第二章 白酒酿造微生物知识

第一节 微生物的基础知识

微生物是指个体微小、构造简单的微小生物。大多数微生物都是单细胞（例如细菌和酵母），部分是多细胞（霉菌）。一般来说，微生物主要是指细菌、放线菌、酵母菌、霉菌和病毒五大类。与酿酒有关的主要微生物有细菌及真菌中的霉菌及酵母菌。

微生物个体微小，其中有的肉眼可见，如毛霉、青霉、曲霉、假丝酵母等，也有的肉眼看不见，必须借助显微镜才能看见，例如酵母菌、细菌和放线菌。但是，当这些微生物的群体，集成几亿或者更多时，也就是成堆了，就能看见了，例如产膜酵母在酱油面上形成的白醭，又如许多红茶菌体结成一个块膜状半透明体（又称海宝），这些我们都是直接看得见的。在我们的日常生活中，由微生物所引起的许多现象是经常可以遇到的，例如热天牛奶容易变酸凝固，剩饭菜容易变馊腐败发臭；雨天东西容易长霉（例如放到床下面的皮鞋经常长霉），人喝了脏水容易闹病等，这些都是有害微生物生命活动引起的。而很多微生物可为人类造福，为人类利用，如在酿酒工业中，根霉、曲霉等霉菌在培养中生成淀粉酶，能将淀粉变成可发酵性糖；酵母菌在酿酒过程中能将糖类发酵生成酒精：乳酸菌能生成乳酸及乳酸酯；一些产酯酵母可产生乙酸乙酯和其他酯类等。但是，这并不等于所有的曲霉、根霉都有很大的糖化力，所有的酵母都有很大的发酵力，相反有的菌种也是有害的，如黑根霉、灰绿曲霉、烟曲霉和野生酵母。在酿酒工业上，要选择酶活力强、适合生产的优良菌种，要研究它们的繁殖、生长条件，如营养、温度，水分，空气等，使这些微生物更好地为酿酒工业服务。

—、微生物的特点

微生物体积小、种类多、繁殖快、分布广、容易培养、容易发生变异、代谢能力强等特点，能很方便地被应用于工、农、医等方面，能解决许多疑难的问题。

（一）体积小

前已述及，微生物个体微小，必须借助显微镜才能观察清楚。测量微生物的大小以微米（μm）、纳米（nm）或埃（Å）表示（1mm＝103μm＝106nm＝107Å）。一般酵母和霉菌的直径约为20μm，杆菌长度约为2μm，而病毒的长度仅约为0.02μm。

（二）种类多

据有关资料介绍，在自然界，目前已发现的微生物有十万种以上，我们已研究过的微生物，仅占自然界的10%左右。由于土壤中具备了微生物生活所需的各种物质、水分和温度，所以微生物在土壤中数量最大、类型最多。由于不同种类的微生物具有不同的代谢方式，能够分解各种各样的有机质，因此，在自然界中虽然存在着千万种分解程度难易不同的物质，但亿万年来在地球上并没有堆积起任何一种物质，这就是因为不同种类的微生物能分解不同的物质所致。当前，国内外都喜爱利用微生物来防治公害，就是利用不同种类微生物的不同代谢方式，作用于不同结构物质的结果，也就是利用微生物各尽所能，各取所需，协同作战于三废物质中。另一方面，不同种类的微生物能积累的代谢产物也不同，所以发酵工业上常利用各种微生物来生产各种发酵产品，如酒类、酒精、丙酮-丁醇、抗生素、酶制剂、有机酸、氨基酸、核酸、医药和化工产品等。

（三）繁殖快

在适宜的条件下，生产丙酮-丁醇的梭状芽孢杆菌等能在20～30min繁殖一代，一昼夜就能繁殖72代，若照此繁殖速度一昼夜可达47×1022个，但是，随着菌体数目的增加，营养物质迅速消耗，代谢产物逐渐积累，pH、温度、溶解氧浓度均随之而改变，适宜环境是很难持久的，所以微生物的繁殖速度，永远也达不到上述水平。但毕竟比高等动植物的生长速度还是快千万倍。例如，培养酵母生产蛋白质，每8h就可收获一次，若种大豆生产蛋白质，最短也要100d。可见，利用微生物生产发酵产品，其生产速度虽然赶不上化学合成，但比利用高等动植物要快得多，而且有许多生理活性物质，如蛋白质（酶），绝大部分的抗生素等用化学合成尚不能生产。

