第二节　色谱法

1906年俄国植物学家茨维特（Tswett M）所创立的色谱法，是近代有机分析中应用最广泛的方法之一，既可用于有效地分离复杂混合物，又可以用来纯化、鉴定物质，尤其适合于少量物质的分离鉴定。

色谱法是利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能（即分配）的不同，或其他亲和作用性能的差异，使混合物的溶液流经该种物质，进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组分分开。流动的混合物溶液称为流动相；固定的物质称为固定相（可以是固体或液体）。色谱法从不同的角度分为不同的类型。

（1）按流动相和固定相所处的状态分类：用气体作流动相的称为“气相色谱”，用液体作流动相的称为“液相色谱”。由于固定相也可以是液体和固体，因此可按表1-3分类。

①液-液（分配）色谱也包括用化学方法把固定液键合在载体表面上的技术。

（2）按固定相的固定方式不同，又可分为柱色谱法（固定相装在色谱柱中）、纸色谱法（用滤纸上的水分子作固定相）和薄层色谱法（将吸附剂粉末制成薄层作固定相）等。

（3）根据组分在分离过程的作用性质不同，可分为四种类型：吸附色谱法（利用吸附剂表面对不同组分的物理吸附性能的差异进行分离），分配色谱法（利用不同组分在两相中有不同的分配系数来进行分离），离子交换色谱法（利用离子交换原理进行分离）和排阻色谱法（利用多孔性物质对不同大小分子的排阻作用进行分离）。

本节将扼要叙述柱色谱法、纸色谱法、薄层色谱法和气相色谱法。

一、柱上吸附色谱法

柱上吸附色谱法的作用原理是：利用混合物中各组分在吸附剂和洗脱剂之间吸附和解吸附能力的差异，将各组分分离。当组分分子到达吸附剂表面时，由于吸附剂表面与组分分子的相互作用，使组分分子在吸附剂表面的浓度增大，这种现象称为吸附。当洗脱剂连续通过吸附剂表面时，组分分子会被洗脱剂解吸附下来（洗脱剂对组分分子有作用力），在一定温度下，吸附和解吸附达到平衡。但由于洗脱剂不断地移动，致使这种吸附与解吸附的过程会反复发生并建立新的平衡，组分分子就随洗脱剂移动，移动的速度与组分分子的平衡常数（或称吸附系数）和洗脱剂的流速有关。通过控制流动相（洗脱剂）的流速，各组分就依据其平衡常数的不同而得到分离。方法是将混合物溶于适当溶剂中，使溶液经由填装有吸附剂的吸附柱中流过，前者称为流动相，后者称为固定相。由于各组分被吸附的强弱程度不同，形成一系列色层带。吸附强的组分留在吸附柱上端，吸附弱的留在下端。在色谱法中常将流动溶液称为显层剂或展开剂，溶质移动速率与显层剂移动速率的比值成为比移值，用Rf来表示：

如果溶质与显层剂在柱上同时出发移动，那么这个比值也可用在一定时间内两者移动的距离来表示：

在给定的实验条件下，Rf值对于某一溶质是一个特征值，因此可借色谱法鉴定物质。被吸附分子与吸附剂间的作用力可能是一种范德华作用力，有时也可能是氢键作用。溶质被吸附的强度与它的分子结构有密切关系。一般来说，随着分子中双键、叁键尤其是共轭键的增加（如果用的是极性吸附剂），以及分子量的增加，极性增加，吸附能力也将增加。极性官能团的极性按下列次序降低：

芳香烃的吸附能力大于脂肪烃，不饱和烃的吸附能力大于饱和烃。脂肪族化合物被吸附的能力随碳链的增长而增大。在芳香族化合物中，多环芳烃易被吸附，稠环个数愈多，愈易被吸附。

溶质在吸附剂上的吸附与溶剂在吸附剂上的吸附常相竞争。如果显层剂与吸附剂间的吸附力大于溶质与吸附剂间的吸附力，溶质就不能被吸附而随着溶剂冲下，这就是“洗提”或“洗脱”。如果情况相反，溶质就被牢固地吸附着而显出较低的Rf值。溶质、溶剂与吸附剂三者的介电常数、偶极矩、形成氢键的能力以及相对极化度决定着这一竞争的结果。

柱上吸附色谱法所用的仪器很简单，只需要一只适当长度、适当口径的玻璃管，管下口做一紧缩处及一斜口，再连一个吸滤瓶即可，如图1-14所示。一般操作步骤是：先在干燥玻璃管中填装吸附剂（三氧化铝或硅胶等）。自柱顶端加入待色谱试样的溶液，然后用原来溶剂或其他适当溶剂冲洗，使之分出色层带。这一步骤称为“显层”。待溶剂前沿达到管底部后，操作停止。各色层的分离一般有以下两种办法。①推出法：将吸附剂自吸附管中推出，用小刀将各色层带切开（如图1-15所示），分别用适当溶剂提取，滤去吸附剂，将滤液浓缩就可以得到各组分。当用这种办法分离时，吸附柱玻璃管不能用下口紧缩的，必须用如图1-16所示的吸附柱装置，柱长130mm，直径9mm。②洗提法：待显层后，用一种极性较强、吸附力较大的溶剂将各组分依次顶替下来，用几个接收器分别接收流出的各个组分。这一步骤称为“洗提”，洗提用的溶剂称为洗提剂。将各份洗提液浓缩即得到各组分。

配制样品溶液时，最好配成较浓的溶液，这样显层的色层带方能很窄，容易分离清楚。所用的溶剂必须吸附力较弱，使吸附剂能将样品自溶液中吸附出来。显层剂的选择往往凭经验决定。大致说来，石油醚、二硫化碳、苯、四氯化碳及氯仿代表弱显层剂；乙醚及异丙醚代表中等强度的显层剂；低分子量醇及酮代表强显层剂。吸附力强的显层剂可用作洗提剂。在尝试选用未知样品的洗提剂时，首先用石油醚，其次使用石油醚-苯混合物（混合比例由4:1至1:4），然后依次试用苯、苯-乙醚混合液、乙醚、乙醚-甲醇混合液及甲醇等。有机物自吸附剂上被提取出来的先后次序，随该物质的化学结构类型而定。有机物的极性愈大，被吸附的强度愈大，洗提出来的次序愈后。洗提出来的先后次序一般是：饱和烃，烯烃，双烯烃，芳烃，醚，酯，酮，醇，二元醇及羧酸。

吸附剂的选择也往往凭经验决定，一种合适的吸附剂应该具备这样一些条件：①它能够可逆地吸附待色谱的物质；②它不会引起被吸附物质的化学变化；③它的粒度大小应该能使显层剂以合适的速率流过（如10～15mm/min）；此外，吸附剂最好是白色或浅色的，以便对色层带进行观察。最常用的吸附剂是三氧化铝和硅胶，它们符合上述要求，并且经过不同处理可以随意得到不同活度。例如，三氧化铝可以在不同温度烘干达到各种不同活度。必须指出，活性大的吸附剂用于色谱法不一定最合适，因为活性太大，物质被吸附得太牢，以致不易被洗提下来。其他较常用的吸附剂有二氧化镁（用于吸附烃、醇、酮、醚及硝基化物等），碳酸钙（用于吸附叶色素），硫酸钙（用于吸附花色甙、维生素K1），氧化钙、氧化钛、碳酸钡、硫酸镁、无水碳酸钠（用于吸附叶绿素），滑石粉（用于吸附有机酸、酚类、2，4-二硝基苯腙），硅藻土、蔗糖（用于吸附叶绿素）及淀粉等。许多吸附剂遇水会失去活性，这时只能用无水溶剂。

