临床常见的诊断关节感染的标本，建议使用广口无菌容器，记录关节液的抽取量，也可以直接注入血培养瓶，标本均需立即送检。

（6）骨骼、内植物：

包括骨科使用的用钉子、克氏针、人工骨及人工关节等，均需置于无菌广口容器中送检。

四、厌氧菌感染标本的病原学检查

（一）厌氧菌感染诊断

1．高危人群 如免疫力低下患者，存在严重基础病、菌群失调、经历大手术者，往往会有发生内源性感染的风险（主要以无芽孢的厌氧菌多见）。套脱伤、剥脱伤等肌肉损伤患者，伤口污染严重或特殊的感染方式（咬伤）患者，往往会有发生外源性感染的风险（见于各种厌氧菌，其中产气荚膜梭菌等梭菌属细菌的感染较重）。

2．高危部位 感染部位靠近有正常厌氧菌群的部位。

3．感染灶特点 感染部位有气肿、水肿、坏死发黑、腐败性臭味。

4．感染类型 混合感染较多见，需氧菌和专性厌氧菌、兼性和专性厌氧菌、微需氧菌和专性厌氧菌、不同专性厌氧菌等都可混合感染。其中，革兰阳性厌氧芽孢为急性感染，比较危重。其他感染多为慢性感染。

5．患者有感染的特征、各种检查与感染相符，但普通细菌真菌培养多次为阴性，也考虑有厌氧菌感染的可能性。

（二）标本采集及送检

采集创面深部、无效腔、肌间隙、血运差部位的坏死组织、脓液或伤口拭子4～6份。标本质量以组织最好，脓液次之，伤口拭子最差。特别强调标本应立即送检。由于很多厌氧菌具有特殊的菌体形态，所以标本直接涂片非常重要，可快速提示厌氧菌感染的可能性（图2-3-7）。

（张会英 吴俊 刘颖 王旭）

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