菌体的繁殖速度决定于繁殖一代所需要的时间，而繁殖一代所需要的时间，是以不同的微生物或相同种类的微生物在不同条件下培养而各不相同的。一般在糖质培养基中，大肠杆菌繁殖一代的时间为13～17min，枯草杆菌约为30min，酵母为1～2h。微生物的这一特点，为工业生产提供了有利条件。

（四）分布广

在自然界中，上至天空，下至深海，到处都有微生物存在。特别是土壤，更是各种微生物的大本营。据估计，一亩（1亩＝666.6m2）肥沃的土地，在150cm深的表土内就有300kg以上的真菌和裂殖菌。浓香型曲酒的生产，传统使用特定的土壤窖池，就是利用土壤微生物协同作战而生成的发酵产品。我们很多工业上利用的菌种，不少来源于土壤。但也要考虑微生物的生态特征，如分离酒类发酵的酵母，一般是从水果表皮或果园土壤中分离的。

（五）容易培养

大多数微生物都能在常温常压下，利用简单的营养物质生长，并在生长过程中积累代谢产物。因此，利用微生物发酵生产食品、药品、化工原料都比合成法具有更多优点：

（1）不需要高温高压设备，如发酵生产酒、醋、酱油等。

（2）利用原料比较粗放，如利用甘薯制酒精、酒、柠檬酸等。

（3）不用特殊催化剂，一般产品是无毒的。

（六）易变异

由于微生物的个体小，对环境变化的抵抗性差，因此当环境发生剧烈变化时，大多数个体容易死亡而被淘汰，个别的个体则发生了变异而适应于新的环境。又因为大多数微生物都进行了无性繁殖，容易发生变异，而且这种变异也具有相对的稳定性。因此，在生产上就利用这一特性，通过生产菌种的选育，配合发酵条件的改革，可以使产量大幅度提高。酿酒工业上采用的“东酒一号”、“UV-11”等菌种都是通过诱变育种得到的糖化力很高的新菌株。

微生物在自然条件下，经长期累代培养后，有时也会发生变异。如被用来制造甜酒曲的根霉菌在接种数代后，其糖化力往往下降。一般在酒厂里，酵母菌不容易变异。曲霉由于能起吻合作用，比酵母易变异。但也常只是个体，很少影响到群体。酒厂所用的菌种并不是那么容易发生变异的，不要遇到生产力下降，就怀疑菌种发生了变异，不去注意生产中的各个环节，而盲目地更换菌种。

（七）代谢力强

由于微生物的个体小，具有极大的表面积和容积的比值。因此，它们能够在有机体与外界环境之间迅速交换营养物质与废物。从单位质量看，微生物代谢强度比高等动物的代谢强度大几千倍至几万倍。例如酒精酵母，1kg菌体一天内可发酵几千千克糖，生成酒精。从发酵工业的角度来看，代谢能力强，在短时间内，能把大量基质转化为有用产品，这是极其有利的。

二、微生物与环境

（一）微生物对营养的要求

微生物虽然是低级生物，但是它和一般生物一样，具有新陈代谢、生长发育、遗传变异等生命活动规律，需要从外界吸收营养物质，通过新陈代谢作用，从中吸取能量，并合成新的细胞物质，同时把体内废物排出体外。因此，营养物质是微生物生命活动的物质基础。

所谓营养物质，就是指环境中可被微生物利用（通过分解代谢和合成代谢）的物质称为营养物质。微生物对营养物质的要求是多种多样的，有些微生物能够利用的物质十分广泛，有的却十分狭窄。尽管微生物对营养的要求是各式各样的，但从微生物细胞的化学组成、微生物所需的基本营养及其主要功能等方面，都具有共同的规律。

微生物细胞的化学组成：在人工培养、利用、控制微生物的时候，首先必须根据它们的营养特点来确定供给它们的营养物质。而营养物质的确定，主要是依据组成细胞的化学成分，及我们所需要的代谢产物的化学组成。因此，分析微生物的细胞化学组成，是了解微生物营养的基础。

微生物细胞的化学组成见表2-1。

可见，微生物细胞的化学组成，主要是碳、氢、氧、氮，占全部干重的90%～97%。此外，还有一部分微量元素，例如钾、镁、钙、硫、钠、铁等，还有含量很少、但缺少它们就不能生长的一些物质，称为生长素。微生物中各种化学成分的含量因微生物的种类、菌龄、培养基的组成、培养条件而异。

