2.5 表面对生物相容性的影响

研究表明，植入组织蛋白吸附和随后的构象改变会引起免疫反应，研究结果也强调表面性能（物理、化学性能）的改变会减少蛋白吸附和细胞粘连，进而提高植入材料的生物相容性。

2.5.1 生物材料的表面修饰与表征技术

为了探寻“完美”的材料，材料科学家们已经采用很多种技术进行表面改性，包括物理修饰、化学修饰和辐射。研究已表明，一般的材料表面改性（包括化学性质、润湿性、域组成和形态）会影响体内细胞对生物材料的蛋白吸附和随后的细胞反应。可惜的是，由于缺乏表面的明确界定（只从一个或两个特性来区分）和特点明确的动物植入材料模型，许多早期的研究都没能对材料性质影响异体反应的发病机理有深刻的认识。

2.5.1.1 生物材料的表面修饰技术

在过去的20年中，有许多表面改性技术得到了发展。研究表明，材料的表面吸水性、疏水性、电荷性可以改变蛋白吸附的程度。总的来说，提高表面疏水性可以提高材料的生物相容性（体外培养）。近来许多人的研究不仅仅是改变亲水性或疏水性，还通过在表面均匀地增强不同的化学官能团来提高材料的生物相容性。虽然大量文献已经证明有很好的体外培养结果，但是在体内培养的过程中，表面性能对组织表达没有明显的影响。

近年来发展起来的低温等离子体技术由于其独特的性质在生物材料的表面改性方面也正得到越来越广泛的应用［18］。低温等离子体表面改性只限于几百埃以内的表面，对材料本体的性质影响较小，而且能够处理各种形状的材料表面，改性条件也容易改变和控制等，因此被广泛用于生物材料的表面改性。对于很多聚合物材料来说，控制相关参数、利用特定的气体可以使材料表面产生特定的基团。低温等离子体对材料表面改性可分为两类：等离子体表面接枝聚合和等离子体表面处理。等离子体表面处理技术主要是在材料的表面引入一些亲水性的化学基团，如-OH，-NH3，-COOH和磺酸基等，从而提高材料表面的亲水性，进而调节细胞在材料表面的粘附性能，改善材料表面的血液相容性［19］。目前常用的是O2，N2，NH3以及SO3等具有反应活性的气体。另外，表面化学处理利用聚合物本体材料中已存在的基团的反应或通过主链侧基上某些反应活性高的基团或原子的反应，可使聚合物表面产生小分子功能基团。如含有易被水解的酯类聚合物可在碱溶液中部分水解并使表面产生羧基，与二元胺反应可在表面引入胺基，与乙酐反应可引入羟基等。除此之外，像化学氧化法、辐射技术、离子注入技术等物理化学方法也逐渐地被应用到生物材料表面进行处理，产生新的活性基团。

表面接枝改性是生物材料表面改性中应用较为广泛的一种方法，聚合物的表面接枝和传统的聚合物接枝不同。传统的聚合物接枝一般是在均相的溶液体系中进行的，接枝几乎涉及每一个大分子。而表面接枝则只是限于固体的高分子材料表面发生接枝反应，材料的本体并不参与反应，因此表面接枝反应是一种非均相的反应。表面接枝是利用特定的物理化学的方法，在聚合物的固体表面生成活性反应中心，再引发单体进行接枝反应的。接枝聚合反应可将一些具有生物相容性的分子引入聚合物的表面，从而改善和提高生物材料的生物相容性。

等离子体表面接枝聚合是一种很有吸引力的聚合物材料表面化学和形貌修饰的方法［20］。主要是利用一些惰性的Ar，He和H2等非反应性气体，这些气体的原子不直接进入高聚物材料表面的大分子链中，但由于这些非反应性气体等离子体中的高能粒子在轰击材料表面时传递能量，所以会使材料表面产生大量自由基，然后将一些目的单体在等离子激发的表面上引发聚合，最终在聚合物的表面接枝形成一种刷状薄层。这种接枝的表面也可以提供一些活性位点用于结合蛋白分子。这种方法具有较高的表面选择性，同时这种修饰能够被限制在几纳米的范围内而不引起本体性能的变化。因此，等离子接枝聚合也被认为是一种非常成功的用于固定生物分子和适合细胞培养的功能化的界面的方法［21］。

