二、液相色谱基本原理

（一）概述

色谱法的分离以化合物在流动相与固定相之间的相互作用为基础，当溶于流动相中的各组分经过固定相时，由于与固定相发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。如果色谱分离过程中使用的流动相是液体，则称为液相色谱。高效液相色谱则指以泵高压驱动流动相，使用小粒径多孔硅胶或稳定键合固定相的液相色谱。

由检测器将分离情况转换成电信号进行记录，得到一条信号随时间变化的曲线，称为色谱流出曲线。当待测组分流出色谱柱时，检测器就可检测到相应组分的浓度，在流出曲线上表现为峰状，称为色谱峰，理想的色谱峰流出曲线应该是符合正态分布的曲线（见图1-1）。

为了解释色谱流出曲线的形状、探究实际色谱区带扩散的影响因素和从理论上指导色谱分离和定量结果，人们从热力学、动力学等方面进行了大量的研究，形成了塔板、速率、平衡等经典理论，为评价表征柱效、定量关联色谱参数与柱效以及探究各种因素对色谱流出曲线的影响奠定了研究基础。

（二）基本概念和术语

高效液相色谱的分离原理、溶质在固定相中保留、扩散等概念基本源自气相色谱法，所以，适用于气相色谱的一些概念、术语及分离的基本关系式，往往也适用于高效液相色谱法。高效液相色谱法中的一些基本概念和术语如下：

① 色谱图（chromatogram）　样品流经色谱柱和检测器所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线（elution profile）。

② 基线（base line）　经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线，一般应平行于时间轴。

③ 噪声（noise）　基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。

④ 漂移（drift）　基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。

⑤ 色谱峰（peak）　组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰（leading peak）和拖尾峰（tailing peak）。

⑥ 标准偏差（standard deviation，σ）　正态分布曲线x=±1时（拐点）的峰宽之半。正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。σ小，分散程度小，极点浓度高，峰形瘦，柱效高；反之，σ大，峰形胖，柱效低。

⑦ 峰底　基线上峰的起点至终点的距离。

⑧ 峰高（peak height，h）　峰的最高点至峰底的距离。

⑨ 峰宽（peak width，W）　峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。

⑩ 半峰宽（peak width at half-height，Wh/2）　峰高一半处的峰宽。

峰面积（peak area，A）　峰与峰底所包围的面积。

死时间（dead time，t0）　不保留组分的保留时间，即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。

死体积（dead volume，V0）　由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有Vm参与色谱平衡过程，其他3部分只起峰扩展作用。为防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。

保留时间（retention time，tR）　从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值的时间。

保留体积（retention volume，VR）　从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积，又称洗脱体积。

调整保留时间（adjusted retention time，　扣除死时间后的保留时间，也称折合保留时间（reduced retention time）。在实验条件（温度、固定相等）一定时，只决定于组分的性质，因此，（或tR）可用于定性。

调整保留体积（adjusted retention volume，）　扣除死体积后的保留体积。

理论塔板数（theoretical plate number，N）　用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效），取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。若用调整保留时间（）计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板数（N有效或Neff）。

理论塔板高度（theoretical plate height，H）　每单位柱长的方差。实际应用时往往用柱长L和理论塔板数计算。

分配系数（distribution coefficient，K）　在一定温度下，化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的浓度之比。

容量因子（capacity factor，k）　化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的量之比。因此容量因子也称质量分配系数。

选择性因子（selectivity factor，α）　相邻两组分的分配系数或容量因子之比。从本质上来说，α的大小表示两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。

分离度（resolution，R）　相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值，也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。R≥1.5称为完全分离。

（三）塔板理论

1.塔板理论的基本假设

塔板理论是Martin和Synger首先提出的色谱热力学平衡理论。它把色谱柱看作分馏塔，把组分在色谱柱内的分离过程看成在分馏塔中的分馏过程，即组分在塔板间隔内的分配平衡过程。塔板理论的基本假设为：

① 色谱柱内存在许多塔板，组分在塔板间隔（即塔板高度）内完全服从分配定律，并很快达到分配平衡。

② 样品加在第0号塔板上，样品沿色谱柱轴方向的扩散可以忽略。

③ 流动相在色谱柱内间歇式流动，每次进入一个塔板体积。

④ 在所有塔板上分配系数相等，与组分的量无关。

虽然以上假设与实际色谱过程不符，如色谱过程是一个动态过程，很难达到分配平衡；组分沿色谱柱轴方向的扩散是不可避免的。但是塔板理论导出了色谱流出曲线方程，成功地解释了流出曲线的形状、浓度极大点的位置，能够评价色谱柱柱效。

2.色谱流出曲线方程及定量参数（峰高h和峰面积A）

根据塔板理论，流出曲线可用下述正态分布方程来描述：

由色谱流出曲线方程可知：当t=tR时，浓度c有极大值cmax。cmax就是色谱峰的峰高。上式说明：①当实验条件一定时（即σ一定），峰高h与组分的量c0（进样量）成正比，所以正常峰的峰高可用于定量分析；②当进样量一定时，σ越小（柱效越高），峰高越高，因此提高柱效能提高HPLC分析的灵敏度。

由流出曲线方程对V（0～∞）求积分，可得出色谱峰面积A=2.507σh=c0。可见，A相当于组分进样量c0，因此是常用的定量参数。把Wh/2=2.355σ代入上式，即得A=1.064×Wh/2×h，此为正常峰的峰面积计算公式。