（二）影响微生物繁殖的化学因素

1．水分

微生物细胞中含水量很大，一般细胞含水70%～90%。细菌的芽孢和霉菌的孢子含水量较少。水的一部分以游离状态存在，另一部分以结合状态出现。水是微生物细胞的主要组分，微生物生长必须有水，一切营养物质要先溶解于水，才能扩散到细胞内被吸收利用；细胞内的各种生理生化反应也必须在水溶液中进行。由此可见，微生物没有水就不能进行生命活动。

2．碳源

碳素化合物是构成微生物细胞成分的主要元素，也是产生各种代谢产物和细胞内贮藏物质的主要原料。凡是能够供给微生物碳素营养的物质称为碳源，一般来说糖类物质是最好的碳源，其他如淀粉、有机酸、醇类等，也常作为微生物的碳源。

3．氮源

氮是构成微生物细胞蛋白质和核酸的主要元素，而蛋白质和核酸是微生物原生质的主要组分，也可为微生物有机体提供能量。所以，氮是微生物的一种不可缺少的营养要素。氮的来源可分为无机氮（指分子氮、硝酸盐、铵盐等）和有机氮（指蛋白质、蛋白胨、各种氨基酸、尿素、豆饼粉、花生饼、鱼粉等）。微生物种类不同，对氮源的要求也不同。在酒精发酵工业中，用来糖化淀粉的黑曲霉能利用硝酸盐和铵盐作为氮源，而产生酒精的酵母菌却只能用铵盐作为氮源，不能利用硝酸盐作为氮源。

4．无机盐类

无机盐类是微生物生命活动不可缺少的物质。它的主要功能是：构成菌体的成分；作为酶的组成部分；调节培养基的渗透压、酸碱度、氧化还原电位和酶的作用等。一般微生物所需的无机盐类包括磷酸盐、硫酸盐、氯化物和含钠、钾、镁、钙、铁等元素的化合物，尤其是磷酸盐对菌种代谢遗传有密切关系。微生物对无机盐的需要量是极少的，但是缺了它就不行，常常在其他营养成分中夹杂一点就能满足需要。例如，在井水中含有钙盐和镁盐就能满足微生物对钙、镁的要求。曲霉孢子放在水中不能发芽，因为孢子发芽时需要有外界营养，蛋白胨及氨基酸可以提高发芽率。有人对曲霉孢子发芽所需营养做过试验，说明缺乏碳源、氮源、磷盐、镁盐时会严重影响发芽。

5．生长素

生长素是指维持生命的要素，狭义来说，是指维生素。它是维持微生物正常生活必不可少，但需要量又极少的特殊营养物质。例如，有些微生物在具有适宜的水分、无机盐、碳源和氮源的条件下，仍不能生长或生长不好。如果加入少量酵母浸出液或麦芽汁生长就好了，这是因为浸出液中含有某些微生物所不能合成的生长素，如多种氨基酸、维生素、组成核酸辅酶的嘌呤、嘧啶碱等。

（三）物理因素对微生物生长发育的影响

1．温度

温度对微生物的影响很大，因为微生物的生长发育是一个极其复杂的生物化学反应，这种反应需要在一定的温度范围内进行，所以温度对微生物的整个生命过程都有着极其重要的影响。

从微生物的总体来看，生长温度范围很广，可在0～80℃，各种微生物按其生长速度可分为三个温度界限，即最低生长温度、最适生长温度、最高生长温度。超过最低和最高生长温度的范围，生命活动就要中断。因此，我们在生产中，可以通过对温度的控制来促进有益微生物的生长，抑制或消灭有害微生物的发育。

那么，什么是最低生长温度呢？它是指微生物生长与繁殖的最低温度，在这个温度时，微生物生长最慢，低于这个温度，微生物就不能生长。最适生长温度是指微生物生长最适宜的温度，在这个温度时，如果其他条件适当，则微生物生长最快。而最高生长温度就是在其他环境因素保持不变前提下，微生物能够生长繁殖的最高温度。高于这个温度，微生物的生命活动就要停止，甚至死亡。

在物理因素中，温度对微生物的影响最为重要。微生物在生长繁殖过程中吸热反应和放热反应是共同进行的。在发酵前期要给予适当温度，以后要适当控制温度，防止升温过猛。“低温入窖、缓慢发酵”的精神实质就在于此。