生物体内很多的分子水平的结构是自组装的和有序的，包括生物膜的有序的磷脂双分子层、胶原合成过程、DNA的双螺旋结构等。近年来材料领域出现了一种新的技术——自组装单分子层技术，这种技术也是逐渐地被引入生物材料的表面修饰中的，用于制备精细的、可控的、具有特定化学结构的生物材料表面，研究细胞或蛋白与材料的相互作用。大分子自组装技术是指聚合物分子在氢键、静电相互作用、疏水亲酯作用、范德华力等弱相互作用力的推动下，自发地构筑成具有特殊结构和形状的集合体的一项技术。这是一门集化学、物理、生命科学和材料科学为一体的交叉学科，也是近年来才发展起来的新兴学科，已越来越受到人们的关注［22］。自组装单分子层是分子通过化学键相互作用自发吸附在固/液或气/固界面而形成的热力学稳定和能量最低的有序膜。自组装形成的有序分子结构对于生物识别和生物反应有以下几个优点：避免引发非特异性反应、精确的计划和设计表面（原子水平）、处于稳定的平衡状态的材料表面和比较简单的制备方法。

将生物活性分子固定到材料表面是提高其细胞/组织生物相容性的重要方法。生物活性分子在聚合物表面的固定主要有物理吸附和化学固定两种。物理吸附，即通过静电吸附作用可将带有电荷的生物活性分子非共价地固定于材料中带异种电荷的部位，这是在材料表面引入活性分子的最简便的方法；化学固定，指将生物活性分子中的某些基团与基质表面的反应性基团通过化学键合或交联剂使其牢固地固定于材料表面，从而获得长期的组织生物相容性，这是物理吸附方法所无法达到的，但是化学固定的方法较前者又要复杂得多。

2.5.1.2 生物材料的表面表征技术

表面在生物学和医学中扮演了重要的角色，大多数的生物反应是发生在表面和界面的，但是直到19世纪人们才首先观察到表面对生物学反应的控制。表面性能对于生物材料及其装置的成功与失败具有重要的影响，表面性能及其后续的表征已经成为生物材料研究的中心内容之一，所以生物材料的表面性能的分析与表征变得非常重要。生物材料表面分析主要有表面化学结构、亲/疏水性、离子基团、表面形貌（如结构域）和拓扑结构（表面粗糙度、平滑度），采用不同的分析方法可以获得不同程度的信息，包括显微技术、光谱技术和热力学技术等。表面分析方法的选择受到很多因素的影响，包括需要测量的类型、被分析的表面区域的范围、准确性和精确性、样品的制备、分析技术对表面的影响、样品对仪器的影响等。表面科学技术的进步明显地促进了我们对生物材料表面成分和分子结构的表征能力的理解。这方面的研究的最终目的是能够真正理解“材料的表面性质是怎样影响细胞与表面相互作用时的生物学活性的”。

2.5.2 表面化学对蛋白吸附的影响

表面化学性质影响蛋白吸附、变性、抗原表面暴露的程度。为了减少不必要的蛋白吸附，可以用表面反应在组织表面增加官能团用于“排斥”蛋白。典型的排斥蛋白官能团包括亲水性基团、氢键受体、无氢键和中性电荷。通常认为涂层抵抗蛋白官能团的识别可以帮助调整材料表面来控制蛋白粘附以及吸附，这样就可以增强生物相容性。

几年来，纤维蛋白受表面官能团的影响已被广泛研究。计算机模拟显示，水分子和纤维蛋白一样可以在羟基涂层的表面吸附，重复试验结果表明纤维蛋白会和表面羟基牢固键合，而且已证明最佳的羟基浓度可以增强白蛋白和纤维蛋白的亲和力。纤维蛋白也可以与羟基化和表面甲基官能团反应，证实了早先纤维蛋白会被表面的甲基官能团吸附。表面的氨基和纤维蛋白会形成氢键，将其束缚在氨基表面。至于羧基，纤维蛋白不能强于水分子和表面羧基进行反应。相似的结果在其他的研究中也可见到，活性或惰性、亲水性或疏水性表面都可以吸附等量的纤维蛋白。和其他表面相比，带有像羧基之类的负电荷的表面吸附的纤维蛋白很少。为了对表面官能团和蛋白反应有更广泛的了解，需要发展涉及混合官能团以及更多的体内实验的研究。