当进行无色物质的色谱时，可用下面方法来找出色层带：①将吸附柱系统地切断，将各段逐一用溶剂洗提，鉴定各洗提液中的物质。②连续地洗提吸附柱，分别用接收器接收一定量的洗提液，然后鉴定各洗提液中的物质。③层吸完毕后，用显色剂显色，常用的显色剂见表1-4。④用紫外线照射，使能发荧光的物质发出荧光。对于不发荧光的物质，可以用发荧光的吸附剂。在普通吸附剂中加入某种能在紫外线照射下发荧光的无机物（如硫酸锌）或有机染料。该荧光染料以不致降低吸附剂的活性，且在给定的条件下又不会被洗提出者为宜。这时在柱上形成的色层带相应地改变了吸附剂原来荧光的强度，借这种改变可以了解色层带的位置。常用的荧光染料如桑色素用于三氧化铝柱，小檗碱用于硅胶柱，二苯基荧光吲啶磺酸及桑色素用于氧化镁或氧化钙柱。⑤制备有色衍生物，然后进行色谱分析。

①表中各显色剂是在以苯作显层剂，以硅胶作吸附剂的情况下使用的。各试剂的百分浓度，均为质量分数。

【例1-1】　柱上色谱法分离邻硝基苯胺、间硝基苯胺与对硝基苯胺（推出法）

分别以苯为溶剂，配置浓度为5mg/mL邻硝基苯胺、间硝基苯胺与对硝基苯胺溶液。将2mL邻硝基苯胺、2mL对硝基苯胺及4mL间硝基苯胺溶液混合作为试样液。取1mL混合试样液用石油醚（沸程60～70℃）稀释到5mL，然后进行下述色谱实验。

取ф18mm×200mm的吸附柱，管底填一小团棉花，然后加入氢氧化钙吸附剂（自一支宽颈漏斗中加入），边装边敲震吸附柱以装填密实，无空隙槽沟。填装至150mm高为止，柱顶盖以2mm厚的海砂。

将硝基苯胺的苯-石油醚溶液倒入吸附柱中，柱底轻微抽气。待溶液液面几乎与海砂齐平时，立刻加入纯石油醚作显层剂。分批加入，务必使在层吸过程中柱顶溶液不要流干。待最底层色层带距离管底约1cm时，停止层析。令柱干燥，用木杵将吸附剂推出。最上层鲜黄的色层带是对硝基苯胺（带宽约20mm）。相距40mm后，中间出现的黄的色层带是间硝基苯胺（带宽约25mm），最下层的黄的色层带是邻硝基苯胺（带宽约50mm）。下层与中间层往往靠得很近，有时相距仅5mm，必须仔细观察，方可以辨别出来。将各色层带切开分离，用含有10％乙醇的苯或纯苯分别萃取。蒸干各萃取液，得到各组分，分别测定熔点。

【例1-2】　柱上色谱法分离芴与芴酮（洗提法）

称取12.5g氧化铝。用一支玻塞上未涂润滑脂的酸式滴定管（50mL）作色谱管，在其中装入35mL石油醚（沸程40～60℃），将一小团棉花用玻棒推至管底。由一玻璃漏斗向滴定管中装入1cm厚的海砂，将管轻轻敲震使海砂平整。将氧化铝倒入管中，注意使氧化铝装平装实。在氧化铝顶层再盖一层细砂。打开活塞，令溶剂流出，直到上层砂面之上留有少许溶剂为止。

分别取25mg芴和25mg芴酮溶于少量石油醚中，并倒入柱内。先用石油醚洗提，用预先称好质量的10mL锥形瓶作为接收瓶，各瓶均编以号码。每当接收了5～8mL石油醚流出液后更换一只接收瓶。当总共用了20mL石油醚洗提后，或者滴定管尖端不再显出白色结晶时，表示芴已全部流出，再用苯洗提。这时可以看到芴酮的黄色色层带逐渐向下移动。待黄色色层带移近柱底时，再换一只接收瓶。用苯洗提到这一色层带全部洗下为止。分别浓缩各个级分，可得到纯的芴和芴酮，中间混合物级分几乎没有。测定产物质量及熔点。芴的熔点为116℃，芴酮的熔点为84℃。

二、柱上离子交换色谱法

离子交换色谱法的原理是：基于溶液中的离子与某种称为离子交换剂的吸附剂表面的离子之间的相互交换作用。离子交换剂实际上是含有碱性基团或酸性基团的高聚物，如取代酚及氨基酚与甲醛的缩合物、磺化煤或磺化聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸等。离子交换剂分为如下两类。

①阳离子交换剂：呈酸性，含—SO3H、—CH2SO3H、—COOH或—OH（酚羟基）等酸性基团，具有交换阳离子的能力；

②阴离子交换剂：呈碱性，含—NH2或＝NH 或等碱性基团，具有交换阴离子的能力。

用合成的方法可以得到各种活性不同的离子交换剂，用这些离子交换剂，同时采用不同pH值的溶液，可从混合物中选择性地提取各种酸、碱或盐类。

柱上离子交换色谱法仪器装置与柱上吸附色谱法相似。一支ф50mm具有玻璃活塞的滴定管（酸式滴定管）很适合作离子交换柱。放一小团棉花或玻璃毛在滴定管底部，将离子交换树脂拌着水分倒入滴定管中，装填至150～200mm高为止。

离子交换树脂放入交换柱中后，在任何时候都必须用水浸满，不使柱内有空气泡存在。

某些商品阳离子交换树脂为钠盐，称为Na型。在使用之前，需要用稀盐酸将它浸泡处理，使之成为游离酸型，然后用蒸馏水淋洗，直到洗下的水液中不含氯离子为止，这时的树脂称为H型。一些阴离子交换树脂是季铵的氯化物，使用之前也需要用碱处理使Cl型转变为OH型，然后使用。

进行离子交换时，经过下列步骤：①制备交换柱；②进行交换；③洗提，用一种电解质溶液将被阻留在树脂上的离子顶替下来；④再生，有时这一步与第三步所用电解质相同，有时用其他电解质处理。