微生物的生长繁殖，不但受到外界温度的影响，更重要的是外界温度与菌体内部保持热平衡。也就是说，外界环境的温度影响到微生物的生长繁殖，反过来，微生物在大量的生长繁殖过程中也影响外界环境温度的改变。如酒精厂在固体制造麸曲过程中的中期和后期，由于微生物的代谢作用，品温逐渐上升，向着微生物生长繁殖的不利方向发展。为了控制微生物生长的最适温度，保证曲子质量，根据品温上升情况，采取通风方法来降低品温.国内酒精厂生产麸曲时，品温要求保持在37℃左右。初期菌体刚刚开始生长，发热量不大，这时采用间歇通风方式，到后期，菌体生长旺盛；伴随产生大量的热，因此采用连续通风来降低品温。

高温对微生物影响较大，微生物在超过最高生长温度以上的环境中生活，就会引起死亡，温度越高，死亡越快。但是，微生物对高温的抵抗力依菌的种类、发育时间、有无芽孢而异。例如，无芽孢的细菌在液体中，55～60℃经30min即可死亡；70℃时仅10～15min死亡；100℃仅几分钟就可死亡。酵母营养细胞及霉菌菌丝体，在50～60℃时10min左右即可杀死；而它们的孢子在同样时间内却要70～80℃才能杀死。芽孢杆菌中的芽孢对热的抵抗力很强，如枯草杆菌芽孢在沸水中煮沸1h也不死，这是因为芽孢内所含水分较少，菌体蛋白不易凝固。

微生物在高温下死亡的原因，是由于菌体中的酶遇热后失去活性，使代谢发生障碍而引起菌体死亡。

2．氢离子浓度（pH）

氢离子浓度对微生物生命活动的影响，是由于氢离子浓度影响细胞原生质膜的电荷，原生质膜具有胶体性质，在一定pH内，原生质带正电荷，而在另一种pH内，则带负电荷，这种正负电荷的改变，同时又会引起原生质膜对个别离子渗透性的变化，从而影响微生物对营养物质的吸收。例如，黑曲霉在pH2～3时，生成柠檬酸，pH近中性时却生成草酸；酵母在pH为5左右时，其产物是乙醇，而pH8时则产生甘油。

表2-2为各种微生物生长最适pH和pH范围。

各种不同的微生物要求的pH不同，大多数细菌，最适pH接近中性或微碱性；酵母和霉菌的最适pH趋向酸性。

在酿酒工业中，广泛利用pH抑制杂菌的生长。酒精厂循环酒母添加硫酸；白酒厂入窖酒醅有一定的酸度，就是利用pH的适宜范围来抑制不适宜该范围的杂菌。

现在各厂一般利用酸度（1g曲或糟消耗0.1mol/L NaOH液的毫升数）来指导生产，已经取得了很成熟的经验。

3．空气

大多数微生物在生命活动过程中都需要空气，按照各种微生物对氧的要求不同，可将它们分成如下三类。

（1）好气性微生物 也称为好氧性微生物，这类微生物在生活中需要氧，只有在氧分子存在的条件下，它们才能正常生活。大多数微生物都属于这一类型，如根霉、曲霉等。在制造压榨酵母时通风可以增加酵母的产量。微生物深层培养时，通入空气不但影响微生物的生长，还影响微生物的代谢产物，如在抗生素、液体曲、有机酸的生产过程中通风量对产品的产量有很大的影响。

（2）厌氧微生物 也称专性嫌气微生物。这类微生物不需要分子态氧，分子态氧对它们有毒害作用。如丙酮-丁醇菌及其他梭状芽孢杆菌（如窖泥中能产生己酸的细菌），只能在无氧或缺少氧的状态下生活。

（3）兼性嫌气性微生物 有相当多的微生物既能在有氧条件下生长，又能在无氧条件下生活。如酵母在有氧条件下迅速生长繁殖，产生大量菌体，在无氧条件下，则进行发酵，产生大量的酒精。

在实验室培养好气性或兼性嫌气性微生物，若用固体培养基，则通过棉塞的少量空气即可满足；若用液体培养基，就需在摇床上培养。而对厌氧性微生物的培养，可以用抽真空、焦性没食子酸吸收、覆盖无菌石蜡等方法。

4．界面

界面与微生物生长有很大关系，特别是对固态法白酒生产来说，界面尤为重要。

我们知道自然界里栖息着大量的微生物，它们生活在不同的状态之中。有的在气相中生长，有的在均一的液相中生长，有的却生长在各式各样的固相上。但是为数极多的微生物却居住在两个不同的接触面上，这种接触面称作界面。居住在界面的微生物群，其生长与代谢产物都与居住在均一相内的有明显不同，这就是界面对微生物的影响关系。