为了测定官能团密度在调制蛋白和与生物材料反应时所产生的作用，可以利用等离子聚合技术在表面移植不同密度的羟基和氨基，以增强表面羟基和氨基的密度来提高表面的亲水性。至于表面和纤维蛋白的反应，有羟基的表面吸附的蛋白量减少，而当羟基和氨基浓度增加时，氨基表面可以吸附到更多的蛋白。这些数据证明，自发吸附的蛋白数量是由表面化学性质决定的。很多实验也在研究表面官能团的种类和密度是否会影响到蛋白构象的改变（变性）。研究结果证实，即使是表面氨基浓度很小的变化也会影响到纤维蛋白的吸附和P1/P2抗原表位的暴露。

也有研究显示，生物材料的表面化学通过经典途径参与了补体激活，影响吞噬细胞的吸附和活性以及白细胞的粘附和活性。研究也显示，相比亲水性表面，免疫球蛋白在疏水性表面会发生更深程度的变性，导致可以结合补体蛋白的活性基团的暴露。另外，化学官能团自身也可以和补体蛋白通过共价键结合，然后包裹蛋白进而调控蛋白。羟基会从血清中选择性地吸附免疫球蛋白，最终导致表面C3的沉淀。相比较而言，氨基和羧基就显示比较弱的活性。用SAMs进行体内研究显示羟基会增加白细胞的反应。这个过程至少由三个连续的步骤组成：表面羟基调整补体活性；补体片段C5a激发白细胞活性；白细胞通过键合粘附到表面，束缚补体片段C3b。

2.5.3 表面官能团对细胞的影响

研究表明，表面官能团会影响细胞生长，很可能是因为表面官能团影响了吸附的蛋白以及随后的蛋白—细胞的相互作用。通常来说，亲水性基团提供较低的界面自由能，从而降低了蛋白吸附、细胞粘附和血液相容性。相比疏水性表面，蛋白倾向于以较少的量和并不牢固的亲水性表面键合。蛋白吸附的减少会影响到随后的细胞表达。例如，在一个相互渗透的网络研究中，我们可以看见亲水性单体的逐渐增加会导致纤维蛋白吸附量的减少和白蛋白吸附量的增加，以及血小板粘附的逐渐减少。也有研究显示亲水性表面会明显抑制白细胞的粘附和巨噬细胞的融合，也会导致细胞因子释放的减少，进而减弱免疫反应。相比较而言，甲基基团的增加会增加白细胞的吸附。白细胞在固体表面的粘附取决于多种不同的因素，像表面化学性质、电荷或亲水性和蛋白吸附。

2.5.4 表面官能团对组织表达的影响

目前很少有对表面官能团在体内影响的研究。几乎所有的体内研究都是通过急性可植入模型来实现的。这些研究工作的结果表明，表面官能团会改变生物材料在体内引起的急性免疫反应。研究发现，表面官能团显示不同的急性免疫范围：氨基＞甲基～CFx＞羟基＞硅氧基基团。最近有科学家采用SAMs方法制备疏水性甲基、亲水性羟基和羧基表面，结果显示甲基表面与羟基和羧基表面相比，附着在植入体表面的纤维膜的厚度较厚，而且免疫细胞也较多。进行单独研究也发现，甲基与金色覆膜表面相比会增加白细胞和吞噬细胞向植入体迁移。