每种交换树脂有一定的交换能力。一般每毫克干树脂约可交换1～9mmol当量的离子。为了使分离进行得彻底，最好每克树脂只让它交换相当于1/2最大交换量的离子。在交换分子量较大的有机离子时，最好选用交换程度较小的交换树脂。离子交换在工业生产及研究工作中应用极广。但在有机分析工作中，利用它来分析一般混合物有一定的局限性。这是由于以下几个原因造成的：①离子交换剂的交换量都很小，在采用实验室规模数量的交换剂条件下，每次只能分离数毫克的物质，因此只适用于自半微量混合样品中除去微量杂质，而不适用于分离半微量物质；②在一般操作条件下，只限于使用水溶液（如果将溶液流过交换柱的流速控制得极低，在这种条件下也可以用饱和了的水的乙醚溶液或95％乙醇溶液）；③交换下来的组分存在于极稀的溶液中，用这种极稀的溶液来鉴定或回收待分析的组分是颇为困难的。因此离子交换法最常用的场合是：当所要检验的物质已经处于很稀的水溶液中，而没有更好的分离方法将它分出的时候，所分出的组分需要用微量法来鉴定。

【例1-3】　除去羰基化合物

凡能与亚硫酸氢钠形成相当稳定的加成产物（α-羟基磺酸钠）的羰基化合物，都可以借亚硫酸氢盐型的阴离子交换树脂的交换作用将它自中性化合物中除去。例如，用这种方法可以自异丙醇中除去丙酮。

准备一支强碱阴离子树脂柱。令100mL0.5mol/L亚硫酸氢钠溶液流过交换柱，流速为5mL/min，再用200mL水淋洗交换柱。

将一滴丙酮加入40mL异丙醇及10mL水的混合液中，令该混合液以3mL/min的流速流过交换树脂柱。丙酮即被树脂阻留，然后可以用100mL 1mol/L氯化钠溶液将丙酮洗提下来。要从这么稀的溶液中分离并鉴定原来的丙酮是颇为困难的，极小心地按下述步骤尚可达到这一目的：将洗提液用氯化钠饱和，蒸出1mL，最后用这1mL的丙酮溶液制取其2，4-二硝基苯腙衍生物来加以鉴定。

【例1-4】　除去阳离子

从有机物水溶液中除去阳离子，可以借将试液通过强酸性阳离子交换树脂的办法来达到目的。

在交换柱中放入强酸性阳离子交换树脂，装填至20cm的高度。以100mL 10％盐酸流过树脂。用水淋洗交换柱，直到流出液对甲基橙呈中性反应为止。

取10～15mg氯化铁溶于适量的95％乙醇中。用所得溶液流过交换柱，流速约2～3mL/min。流毕，用50mL蒸馏水淋洗交换柱，铁离子将被树脂阻留。

三、纸上色谱法

纸上色谱法是以纸作为载体的色谱法，属于分配色谱。其原理是：利用混合物中各组分在两种互不相溶的液相间的分配系数不同，进行各组分的分离。它所使用的固定相一般为纸纤维（由几个葡萄糖分子组成的大分子，其中含有多个亲水性羟基，能与水分子形成氢键）吸附的水（或水溶液），而流动相为与水不相溶的有机溶剂。当被测组分在两相之间进行分配时，由于各组分分配系数的不同得到分离。分配色谱的方法原则上与液-液连续萃取方法相同。大致说来，如果溶质在流动相中的溶解度高，它将移动得快些，因而有较高的Rf值；反之，溶质在流动相中的溶解度低，而在固定相中的溶解度高，则它会移动得慢些，因而有较低的Rf值。由此可见，凡影响溶质在两个液相中溶解度的各种因素，都会影响分析时的Rf值。

纸上色谱法的操作是：取一根在展开溶剂的蒸气中放置过夜的长条滤纸，在滤纸下端2～3cm处用铅笔划好起始线，然后将要分离的样品溶液用毛细管点在起始线上，待样品溶剂挥发后，将滤纸的上端悬挂在展开槽的支架上，使滤纸的下端浸入一盛有展开剂的浅皿中，展开剂由于毛细管作用沿纸条上升。当展开剂前沿升到接近滤纸上端时，取下滤纸，记下溶剂前沿位置，使之干燥。如果被分离物中各组分是有颜色的，则滤纸条上就有各种颜色的斑点显出。较常见的情况是被分离物中各组分是无色的，这时待滤纸条干燥后，于纸上喷以显色剂而使各组分化合物的斑点呈现，这种操作方式称作上升纸上色谱法，一般装置如图1-17（a）所示。如果将要分离的样品溶液滴在滤纸条的上端，将滤纸条的上端浸入展开剂中，溶液便由滤纸的上端向下方移动，装置如图1-17（b）所示，这种方法称作下降纸上色谱法。上升法一般需要时间较长，但溶质在两相中的分配较易达到平衡，产生的斑点面紧凑圆整，组分易于分开。下降法则快些，省时间，对于容易分离的混合物最好用下降法。

上述两种方法都是所谓单相色谱法。如果这种色谱在一张方形滤纸上进行，当色谱完毕，斑点出现情况如图1-18所示。如果将滤纸A边再浸入到一新溶剂中进行第二次展开（自A边移向B边），那么形成的色层称为双相色谱法。双相色谱法的意义很明显，如果图1-18中四个斑点中某一点中含有两个组分，由于它们在第一种展开剂中有相近的Rf值，那么在第二种展开剂中它们两者的Rf值可能不同，因而在第二次色谱时显出两个斑点，如图1-19所示。由第二次色谱结果可知道1、2、4三个点确实是代表着两个组分，斑点3可能代表一个组分或者也可能代表在两种展开剂中都有相同Rf值的两个组分。后一种可能性虽然很小，但也应加以考虑。

纸上色谱法的Rf值通常受到下列因素的影响：①纸的质量；②温度；③样品的取样量；④展开溶剂；⑤试样原点与溶剂面之间的距离。

利用纸上色谱法的Rf值作为鉴定有机化合物的凭据时，最好用已知标准样品在相同实验条件下，平行对照进行色谱，如果两者Rf值相同，方可断定是同一物质。

为了使纸上色谱法得到正确结果必须注意下列事项：①不要用手指直接接触色谱部分的滤纸，以防手上油脂污染滤纸；②滤纸条必须剪平整；③滤纸周围必须用溶剂蒸气所饱和，否则就有可能当显层剂达到纸上某一处时，它的蒸发速度大于毛细管汲引速度，致使已经分开的各组分重新又在这里聚集，随溶剂蒸气压的大小和色谱容器的大小不同，使容器中饱和地充满溶剂蒸气的时间可以从几分钟至数小时；④所用有机溶剂一般需事先用水饱和，以便当它在滤纸上移动时，有足够的水分供滤纸吸附，不过溶剂中水的含量不能太多，否则色谱时不能得到良好的分离，一般溶剂含水量不超过10％～20％（质量分数）；⑤用蒸气压太低的溶剂有时不合适，因为它们很难干燥除去，以致影响显色反应。采用蒸气压太高的溶剂要注意它们对温度的变化很敏感，容易在纸上蒸发逸去或凝集，以致当温度控制不够严格时，往往引起液相的不规则变化。

进行纸上色谱法时往往采用混合溶剂作为展开剂。表1-5中列举了一些有机化合物进行纸上色谱法分析所常用的展开剂和显色剂。

除了上述装置外，还可以用圆形滤纸作纸上色谱分析。取一张圆形滤纸架在直径比它略小的培养皿上，皿中盛显层溶剂。将滤纸自中心剪出一条向下弯折，使这小条滤纸浸入显层剂中（或者在滤纸中心穿一孔，塞入一小卷滤纸作芯），在接近中心处滴一滴试液。将整个仪器盛于一较大培养皿中，盖好。令静置进行色谱。在这种情况下，各组分显层后呈同心圆状层带（图1-20），而不是如长条滤纸上色谱那样呈斑点状。为了利用纸上色谱法原理分离较大量的物质，可将滤纸浆填装入玻璃管中，如柱上吸附色谱法那样进行柱上分配色谱分离。