在不同培养基中（例如米曲汁、米曲汁加乙酸、米曲汁加乳酸）。添加经酸碱处理过的玻璃丝作界面，分别培养三种酵母（南阳、汉逊、1312）发酵试验，不论米曲汁或添加乙酸、乳酸的培养基中，乙酸乙酯的生成量都大幅度增加。证明了液体中有固体界面物质对酵母的代谢有明显的影响。

辽宁金县酒厂实验证明，固态法白酒与液态法白酒质量不同的关键在于前体物质、蒸馏操作，特别是由颗粒组成的复杂的界面，是使两者不同的重要原因之一。例如，以糖蜜原料液态发酵的酒，完全是液态酒的风味，而同样原料，添加稻壳固体发酵，就会有固态法白酒的风味。所以说，白酒固态发酵，界面极为复杂。原料、酒醅、填料对发酵微生物的吸着状态及其对酶活力与代谢的影响；原料粉碎细度，即颗粒大小对发酵微生物的影响；加水量的多少，改变了固-液的比例关系对发酵微生物的影响。浓香型酒生产中，鼓槌状菌为什么接种于酒醅中的效果远不及接种于泥土中效果显著，及黏土界面与梭状菌的关系等，都是研究白酒发酵中，界面关系的重要课题。

以上介绍的与微生物有关的物理、化学因素对微生物生长繁殖的影响，是相互交织在一起的，以致构成复杂的发酵过程。

三、微生物实验室

（一）基础设施要求

进行菌种培养的厂家，应设置符合微生物操作相关要求的显微镜检查室、微生物培养室、培养基制备室、菌种保藏室、无菌室及保温室等，一般酒厂可一室多用。

1．无菌室

无菌室一般是在微生物实验室内专辟一个小房间。可以用板材和玻璃建造。面积不宜过大，4～5m2即可，高2.5m左右。无菌室外要设一个缓冲间，缓冲间的门和无菌室的门不要朝向同一方向，以免气流带进杂菌。无菌室和缓冲间都必须密闭。室内装备的换气设备必须有空气过滤装置。无菌室内的地面、墙壁必须平整，不易藏污纳垢，便于清洗。工作台的台面应该处于水平状态。无菌室和缓冲间都装有紫外线灯，无菌室和紫外线灯距离工作台面1m。工作人员进入无菌室应穿灭过菌的服装，戴帽子。

无菌室的具体要求如下：

（1）无菌室应设有无菌操作间和缓冲间，无菌操作间洁净度应达到10000级，室内温度保持在20～24℃，湿度保持在45%～60%。超净台洁净度应达到100级。

（2）无菌室应保持清洁，严禁堆放杂物，以防污染。

（3）严防一切灭菌器材和培养基污染，已污染者应停止使用。

（4）无菌室应备有工作浓度的消毒液，如5%的甲醛溶液，70%的酒精溶液，0.1%的新洁尔灭溶液等。

（5）无菌室应定期用适宜的消毒液灭菌清洁，以保证无菌室的洁净度符合要求。

（6）需要带入无菌室使用的仪器、器械、平皿等一切物品，均应包扎严密，并应经过适宜的方法灭菌。

（7）工作人员进入无菌室前，必须用肥皂或消毒液洗手消毒，然后在缓冲间更换专用的工作服、鞋、帽子、口罩和手套（或用70%的酒精再次擦拭双手），方可进入无菌室进行操作。

（8）无菌室使用前必须打开无菌室的紫外灯辐照灭菌30min以上，并且同时打开超净台进行吹风。操作完毕，应及时清理无菌室，再用紫外灯辐照灭菌20min。

（9）供试品在检查前，应保持外包装完整，不得开启，以防污染。检查前，用70%的酒精棉球消毒外表面。

（10）每次操作过程中，均应做阴性对照，以检查无菌操作的可靠性。

（11）吸取菌液时，必须用洗耳球吸取，切勿直接用口接触吸管。

（12）接种针每次使用前后，必须通过火焰灼烧灭菌，待冷却后，方可接种培养物。

（13）带有菌液的吸管、试管、培养皿等器皿应浸泡在盛有5%来苏尔溶液的消毒桶内消毒，24h后取出冲洗。

（14）如有菌液洒在桌上或地上，应立即用5%石炭酸溶液或3%的来苏尔倾覆在被污染处至少30min，再做处理。工作衣帽等受到菌液污染时，应立即脱去，高压蒸汽灭菌后洗涤。