（四）速率理论（又称随机模型理论）

1.液相色谱速率方程

1956年荷兰学者Van Deemter等人吸收了塔板理论的概念，并把影响塔板高度的动力学因素结合起来，提出了色谱过程的动力学理论——速率理论。它把色谱过程看作一个动态非平衡过程，研究过程中的动力学因素对峰展宽（即柱效）的影响。后来Giddings和Snyder等人在Van Deemter方程（H=A+B/u+Cu，后称气相色谱速率方程）的基础上，根据液体与气体的性质差异，提出了液相色谱速率方程（即Giddings方程）：

2.影响柱效的因素

（1）涡流扩散（eddy diffusion）　由于色谱柱内填充剂的几何结构不同，分子在色谱柱中的流速不同而引起的峰展宽。涡流扩散项A=2λdp，dp为填料直径，λ为填充不规则因子，填充越不均匀λ越大。HPLC常用填料粒度一般为3～10μm，最好3～5μm，粒度分布RSD≤5%。但粒度太小难以填充均匀（λ大），且会使柱压过高。大而均匀（球形或近球形）的颗粒容易填充规则均匀，λ小。总的说来，应采用细而均匀的载体，这样有助于提高柱效。毛细管无填料，A=0。

（2）分子扩散（molecular diffusion）　又称纵向扩散。由于进样后溶质分子在柱内存在浓度梯度，导致轴向扩散而引起的峰展宽。分子扩散项B/u=2γDm/u。u为流动相线速度，分子在柱内的滞留时间越长（u小），展宽越严重。在低流速时，它对峰形的影响较大。Dm为分子在流动相中的扩散系数，由于液相的Dm很小，通常仅为气相的10-4～10-5，因此在HPLC中，只要流速不太低的话，这一项可以忽略不计。γ是考虑到填料的存在使溶质分子不能自由地轴向扩散而引入的柱参数，用以对Dm进行校正。γ一般在0.6～0.7左右，毛细管柱的γ=1。

（3）传质阻抗（mass transfer resistance）　由于溶质分子在流动相、静态流动相和固定相中的传质过程而导致的峰展宽。溶质分子在流动相和固定相中的扩散、分配、转移的过程并不是瞬间达到平衡，实际传质速度是有限的，这一时间上的滞后使色谱柱总是在非平衡状态下工作，从而产生峰展宽。液相色谱的传质阻抗项Cu又分为三项。

① 流动相传质阻抗Hm=Cmu/Dm，Cm为常数。这是由于在一个流路中流路中心和边缘的流速不等所致。靠近填充颗粒的流动相流速较慢，而中心较快，处于中心的分子还未来得及与固定相达到分配平衡就随流动相前移，因而产生峰展宽。

② 静态流动相传质阻抗，Csm为常数。这是由于溶质分子进入处于固定相孔穴内的静止流动相中，晚回到流路中而引起峰展宽。Hsm对峰展宽的影响在整个传质过程中起着主要作用。固定相的颗粒越小，微孔孔径越大，传质阻力就越小，传质速率越高。所以改进固定相结构，减小静态流动相传质阻力，是提高液相色谱柱效的关键。

Hm和Hsm都与固定相的粒径平方成正比，与扩散系数Dm成反比。因此，应采用低粒度固定相和低黏度流动相。高柱温可以增大Dm，但用有机溶剂作流动相时，易产生气泡，因此一般采用室温。

③ 固定相传质阻抗（液液分配色谱），Cs为常数，df为固定液的液膜厚度，Ds为分子在固定液中的扩散系数。在分配色谱中Hs与df的平方成正比，在吸附色谱中Hs与吸附和解吸速度成反比。因此，只有在厚涂层固定液、深孔离子交换树脂或解吸速度慢的吸附色谱中，Hs才有明显影响。采用单分子层的化学键合固定相时Hs可以忽略。

从速率方程式可以看出，要获得高效能的色谱分析，一般可采用以下措施：①进样时间要短；②填料粒度要小；③改善传质过程，过高的吸附作用力可导致严重的峰展宽和拖尾，甚至不可逆吸附；④较小的检测器死体积；⑤适当的流速，以H对u作图，则有一最佳线速度uopt，在此线速度时，H最小。一般在液相色谱中，uopt很小（大约0.03～0.1mm/s），在这样的线速度下分析样品需要很长时间，一般来说都选择在1mm/s的条件下操作。

（五）柱外效应

速率理论研究的是柱内峰展宽因素，实际在柱外还存在引起峰展宽的因素，即柱外效应（色谱峰在柱外死空间里的扩展效应）。色谱峰展宽的总方差等于各方差之和，即：

柱外效应主要由进样点到检测池之间除柱子本身以外的所有死体积所引起。为了减少柱外效应，首先应尽可能减少柱外死体积，如使用“零死体积接头”连接各部件，管道对接宜呈流线型，检测器的内腔体积应尽可能小。其次，希望将样品直接进在柱头的中心部位，但是由于进样阀与柱间有接头，柱外效应总是存在的。此外，要求进样体积≤VR/2。

柱外效应的直观标志是容量因子k小的组分（如k＜2）峰形拖尾和峰宽增加得更为明显；k大的组分影响不显著。由于HPLC的特殊条件，当柱子本身效率越高（N越大），柱尺寸越小时，柱外效应越显得突出。而在经典LC中则影响相对较小。