四、薄层色谱法

薄层色谱法是一种在铺成薄层固体上进行色谱的方法。兼备柱色谱和纸色谱的优点。一方面适用于小量样品（几到几十微克，甚至0.01μg）的分离；另一方面在制作薄层的时候，把吸附层加厚，将样品点成一条线，则可分离多达500mg的样品。此法特别适合挥发性小或在高温下易发生变化而不能用气相色谱分析的物质。一般能用薄层色谱分开的物质也能用柱色谱分开，故薄层色谱常用作柱色谱的先导。

正如经典柱色谱法一样，可以有三种形式：①吸附色谱；②分配色谱；③离子交换色谱。其中应用最广泛的是吸附薄层色谱，这里只讨论它。

当溶液中某组分的分子在运动中碰到一个固体表面时，分子会贴在固体表面上，这就是发生了吸附作用。一般说来，任何一种固体表面都有一定程度的吸附力。这是因为固体表面上的质点（离子或原子）和内部质点的处境不同。在内部的质点间的相互作用力是对称的，其力场是相互抵消的。处在固体表面的质点，所受的力是不对称的。其向内的一面受到固体内部质点的作用力大，表面层所受的作用力小，于是产生固体表面的剩余作用力。这就是固体吸附溶液组分分子的原因，也就是吸附作用的实质。

在吸附色谱过程中，溶质、溶剂和吸附剂三者是相互联系又相互竞争的，构成了色谱分离过程。

在吸附薄层色谱过程中，主要发生物理吸附。当固体吸附剂与多元组分溶液接触时，一方面任何溶质都可被吸附（当然单位质量吸附剂所能吸附物质的量，即“吸附量”会因物而异）；另一方面，吸附剂既可吸附溶质分子也可吸附溶剂分子。由于吸附过程是可逆的，因此，被吸附了的物质在一定条件下可以被解吸下来，而解吸也是具有普遍性的。

在吸附薄层色谱过程中，展开剂（溶剂）是不断供给的，所以在原点上溶质与展开剂之间的平衡不断地遭到破坏，即吸附在原点上的物质不断地被解吸。解吸下来的物质溶解于展开剂中并随之向前移动，遇到新的吸附剂表面，物质和展开剂又会部分地被吸附而建立暂时的平衡，但立即又受到不断移动上来的展开剂的破坏，因而又有一部分物质解吸并随展开剂向前移动，如此吸附-解吸-吸附的交替过程而构成了吸附色谱法的分离基础。吸附力弱的组分，先被展开剂解吸下来，推向前去，故有较高的Rf值，吸附力强的组分，被扣留下来，解吸较慢，被推移不远，因此Rf值较低。

在吸附薄层色谱中所用的吸附剂主要是硅胶、氧化铝、聚酰胺等，它们的分子中都含有未公用电子的氧原子或氮原子和能形成氢键的—OH或—NH基团。

被吸附物与吸附剂之间的作用力包括色散力、静电力、诱导力和氢键作用力。前三者即一般所谓的范德华力。在非极性和弱极性之间，由于分子内电子运动所产生的瞬时偶极而引起的作用力叫色散力。极性吸附剂与极性吸附分子偶极之间的作用力主要是静电力。被吸附的物质的极性越大，与极性吸附剂的作用越强。在极性吸附剂表面与非极性的被吸附物之间相互作用，使非极性分子产生偶极而吸附在吸附剂表面上，这种作用力就是诱导力。氢键作用力，X—H…Y是一种特殊的范德华引力，其与范德华力的不同之处在于它具有方向性和饱和性。X，Y表示电负性很大的原子，例如，F、O、N。X与H间以极性共价键相连，H…Y间是表示氢键。氢键的强弱和X、Y的电负性大小有关，也与Y原子的半径有关。Y的电负性越大，半径越小，氢键越强。碳原子电负性小不能形成氢键，因此烃类与吸附剂之间不能形成氢键。这四种作用力的强弱次序是：

氢键作用力>静电力>诱导力>色散力

因而在各类有机化合物中，饱和烃的吸附力最小，如果分子中含有某些官能团，例如，—NO2，—COOR，—CHO，—OH，—COOH，—NH2，＝NH，常有显著的氢键作用力存在，则吸附力增大。由实验结果得知，含单官能团的有机化合物与硅胶或氧化铝亲和力大小次序如下：

羧酸>醇、酰胺>伯胺>酯、醛、酮>腈、叔胺、硝基化合物>醚>烯>卤代烃>烷；分子中双键数目增加，亲和力也增加，特别是双键处于共轭时更是如此；芳环的影响比双键大；芳香化合物随着环的数目增加，吸附亲和力增大；同系物中，分子量越大，吸附力也越大。

分子中极性官能团数目增多，一般情况下吸附亲和力增加。但若两个官能团处于邻位而能发生分子内氢键缔合时，则将使它们与吸附剂形成氢键的力量削弱。其吸附亲和力将小于不发生分子内氢键缔合的位置异构体，如：

在薄层色谱中，就是凭借上述基本概念来选择吸附剂、展开剂和估定Rf值顺序的。这个规律在下面的气相色谱法中也同样适用。

制备薄层色谱板一般适用于分离几十毫克至几百毫克的样品。当然，在多块薄层板上进行重复分离也可制备更大量的纯化合物。薄层色谱比柱上色谱分析较迅速，并且分离效果较佳。

为了增加每块板的载量，薄层可厚一些，一般在0.5～2mm之间。更厚的薄层只适用于Rf值具明显差异的物质的粗略分离。制备薄层板的尺寸一般是20cm×20cm或20cm×40cm。

样品溶液的浓度一般在5％～10％，在20cm×20cm×0.5mm的薄层上分离样品一般为10～50mg，有时可达100mg。为了分离较大量的样品，可用许多块薄层板分离。例如，有资料介绍曾用150块20cm×20cm的薄层板分离了15g物质。

硅胶是无定形多孔性物质，略具酸性，适用于酸性物质的分离分析。薄层色谱用的硅胶分为“硅胶H”——不含黏合剂；“硅胶G”——含煅石膏黏合剂；“硅胶HF254”——含荧光物质，可在波长254nm紫外线下观察到荧光信号；“硅胶GF254”——既含煅石膏黏合剂又含荧光剂等类型。

与硅胶相似，氧化铝也因含黏合剂或荧光剂而分为氧化铝G、氧化铝GF254及氧化铝HF254等。

黏合剂除了用上述煅石膏（2CaSO4·H2O）外，还可用淀粉、羧甲基纤维素钠。通常将薄层板按加黏合剂和不加黏合剂分为两种，加黏合剂的薄层板称为硬板，不加黏合剂的称为软板。