（15）凡带有活菌的物品，必须经消毒后，才能在水龙头下冲洗，严禁污染下水道。

（16）无菌室应每月检查菌落数。在超净工作台开启的状态下，取内径90mm的无菌培养皿若干，无菌操作分别注入融化并冷却至约45℃的营养琼脂培养基约15mL，放至凝固后，倒置于30～35℃培养箱培养48h，证明无菌后，取平板3～5个，分别放置工作位置的左中右等处，开盖暴露30min后，倒置于30～35℃培养箱培养48h，取出检查。100级洁净区平板杂菌数平均不得超过1个菌落，10000级洁净室平均不得超过3个菌落。如超过限度，应对无菌室进行彻底消毒，直至重复检查合乎要求为止。

2．培养基制备室

培养基制备一般在化验室中进行，主要是对培养基和玻璃仪器进行灭菌，主要设备为高压灭菌锅及干热灭菌箱，对无菌操作要求不高。

灭菌方法主要有干热、湿热灭菌等。

（1）干热灭菌 直接利用火焰将微生物烧死（如烧接种环、载玻片和试管口等）。不能用火焰灭菌的物品则利用热空气灭菌，将物品放在烘箱中加热。为了保证灭菌效果，一般规定：135～140℃灭菌3～5h；160～170℃灭菌2～4h；180～200℃灭菌0.5～1h。此法适用于玻璃、金属和木质的器皿。在灭菌过程中或灭菌后未降温时，不宜打开箱门，否则纸与棉塞会燃烧，玻璃仪器也易破裂。

（2）湿热灭菌 在各类湿热灭菌法中，经高压蒸汽灭菌效果最好，其蒸汽温度可达121℃，能将耐热的芽孢在30min内全部杀死。但对某些易破坏的物质，如某些糖或有机含氮化合物，宜在0.06MPa下（110℃）灭菌15～30min。使用高压灭菌锅时，尽量将锅内的冷空气排尽，以免压力表的指示压力已到规定值而锅内温度达不到要求温度。另外，灭菌结束后，要缓慢放汽，以免降压太快使液体培养基喷染棉塞。

3．保温室

恒温箱的容量有限，因此利用大三角瓶及卡氏罐等容器培养微生物，应放在保温室中进行。保温室不宜过大，通常面积为2m2，高2m左右。墙壁用保温材料，室顶在适当位置设置换气筒。室内使用暖气或电热器配合自动控温调节设备进行控温，应注意安全。

（二）微生物实验室用具

1．无菌箱或超净台

（1）无菌箱 若无菌操作的工作量不大，可不利用无菌室杀菌后操作，而使用无菌箱。无菌箱置于洁净的房间内，也可放在无菌室。无菌箱由专业厂生产，其材质为有机玻璃。正面有2个手孔，上面装有袖套；左面有物料进出的孔，以转动孔门的螺纹而开闭；箱顶装有照明灯、紫外灯，并设装有过滤介质的通气柱。

（2）超净台 设有一套空气层流装置。屋内的空气经预过滤器，由风机送入加压箱，再通过超细玻璃纤维后，进入均压层，以水平层流恒速流至操作区。

超净台由专业厂生产，有单人或双人操作2种，可按需选购。其气流速度为0.3～0.5m/s，空气净化率能达99.95%以上，可放置于洁净的室内，使用时台上尽可能少放物品，以免干扰空气层流；也需定期检查无菌效果。超净台适用于酿酒酵母及细菌的操作，对于带孢子的霉菌则未必适用，因孢子经空气吹动会飞扬。

2．接种用具

接种用具为若干接种针及1盏酒精灯。

接种针由针部和杆部组成。针部可为23号铂丝，但其质地较软；也可用粗细适当的电炉丝代替，但在操作时应注意其散热较慢的特点。杆部可采用市售的金属接种棒，可将针部插入，用螺帽夹紧，也可随时取下针部；或以长20cm左右、粗细合适的铜棒为杆部，用小钻子在其一端中央钻1个小孔后，再将电炉丝插入孔内，然后用小锤砸牢；也有用玻璃作杆部的，将长约7cm的电炉丝的一端用镊子夹住，把另一端插入在酒精灯上加热而融软的玻璃棒内。以金属为杆部时，应在手握到的部位包以绝热材料。

针部的一端可做成直径约2mm的圆环，称为环状，常用于液态种子的微量移植；针端呈针状，常用于平板菌体与固态试管培养基或固态试管培养基与试管固态原菌之间的转接；针端呈钩状，一般用于转接固态的霉菌等菌丝体。使用后的接种针，可放入盛有酒精的量筒内。