令人意外的是，几乎所有的研究都没有显示体内表面化学性质对慢性纤维变性表达的影响。可以猜测，表面官能团对体内细胞表达的相对无效性可能简单地反映出细胞与表面反应的不充分。特别是在体外环境中，细胞种植在官能团和表面基团的顶部，这样的话，就能对细胞表达发挥出最大的作用。而在体内，无孔材料表面的官能团就只能和细胞/组织的表层细胞反应。这种相对较弱的细胞和官能团之间的反应就减弱了表面官能团对细胞表达的影响，这可以通过使用组织支架和药物释放微球来提高官能团和细胞之间的反应，进而增强植入材料表面化学性质的影响。对承载有不同分子量表面官能团的细胞应答进行检验，用球形微球使植入体的体积比最大，并且模拟微球用于控制药物释放，将微球微米化，检验其对调节组织对生物材料的表达的能力，采用等离子聚合技术在不同微球的表面附着四种不同的官能团：羟基、氨基、-CFx和羧基，然后在体内检测这些表面官能团对宿主组织表达的影响，会发现亲水性羟基和氨基表面诱导产生最厚的纤维膜，并且渗透入植入体的细胞最多。正如前文提到的一样，亲水性基团会减少蛋白吸附，而-CFx和羧基表面的免疫、纤维细胞表达、细胞渗透量就很少。这些结果都说明，植入体的比表面积以及表面官能团对组织表达和生物相容性都有很重要的影响。

2.5.5 仿生化表面设计在组织工程中的应用

表面官能团在组织工程中的影响的研究还处于初期。最近已经在研究如何通过支架表面改性来提高亲水性。了解官能团对细胞粘附的影响就可以对支架表面进行改性从而增强细胞粘附，同时也可以减少对支架材料的免疫应答。目前大多数对组织工程支架的研究都是通过添加细胞外基质获得材料来增强细胞的生长和分化的，主要用表面官能团来增加特殊的膜配位基从而增强细胞粘附。最近的研究结果也显示，表面官能团可以诱导细胞分化。用Caco-2细胞研究发现表面官能团和细胞的分化程度有关，αvβ3整合点暴露在羧基表面会抑制成骨细胞的分化和矿化，羟基表面的成骨细胞显示出较高的分化和矿化水平。

组织工程用的生物材料的发展最近主要集中在材料的生物仿生化制备［23］［24］［25］，这种仿生化的生物材料能够通过生物分子的识别来刺激特异性的细胞反应和直接生成新的组织。很明显，将受体和配体的相互作用原理引入生物材料的设计中可以更好地控制细胞和生物材料的相互作用。值得注意的是，生物仿生化的主要任务不仅仅是控制材料和细胞的相互作用，更重要的是履行更好的设计目的，如某种细胞类型的靶向、提供特定的支架结构用于组织的生长等，这种特异性的相互作用的设计是一种用于材料，使其更好地实现预定目标的工具。生物仿生化的材料能够在分子水平上调节和控制细胞与材料的相互作用［26］。

将细胞结合的多肽通过物理的或化学的修饰方法引入生物材料，这些材料可以通过本体和表面两种修饰方法来制备，主要集中在能够和细胞受体发生特异性反应的一些大的细胞外基质蛋白，或来源于细胞外基质蛋白的小肽。这些生物仿生化的材料模仿了组织的细胞外基质的很多作用。如鼠的MSC可以通过受体—配体的相互作用来实现［27］，将特异性的蛋白序列引入材料能够使材料被特异性的蛋白酶降解［28］，或者能够引起细胞在局部组织中不能出现的反应［29］。

用生物活性分子对生物材料的表面进行修饰是获得生物仿生化材料的一种简单的方法。早期的工作是用长链的细胞外基质蛋白如FN，LN，VN进行表面修饰。这些蛋白能够涂覆在生物材料的表面从而促进细胞的粘附和分化［30］［31］［32］。随着一些信号结构域的发现（这些结构域只存在于细胞外基质长链蛋白中的几个氨基酸，它们主要是和细胞膜上的受体相互作用），短肽片断序列也开始被用于材料的表面修饰，这些选择性的合成多肽序列可以用于组织工程［33］。使用短肽进行表面修饰比用长链的细胞外基质蛋白修饰要有优势得多。长链的蛋白分子在吸附到生物材料表面时会发生无规则的折叠，变性的蛋白不一定能够保持其与细胞表面受体相互作用的结构域。而短肽在修饰的过程中能够保持相对稳定的和细胞表面受体结合的结构。另外，短肽在实验室中能够更加经济地被合成。这些用生物活性分子修饰的生物材料可以作为人工的细胞外基质用于组织工程，引导新的组织的形成。还有，用这些受体结合的生物分子进行表面修饰可以作为一种有用的方法精确阐述细胞在生物材料的表面的细胞行为。即细胞粘附多肽的密度和空间分布对细胞特异性功能的影响，如细胞的粘附、增殖和分化等。