薄层板制备的好坏直接影响色谱的效果。薄层板应尽量均匀且厚度（0.15～1mm）固定。否则展开式溶剂前沿不齐，色谱结果也不容易重复。

薄层板分为干板和湿板。湿板的制法有以下两种。

①平铺法：用商品或自制的薄层涂布器（图1-21）进行制版，它适合科研工作中数量较大要求较高的需要。如无涂布器，可将调好的吸附剂平铺在玻璃板上，也可得到厚度均匀的薄层板。②浸渍法：把两块玻璃片背靠背紧贴，侵入调制好的吸附剂中，取出后分开、晾干。

把涂好的薄层板置于室温晾干后，放入烘箱内加热活化，活化条件根据需要而定。硅胶板一般在烘箱中渐渐升温，维持105～110℃下活化30min。氧化铝板在200℃烘4h可得活性Ⅱ级的薄层，150～160℃烘4h可得活性Ⅲ～Ⅳ级的薄层。薄层板的活性与含水量有关，其活性随含水量的增加而下降。

氧化铝板活性的测定：将偶氮苯30mg，对甲氧基偶氮苯、苏丹黄、苏丹红和对氨基偶氮苯各20mg，溶于50mL无水四氯化碳中，取0.02mL此溶液滴于氧化铝薄层上，用无水四氯化碳展开，测定各染料的位置，算出Rf值，根据表1-6中列出的各染料的Rf确定其活性。

硅胶板活性的测定类似：取对二甲氨基偶氮苯、靛酚蓝和苏丹红三种染料各10mg，溶于1mL氯仿中，将此混合液点于薄层上，用正己烷-乙酸乙酯（9:1，体积比）展开。若能将三种染料分开，并且Rf值二甲氨基偶氮苯>靛酚蓝>苏丹红，则与Ⅱ级氧化铝的活性相当。

为了避免样品在薄层上由于扩散而增宽，最好采用挥发性的非极性溶剂配制样品溶液。在距薄层板底边1.5cm处滴加样品溶液，有的点成虚线，有的点成直线。最简单的办法是用一毛细移液管或滴管沿着一把不锈钢尺直接点样可得到满意结果。如果一次点不完，必须分几次点样时，在每次点样后要用吹风机吹干前次所点样品，才能加入第二次，以防样点过大，造成拖尾、扩散等现象，影响分离效果。也可以用一排毛细管点样，所用毛细管要挑选内径一致的、笔直的，固定在硬纸板上。每条毛细管与相邻毛细管之间用一条较短的毛细管隔开。也有介绍用刀片将薄层的预定点样位置上划两条细缝线，彼此相距3mm，切成3mm宽的槽带。把样品溶液注于此槽带上，投料完毕，用干的吸附剂填满细缝，如图1-22所示，再进行展开。

为了获得狭窄整齐的点样带，有时在点样后展开分离之前，先用极性较大的溶液将全部样品齐头推进一个短距离（大约在原来起始线之上1cm处），使成一条整齐狭窄的新的点样线，晾干后，再换适当的展开剂进行展开。薄层色谱的展开，需要在密闭容器进行，常用的展开槽有：长方形盒式和广口瓶式（图1-23），展开方式有以下几种。

①上升法：用于含黏合剂的薄层板，将薄层板垂直置于有展开剂的容器中。

②倾斜上升法：薄层板倾斜15°［图1-23（a）］，用于无黏合剂的软板，含黏合剂的色谱版可倾斜45～60°。

③下降法（图1-24）：展开剂放在圆底烧瓶中，用滤纸或纱布将展开剂吸到薄层板的上端，使展开剂沿板下行，这种展开的方法适合Rf值小的化合物。

分离后，通常通过显色法确定被分离物质的所在位置。如果物质是有色的或发出荧光的，或能吸收紫外线的，色带的定位就比较简单。对于无色化合物可用桑色素制成荧光板，展开后再于紫外线灯下检出该物质的位置，洗脱时要把桑色素弃去。方法是在小色谱管中先装入约1cm厚的活性氧化铝，桑色素与氧化铝形成螯环化合物而被牢固吸附住，然后用适当溶剂将所需要化合物淋洗下来。当然，若用氧化铝薄层板，此步骤可以省去。用紫外线，特别是短波紫外线照射薄层时要注意有可能使化合物分解或异构化等。

无色化合物也可以用参比色谱定位。在展开后的薄层两侧距边缘0.8～1cm处用刮刀小心切割一条直线。将薄层的中间部分用另一玻板严密盖好，仅留边缘的窄条进行显色。然后将中间的部分在相应的位置作出记号。把两侧参比部分用刮刀或硬橡皮刮铲干净，再用棉花揩净不留下污染的粉末。

在大多数情况下，可以用碘蒸气定位。显色后作出色带记号，然后将色谱板置于空气中令碘挥发逸去。但要注意有些化合物如不饱和烃、苯酚类，与碘易发生反应，不能用此法定位。亲脂性化合物可以由喷水检出，这是由于吸附剂与亲脂性物质有不同的润湿性，喷水后，整片薄板润湿并呈半透明状，亲脂性物质则在半透明背景上呈现白色不润湿点（带）。在透射光下较易观察，但灵敏度不高。

如果是硬板，按所标记位置刮下带有样品的吸附剂，放在小色谱管或离心管中，进行洗脱。如果是软板，可利用减压抽吸，将被分离物质连同吸附剂抽吸到小色谱管中（见图1-25），然后用溶剂洗脱。为了使过滤或洗脱过程顺利进行，应避免使用颗粒过于细小的吸附剂。为了减少吸附剂所含杂质的污染，最好将硅胶或氧化铝吸附剂事先在抽提器中用甲醇抽提8h。由制备薄层色谱法所分离得到的物质通常还要经重结晶或蒸馏一次，以保证其中不含吸附剂及其他杂质。

【例1-5】　在显微镜载片上进行薄层色谱

用显微镜载片作基片制备薄层（硅胶G）板，临用前在105℃烘10min活化。取出，在干燥器中冷却。距一端边0.5cm处刻划一线作顶线，距此线6cm处再划一线作点样起始线。取一底径8～10cm，高2.5cm的玻璃培养皿作色谱缸，内盛4mL展开剂，摇动20s使蒸气饱和。将点好样的薄层板放入，盖好。当展开剂升至顶线，取出薄层板，晾干。用下述的染料显色，酚类则用0.2％ 2，7-二氯荧光素醇溶液喷洒显色，在紫外线照射下，各类酚在黄色荧光背景下显示紫色斑点，结果见表1-7。

五、气相色谱法

色谱法的分离原理是：使混合物中各组分在固定相和流动相间进行交换。由于各组分在性质上和结构上的不相同，当它们被流动相推动经过固定相时，与固定相发生相互作用的大小、强弱会有差异，以致各组分在固定相中的滞留时间有长有短，而按顺序流出，达到分离的目的。