若移植较多的液态菌体，则需无菌吸管。吸管的玻璃部分可预先用牛皮纸包好后进行干热灭菌；橡皮吸头部分，可泡于酒精内，待使用时取出。

3．高压灭菌锅

（1）小容量高压灭菌锅 可以煤气或电等为热源。

（2）容量较大的高压灭菌锅 可用蒸汽为热源。可对在高压下不会有大变化的培养基及玻璃仪器进行灭菌。有芽孢的细菌，以70kPa的蒸汽灭菌20min，或98kPa的蒸汽灭菌15min，即可完全杀灭。

灭菌锅必须安装压力表和安全阀，安全阀要经常检查，以免生锈失效。在使用高压锅灭菌时，一定要将锅内的冷空气排尽，以免造成压力表的指示压力已到规定值而锅内温度较低的假象；灭菌结束后，要缓慢地或间歇式进行排气，以免降压太快而使液态培养基喷染棉塞。

通常每个厂应置备上述2种容量不同的高压灭菌锅，可根据平时的实际需要轮换使用。

若无高压灭菌锅，可用100℃的常压蒸汽灭菌3次，即1天1次。其原理是对于普通不形成芽孢的细菌，经100℃蒸汽灭菌30min即可全部杀灭；但芽孢杆菌则难以杀灭，然而第1次未杀死的芽孢杆菌，在30～37℃下，第2次即能变为营养体，可被第2次的常压蒸汽杀灭。如此3次常压灭菌，即可保证杀菌安全，称为间歇式灭菌法。

4．干热灭菌箱

干热灭菌箱设有双层门；有2组电热丝，分别用以升温和恒温；箱顶有气孔，若用于干燥，则应配有小的风机。使用时，应经常注意该设备的恒温装置是否失灵，以免升温过高而引起火灾。

将需灭菌的已塞棉塞的试管、三角瓶，或用牛皮纸包好的培养皿等玻璃用具，放入干热灭菌箱内，注意不要使棉塞或纸接触箱壁。以免棉塞和报纸发黄、燃烧或纸变脆而破裂。在灭菌过程或灭菌结束未降温时，不宜打开箱门，以免引起纸、棉塞燃烧和玻璃仪器破裂。

5．培养箱

培养箱又称恒温箱或保温箱，使用时也应经常注意温度控制系统是否失灵。

6．冰箱

冰箱用于存放菌种及无菌培养基，注意不要放液态而敞口的物品，以免液体蒸发，使菌种的棉塞受潮而容易污染杂菌。

7．显微镜

白酒厂所用的显微镜为光学显微镜，使用时应严格按说明书的内容操作。

上述设备及仪器的说明书，应由专人保管，别人借阅后须及时交还；或将说明书用粗线绳串起来，挂于安置设备或仪器的墙上，便于查阅。

8．玻璃器皿

（1）试管 不要使用翻口的试管。试管的长度通常为其直径的10倍。如18mm×180mm的试管，通常用于液态培养或盛倒平板用的固态培养基；15mm×150mm的试管，可装酵母和细菌培养用的斜面培养基；10mm×100mm者，用于生理试验或保存原菌。

（2）培养皿 培养皿以其直径分为6cm、9cm、12cm、15cm、18cm、21cm等多种。一般分离酵母或细菌时多使用直径为9cm培养皿，因其操作方便且不易污染杂菌；分离霉菌等产生大量菌丝及孢子的微生物时，可采用较大的培养皿。

（3）三角瓶 又名锥形瓶。它以其容量定规格，应选用带有刻度的三角瓶。

（4）其他 常用的载玻片，其大小为7.5cm×2.5cm×（0.1～0.13）cm；盖玻片为1.8cm×1.8cm，盖玻片有厚薄之分，薄片用于镜检，厚片用于血球计数计测细胞数。

涂布器：用于菌种分离及平板活菌计数时涂布平板培养基，可用直径为3～4mm、长25cm的玻璃棒，在酒精喷灯上将其一端弯成每边长为3cm的等边三角形，再把该三角形平面与柄弯成140°的角即可。

四、消毒与灭菌

在生产实践中，对微生物都要求用纯种培养，不应存在任何杂菌，所以要对原料和环境进行消毒和灭菌。消毒一般是指用化学方法消灭或减少有害微生物。灭菌是指用化学或物理方法杀死微生物。