通常使用的表面修饰的多肽有Arg-Gly-Asp（RGD），这种信号区域来自纤粘连蛋白（FN）和层粘连蛋白（LN）。另外，其他的一些短肽序列也被用于固定在各种模板基质上［34］，如 Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg（YIGSR），Arg-Glu-Asp-Val（REDV），Ile-Lys-Val-Ala-Val（IKVAV）。很多的基质被这些多肽进行了修饰和表征了与细胞的相互作用，如玻璃、石英、金属氧化物和聚合物。将这些多肽固定到材料的表面的技术有很多，如材料表面具有的活性反应基团，如氨基可以通过化学反应连接到多肽的羧基上，具有功能化的交联剂也可以将这些多肽连接到材料表面，这样固定的多肽在生物学环境中具有一定的柔软的运动性。对于聚合物来说，虽然其表面缺少合适的功能基团用于连接反应，但是有一种光化学固定的方法可以将活性多肽接枝到聚合物的表面。

用细胞粘附多肽进行表面修饰为仅仅在生物医学装置的表面控制细胞的行为提供了一种可能性。然而，表面修饰还是有一定的局限性。由于表面修饰是在一些精细的模板表面进行的，并且对细胞在材料表面的行为的研究是在无血清的介质中进行的，所以这些结果不能准确反映体内的复杂的生物学事件。即使一些模板表面为理解细胞的行为提供了一些基础知识，但是很难被直接用于组织工程支架材料。

随着生物材料的本体修饰的发展，细胞信号多肽也开始结合到生物材料中，从而使得识别位点不仅出现在材料的表面上，而且出现在材料的本体上。从本质上说，生物材料的本体的修饰对组织工程的应用也是有益的。

2.5.6 通过表面功能化来改善药物释放

2.5.6.1 表面化学对药物释放的影响

像许多其他的医用植入体一样，药物释放载体在植入几天（几周）后都人们会被厚厚的成胶纤维组织包围。这些纤维组织就像扩散屏障，以至于会减少药物释放。因此，人们通常认为调整生物材料纤维化反应可以提高药物释放的能力。用SAMs进行研究显示，羧基和羟基表面比甲基表面产生的纤维包囊要薄。实验结果也证明，聚合官能团微球植入体甲基表面也显示出较薄的包囊体。然而，羟基植入体表面也出现明显增加纤维包囊的形成。要明确表面官能团和药物释放之间的关系还需要进行大量的研究。

2.5.6.2 表面官能团提高药物摄入细胞

近来的研究也表明，药物传递载体表面的官能团会影响到细胞摄入比例和摄入机理。对末端氨基、羟基和聚乙二醇（PEG）官能团的研究显示，氨基表面能够以较高比率进入细胞。这说明阳离子氨基表面和细胞膜之间充分反应后，允许药物传递载体快速进入细胞。另外，对一个末端官能团是羟基、氨基、羧基的聚合物的研究发现，羧基和羟基表面倾向于增加体内存活时间，这可能得归功于它们因蛋白吸附而提高的宿主识别能力，也可能是出于官能团的原因而影响到了细胞的摄入。表面覆膜已被证明会影响纳米粒子的细胞摄入。通常有亲水性外壳的微米和纳米粒子会减少蛋白吸附并延长循环时间。用带有亲水性羟基官能团的聚乙二醇外壳修饰的粒子，可以减少单核吞噬细胞的摄入。检测改变电荷性对粒子摄入的影响的研究显示，粒子表面氨基基团的增加和细胞摄入有关系。表面氨基浓度越高，癌症细胞摄入的粒子就越多。从经过羟基改性的亲水性PVC表面可以看到一个有趣的现象，用无覆膜的PLGA和羟基覆盖的PLGA进行对比研究发现，添加亲水性覆膜会导致2倍的细胞摄入。研究显示羧基表面会增强细胞摄入，并且纳米粒子的摄入量和粒子表面羧基官能团的量有关。这种现象可能和细胞容易与阴离子表面覆膜反应有关。