当气体作为流动相时，称为气相色谱。在气相色谱中，固定相有两类。如果固定相是一种活性固体，即吸附剂，称这类固定相的气相色谱法为气固色谱法（简称GSC）；如果固定相是附着在惰性固体上的液体（或称固定液），用这类固定相的气相色谱法称为气液色谱法（简称GLC）。在GLC中，混合试样各组分根据在固定液中的溶解度不同而进行分离。在固定液中溶解度小的组分会较快地被流动相（载气）带出色谱柱。因载气流是连续地流过色谱柱，溶解在固定液中的分子会与新过来的载气相互平衡，气相中的组分被载气流带入一段新的固定液中，以便达到再平衡。样品中各组分在固定液和流动的气相中进进出出反复多次再平衡就是气液色谱过程的基本机理。常用的固定液是难挥发的有机化合物，它们在常温下是液体或固体，在工作温度下是液体。将它们涂渍在惰性固体，如耐火砖粉末、硅藻土粉末的表面上，填装入色谱柱，形成固定相。

在GSC中，基本机理与GLC是相似的，也是混合物试样中各组分在气相与固相间发生反复多次再平衡而达到分离的目的。但不是根据溶解度的差别，而是根据各组分在作为固定相的吸附剂上被吸附的强弱不同导致分离。常用的吸附剂有硅胶、活性炭和分子筛等。这种色谱柱主要用来分离永久性气体及挥发性碳氢化合物。

（一）定性分析

1.根据保留值定性

各种物质在一定的色谱条件下均有确定不变的保留值，因此保留值可以作为一种定性指标，正如在纸上色谱法或薄层色谱法利用Rf值作为定性指标相似。在气相色谱中，根据保留值定性有下列几种方式。

（1）利用相对保留值定性：选用某种化合物作为标准物质，把它的保留值当成1，然后求出在同一条件下未知物与标准物质的保留值的比值α，即相对保留值：

式中，i、s分别表示测定物质和标准物质；为调整保留时间；为调整保留体积。相对保留值受固定液用量和操作条件影响较小，作为定性指标，比保留值本身较为可靠。

测出了未知峰的α值后，根据未知物的来源及性质等估计出它可能是哪种化合物，取这个“可能化合物”的纯品，在相同条件下也求出相应α值。若这α值与未知样品的相同，证明对未知物的判断不错。

当操作条件不易控制稳定和相邻物质的保留值较接近时，准确测定保留值有困难。在这种情况下可以取“可能化合物”的纯品直接加入分析样品中进行色谱分析，若相应的色谱峰增高，而半峰宽不相应增加，那么推证未知样品就是这个“可能化合物”。

（2）利用保留值与碳数或沸点变化规律定性：若找不到“可能化合物”的纯品与未知物进行上述对比实验时，可以根据同系物间保留值与碳数或沸点的经验规律进行定性。

实验证明，许多类型化合物的同系物中各组分的保留值的对数与碳数或沸点呈线性关系，即：

lgZ=a1+b1Nc　　（1-4）

lgZ=a2+b2Tb　　（1-5）

式中，Nc和Tb分别为碳数和沸点；a1、a2、b1及b2为经验常数；Z为保留值的一般形式（它可能是调整保留体积、相对保留值或比保留体积等）。

实际操作是：先取几个能够得到的同系物进行色谱实验，根据所测得Z值及Nc或Tb划出直线图，或者求出上列式中的a1、a2、b1、b2值。将未知化合物在同样条件下进行色谱分析，求出其相应Z值，然后对照直线图或代入上列式中求出其碳数、或沸点，即可推知其为何物。

（3）利用多柱定性：同系物在一种固定相上的保留值与在另一种固定相上的保留值呈线性关系，即：

lgZ1=a3+b3logZ2　　（1-6）

式中，Z1和Z2分别为在第1号及第2号色谱柱上测得的保留值；a3、b3为经验数值。如果未知物与“可能化合物”在两种不同极性的色谱柱上所测得的相应保留值都一致时，则二者是同一物质的可靠性较用一种固定相测得者大得多。

（4）用在不同柱温下保留值定性：在同一色谱柱上，物质的保留值的对数与柱温（绝对温度）的倒数成直线关系，可以利用这一经验规律进行未知物的定性，即：

式中，Z为保留值的一般形式；a4、b4为经验常数；Tc为柱温的绝对温度数值。

2.应用化学反应定性

（1）制备衍生物定性：若色谱分析中一未知组分的保留值与一个“可能化合物”纯品在同样条件下测得的相应保留值相同时，两者可能为同一物质。为了确证起见，可将两者制成相同的衍生物，将这些衍生物分别测其保留值，若二者又一致时，就能更可靠地推证未知物与“可能化合物”为同一物质。

一般难挥发的组分往往制成它们的挥发性衍生物进行色谱分析，各类化合物的常用衍生物列于表1-8中。

制备衍生物，不只是为了定性，还有下面的目的：一些难以挥发的高级醇（如甾醇、糖类）、氨基酸、羧酸以及胺类，本身很难用气相色谱进行分析，若制成挥发性衍生物，如三甲基硅醚、醛、甲酯及三氟乙酰胺等，则色谱分析得以顺利进行；此外，对于一些不含电负性基团，因而不便于用高灵敏度的电子俘获检测器进行气相色谱痕量分析的化合物，若事先制备成含氟、含氯或硝基的衍生物，即可克服此困难。

利用衍生物保留值来进行定性鉴定时，必须事先知道化合物中所含有的官能团。所制成的衍生物一般是：热稳定性好，挥发度高，产量高，过量试剂与可能的副反应产物不干扰测定（因反应产物一般不再进行分离，反应后直接注入色谱柱进行分析），其保留值与原来化合物保留值应相差大。将未知物转化为衍生物的反应可在色谱以外单独进行，也可在注射器针筒内、柱前微型反应器内或直接在色谱柱中进行。

（2）扣除法定性：利用官能团特征反应，使未知样品与某一试剂反应后生成不挥发衍生物而被扣留，于是色谱图中相应峰的被消除得以鉴定原来组分属何种类型的化合物。

扣除法可以用三种形式进行：①将扣除剂涂浸在载体上填充于一段柱内，这种柱可装在色谱柱前，也可装在柱后，同时进行空白对照，如图1-26所示；②用注射器的芯蘸取少量扣除试剂，然后用这个注射器抽取试样，针头部分的气样也要抽入针筒内，将针头插在进样橡胶垫上进行封闭，放置足够时间，把样品注进色谱柱；另取一注射器，不蘸扣除试剂，抽取气样进行空白对照分析；③对于反应慢的扣除剂可在色谱柱外在毛细管中与试样混合，封闭加热一定时间后，再用微量注射器抽取试样进行色谱分析。最后一种方式较少采用。

各种扣除试剂列于表1-9中。从表1-9中可以看出，为了扣除某一类化合物，除了采用化学试剂外，也可以用吸附剂如分子筛等扣留。在应用这些方法前最好用已知化合物先进行核验。扣除法定性示例见图1-27。

（3）官能团特征反应定性：在色谱柱通过T型三路管，将一部分流出物通往检测器，一部分流出物通入微型试管，内盛官能团检验试剂。由官能团特征反应的显色或产生沉淀，对未知峰作初步鉴定，判断其中含有哪种官能团，为进一步确证提供参考。由于官能团反应灵敏度不是很高，这个方法所需试剂较多。装置如图1-28所示。