（一）消毒

制曲生产常用的消毒剂有以下4种。

甲醛溶液：每立方米空间用5～8mL熏蒸房间。熏蒸时，房间关闭紧密，房间可预先喷湿以加强效果。

硫磺：每立方米空间用15g。

75%酒精溶液：75%酒精溶液常用于皮肤或器皿的消毒。

新洁尔灭溶液：原浓度为5%，稀释成0.25%，用于皮肤或器皿消毒，但它只能杀死菌体，不能杀死孢子。

（二）灭菌

1．干热灭菌

适用于三角瓶、试管、培养皿、吸管等，在160～180℃维持1～2h便可达灭菌目的。如灭菌时间长，可采用间歇式，效果更好。

2．湿热灭菌

在同样温度下，有水分存在时比干燥状态易于灭菌。主要方法有：

（1）煮沸灭菌法 直接将要灭菌的物件放在水中煮沸5min以上，即可杀灭细菌的全部营养细胞和一部分芽孢。

（2）蒸汽加压灭菌法 一般在0.1MPa蒸汽压力下20～30min即可杀灭各种微生物及其芽孢。

（3）间歇灭菌法 将需灭菌的物品，在常压下以蒸汽加热1h，杀灭其中微生物细胞。冷却后，放于30～37℃恒温箱中培养1d，使残存的微生物芽孢萌发为营养细胞，再以同法加热，如此反复3次，一般可达到彻底灭菌的要求。

（4）低温消毒法（巴氏灭菌法） 是利用微生物的营养细胞在60℃加热30min后即被杀灭的原理。

湿热灭菌主要用于培养基的灭菌，也用于器皿、工具、材料的灭菌。

3．紫外线灭菌

紫外线灭菌能力很强，但必须有一定的强度，作为室内灭菌很方便。但不能达到完全灭菌的目的。在具体的使用过程中，应注意定期更换紫外灯，注意调节紫外灯的距离等。

五、接种

（一）接种工具

常用的接种工具有接种针、接种钩和接种环。对针、钩和环的要求是能在火焰上烧灼时很易烧红，而离开火焰后又能很快地冷却。最好用白金丝，但价格昂贵，现在都用电炉丝代替。接种环的内径约2mm，环面应平坦。

（二）接种准备工作

如果在接种室操作，接种室应经常打扫，用煤酚皂液擦洗桌面及墙壁，用甲醛熏蒸。接种前应打开无菌室紫外灯灭菌半小时。接种操作人员进入接种室前，应先做好个人卫生工作，换工作鞋，穿无菌工作衣，戴口罩（工作衣、口罩、工作鞋只准在接种室内使用，不准穿着到其他地方去，并定期换洗和消毒灭菌）；在超净工作台上进行（一般适用于斜面试管、三角瓶种子的接种），先用75%的酒精溶液擦净工作台面，开启超净工作台10min后即可接种。对接种的试管、三角瓶等应做好标记，注明菌种名称，接种日期或培养基名称等。

（三）试管菌种的接种操作

试管菌种的接种是将试管原菌在无菌的条件下移接至另一试管培养基上。试管接种中原菌的纯粹与否，是生产实践中的一个极重要的关键，因此必须掌握好试管菌种的接种技术。进行接种时，手用肥皂洗净，再用75%酒精擦手，或新洁尔灭溶液消毒。接种操作如图2-1所示。

扩大移接三角瓶固体培养基、三角瓶液体培养基或试管液体培养基等，接种原理相同，操作方法也基本一致。接种操作简单，多练习几遍即能掌握。接种工作非常关键，因为污染杂菌，多发生在这个过程。

六、菌种的保藏

（1）斜面菌种保藏法 将已长好的斜面菌种，置于4℃左右的冰箱中保藏。一般可保存2～3个月，长则半年。每隔一定时间进行移接培养菌种。

（2）矿油保藏法 适用于嫌气性细菌，不适宜于酵母菌，更不适宜霉菌。将已灭菌的液体石蜡，在无菌操作下，注入已长好的斜面菌种试管里，油层高于菌种斜面1cm。最后密封管口，置于室温或冰箱内保藏，保藏时间为1～2年。

（3）沙土管保藏法 将沙子用水洗净，烘干，过60目筛。另外采净土（距地面33cm以下），晒干，磨细，用120目筛子过筛。以60%沙与40%土相混，每小试管装上述混合土1g。充分灭菌后，每管加孢子悬浮液几滴。封口前放于干燥器内真空干燥。

（4）冷冻保藏法 在这类保藏中，几乎利用了一切有利于保藏的因素，故是目前最好的一类综合性保藏方法。保藏时间为5～15年，适合于各大类菌种保藏。