3.与其他仪器联用定性

气相色谱是极有效的分离工具，但在定性方法上有较大的局限性；而波谱法（紫外、红外、核磁、质谱及拉曼光谱等）是鉴定单纯有机化合物或进行结构剖析的强有力的工具，但波谱法分析复杂混合物又有一定的局限性。如果将气相色谱法与波谱法联用起来，可以互相取长补短，相得益彰。这是目前色谱法发展的方向之一。

与气相色谱仪直接联用的仪器必须具有两个条件：①其灵敏度必须足以鉴定经色谱柱分离的极微量组分；②必须具有快速扫描装置以适应从色谱柱分离出各组分的速度。

在这些联用技术中以气相色谱和质谱联用（简称色-质联用技术）发展得最为迅速，应用也最广泛。色-质仪器已是现代有机化学实验室中鉴定复杂多组分混合物不可缺少的工具。

除色-质联用外，气相色谱与红外光谱联用技术的迅速发展也是非常引人注目的。

（二）定量分析

用微分型检测器，每个组分的信号-峰高或峰面积可按下式换算成物质的质量：

h×f=m　　（1-8）

或　　A×f=m　　（1-9）

式中，h代表峰高；A代表峰面积；m表示物质的质量（g）；f称为定量校正因子。

气相色谱定量时，首先要准确量出峰高或峰面积，其次要准确求出定量校正因子，然后计算物质的含量。

1.峰面积的测量

若色谱峰形尖窄对称，半峰宽不变，可由峰高定量，这时测量峰高是比较简单的。但是在大多数情况下，峰形较宽或呈扁宽形，若用峰高定量，误差较大，必须用峰面积定量。峰面积的测量比较复杂，常用的方法可分为两大类：自动测量法和手工测量法。前一类最重要的是电子计算机法，后一类较常用的是几何图解法、剪纸称重法或机械积分仪法等。

计算机引用到气相色谱中，即能快速处理色谱分离所提供的数据，又使整个色谱分析过程自动化，从而可使监视控制生产自动化。计算机处理色谱数据还有下面特点：①不需要用手工确定峰的起点和终点；②自动补偿基线漂移；③免除大峰小峰并存时经常调衰减的麻烦；④遇到疑难峰能将保留值打印出来。另外除了具有处理数据的功能外，还有检查文献、储存数据、总结实验规律等能力。

在几种手工测量峰面积的方法中，实验室应用最多的是几何图解法。峰面积等于峰高（h）与半峰宽（W1/2）乘积的1.065倍，即：

A=1.065×h×W1/2　　（1-10）

因此，可用峰高乘半峰宽法来代替实际峰面积作定量计算。

在用峰面积进行定量分析时，须注意下列两个经常遇到的问题。

①基线漂移：在手工测量中，扣除基线漂移的方法是将峰起点和终点间的联线当作峰底，从顶对时间轴作垂线，对应的时间即保留时间，垂线在峰顶至峰底间的一段即峰高，如图1-29所示。对于未完全分离的峰，不能逐个划出基线时，可根据出峰前和出峰后的总基线来决定峰高，如图1-30所示。

②未完全分离峰的测量：通常采用经验方法。例如：a.峰形对称，交叠不多时，从峰谷向基线作垂线，以这条线作为两峰的交界线，分别计算峰面积，如图1-31（a）所示。b.峰形对称，交叠严重时，可在峰的转折点画切线与基线相交，构成如图1-31（b）所示的三角形ABC和DEF，然后测量这个三角形的面积。c.当小峰落在主峰一侧时，沿着主峰的尾部作平滑线画出小峰的基线，用面积计测出小峰的面积，如图1-31（c）所示。

2.定量校正因子

定量校正因子最好是在具体分析条件下用纯物质求出。如果没有纯物质时则引用文献上总结的一些校正因子。为了克服实验条件的影响，通常采用相对校正因子，即以一个标准物的校正因子定为1，在同样条件测得分析样品化合物校正因子与标准物的比值。相对校正因子有两种：相对质量校正因子（RWR）和相对物质的量校正因子（RMR）。不同的检测器测出的校正因子不同。

3.百分含量的计算

（1）归一化法：当进样量无法进行精确测量，而样品中所有组分全部出峰时，各组分的百分含量按下式计算：

如果组分含量在鉴定器线性范围内变化，半峰宽不随进样量变化，可直接用峰高计算，上式变为：

【例1-6】　测混合一元苯羧酸

色谱条件：固定相：1，2，3，4-四氰乙氧基丁烷涂浸于6201担体（液/担=5％）

柱：不锈钢ф4mm×3000mm

柱温：125℃

载气：H2，60mL/min，表压176.5kPa

检测器：热导池，桥流150mA，125℃

气化室温：250℃

操作：将试样用重氮甲烷乙醚溶液在室温甲酯化。反应完毕，温水浴中除去过量试剂（通风橱中进行）。然后将甲酯溶于氯仿中进行气相色谱分析。

测相对校正因子：以联苯作标准物，取0.5000g放入25mL容量瓶中，用氯仿溶解并稀释至刻度。

准确称取20mg对甲苯甲酸放入小试管中，用吸量管准确加入1.5mL内标溶液（共含联苯30mg），溶解后取2μL进行色谱分析，测得峰面积数据如下：

相对质量校正因子：

测若干次测得的平均值。

若已知试样中同时含对、邻、间甲基苯甲酸及苯甲酸，并且全部在色谱图上出峰，除了求出对甲基苯甲酸的相对重量校正因子外，还必须求出其余三种羧酸的f'。设求出值为：

样品分析：样品经甲酯化后溶于适量氯仿中，注入色谱柱，由色谱图中求得各峰面积为：

则可求得：

其他苯羧酸含量可以类似方法求得。

（2）内标法：此法是把已知量的内标物加入到已知质量的分析样品中，根据已知量的内标物的峰面积和样品待测组分的峰面积来计算组分的百分含量。

选择内标物的条件是：①内标物的流出时间最好与样品中所存在的组分流出时间不重叠；②内标物色谱峰位于各组分流出峰的中间位置，距离待测组分不太远；③性质尽可能与待测组分接近。

此方法与上述方法比较有下面优点：不要求全部组分在色谱图上都出峰，也不必将各组分的定量校正因子都求出来；缺点是每次必须事先精确称量内标物和试样，较麻烦。

计算方法如下：

设质量mg的混合试样中待测组分的质量为mig，若在混合试样中加入msg的内标物，它们之间存在下列关系（设待测组分百分含量为Xi％）：

由于待测组分与内标物质量之比等于峰面积之比，可知：

将式（1-14）及式（1-13），整理可得：

【例1-7】　设在【例1-6】中，精确称取50.0mg试样放入小试管中，精确加入0.3mL联苯标准溶液（浓度为20.0mg/mL），加2mL重氮甲烷乙醚饱和溶液，甲酯化后，蒸去乙醚，加入适量氯仿溶解后，将溶液注入色谱柱进行分析，色谱条件如前，测得色谱峰面积为：

则

（3）外标法（已知样品校正法）：这个方法的原理是：配制已知浓度的标准样（即待测组分的纯样品）溶液进行色谱分析，测出各不同溶液标样的峰面积，求出单位面积的相应含量，取其平均值k；或者以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。然后在与标样实验严格相同的条件下，进入一定量的试样，求出其色谱峰面积，参照标准曲线或根据k值计算，可求得待测组分的百分含量。

与上两种方法比较起来，本法操作简便，因此生产上乐于采用。但它要求样品分析条件必须与标样实验严格相同；并且要求进样量准确。对于气体样品用定量管进样容易做到重现性好，对于液体样品，进样重复性存在一定困难。

校正值法由下式计算：　Xi％=ki×Ai×100％式中，ki为i组分的校正值，即单位峰面积相当于i组分在样品中的百分含量。

如果样品中各组分浓度变化范围不大，可以配一个与样品含量相当的已知混合样品，定量进样后由所得相应的峰面积和已知的样品组分的含量即可算出ki。因为原则上ki不应随进样量而变化，所以，可以只作一个浓度求出ki，即所谓单点校正法。

但是如果样品浓度变化范围很大，则需预先配制一系列的已知标准样画出如图1-32所示的浓度与对应峰面积的标准曲线，验证样品浓度与对应峰面积的线性范围。若在实验条件下存在线性关系，那么分析时直接根据峰面积查图便可得出各组分的浓度，或者测一系列浓度下的校正值的平均值作为ki值按前式进行计算。

外标法虽然简单方便，特别适于工厂生产中的控制分析，但必须注意分析时操作条件要求很稳定，因为它不像归一化法或内标法色谱操作条件的影响可以有所抵消，因此经常需要用标准样品进行k值或标准曲线的校验。影响分析结果的操作因素有载气流速、柱温、气化室温度、热导检测器的桥流等。

（三）反应气相色谱法在测定有机物结构方面的应用

反应气相色谱法指微型化学反应器与气相色谱联用的技术，微型反应器可连在柱前或柱后，或与色谱柱混合为一。反应气相色谱法可克服经典色谱法的不足，例如：①经化学反应使热不稳定或难挥发的物质在柱前转化为热稳定易挥发的产物后进行分析；②用热导池作鉴定器时，在柱后经化学反应转变为同一产物进行检测，以避免各组分逐一测其应答值的麻烦；③对不适用高灵敏度检测器的化合物，柱前转化为含氟或含氯、磷等元素的衍生物后进行检测；④用化学显色反应来鉴定色谱峰；⑤用扣除法来改进重叠峰的分离等。

反应气相色谱法在有机分子结构测定方面的主要应用分别介绍如下。

1.反应气相色谱法测定有机元素

有机样品（0.5～1mg）在含有少量氧的氦气流中，在四氧化三钴和银的催化剂上瞬间燃烧，生成H2O、CO2和NO，后者再经还原铜炉还原为N2，在PorapakQ填充柱上进行分离，热导池测定。

如果需要测氧，再另取样，在另一个炉中进行。使样品在氦气流中在活性碳上燃烧成CO后，在分子筛填充柱上色谱分离（可能伴随有N2、CH4等峰），热导池测定。

可以自动进样，分析一个C、H、N样品只需10min，分析一个氧样品只需8min。分析数据可用积分仪自动打字机处理。

图1-33所示为MOD-1104型CHNO自动分析仪结构示意图，图中显示出了典型的C、H、N峰色谱图。

2.反应气相色谱法测定有机官能团

（1）活泼氢的测定：将样品与甲基碘化镁或氢化锂铝反应，产生的甲烷或氢气经色谱测定，计算样品中活泼氢含量：

仪器如图1-34（a）、（b）所示。

色谱条件：色谱柱为ф4mm×2000mm不锈钢柱，内填装涂渍有己二酸乙二醇聚酯固定液的6201担体（60/80目）。固定液与担体质量比为15:85，维持柱温为50℃。载气N2先经105号脱氧分子筛除去痕量氧，再经过CaCl2和P2O5除去水分，然后通入色谱柱，流速60mL/min，热导池温度75℃，桥流130mA。

操作：自反应器进样口注射入4mL甲基碘化镁乙醚溶液（4mol/L）。注入50μL样品溶液，反应2min后，将产生的甲烷由载气载入色谱柱进行分析。以苯甲酸为基准物，绘制标准曲线，计算样品中活泼氢含量。

（2）羟基的测定：可用上述活泼氢测定法来测定。

（3）伯氨基的测定：将含伯胺样品与亚硝酸反应，产生的N2用色谱法测定：

色谱条件：色谱柱为ф4mm×2000mm不锈钢柱，内填装5A分子筛（40～60目），柱温50℃，载气H2流速60mL/min，热导池检测器温度75℃，桥流130mA。

操作：反应器同上，称取1～5mg试样放入反应瓶中，加入0.3mL饱和NaNO2溶液。待基线稳定，切断反应器载气流。注入0.15mL冰醋酸，反应1min。将反应的气体产物经MnO2吸收柱以扣除副产物NO后送入色谱柱分析。用甘氨酸作基准物，绘制标准曲线，计算样品中伯氨基数。

表1-10列举了用反应气相色谱法测定有机官能团的示例。

3.高聚物裂解色谱鉴定

其原理是：在仔细控制的条件下，将样品放在裂解器内升温，使之迅速裂解成可挥发性的小分子，即“裂解碎片”，用气相色谱法分离，分析这些裂解碎片，从色谱图的特征来推断样品的组成、结构和其他性质，如热稳定性等。

裂解色谱法具有下列特点：①设备比较简单，价格较廉，可得到结构信息。质谱虽然也是很有用的测定高聚物结构的工具，但比裂解色谱仪器复杂昂贵得多。②取量少，快速，灵敏，分离效率高。一般数百微克样品即可分析，半小时内可完成一个分析周期，由于与高效色谱柱和高灵敏度检测器相匹配，对于结构相似（如同系物）或同类高分子之间的微小差异，材料中的少量组分等，裂解色谱法都能灵敏地检验出来。③在进行裂解反应时，无论是黏稠液体、粉末、薄膜、纤维及弹性体等各种物理状态的高分子样品，都能方便地处理和进样，材料中若存在无机填料和少量小分子添加物（如增塑剂、防老剂等）并不影响分析结果。因此，通常不必事先进行分离纯化等手续，对于已固化的树脂、涂料、硫化橡胶等不熔融材料均可直接进料分析。这在红外光谱分析或其他波谱法分析时是难以做到的。

但是，裂解色谱也有它的局限性，由于裂解反应复杂，分析结果受实验条件影响很大，重复性较差，在定性鉴定方面尚无法得到象红外光谱那样通用的标准图谱，由于精密度差，用于定量分析方面尚不令人满意。

常用于裂解色谱的裂解器有下列几类。

（1）炉式（或管式）裂解器：结构如图1-35所示，由石英管（内径5～8mm）和外围加热的电炉构成。样品放在铂或金质小舟内。当电炉加热到所选择的裂解温度时，借推杆将样品推送到电炉的加热区进行裂解。炉温借温度控制器控制，由热电偶（焊接在样品舟托盘底部）随时测定。石英管通入色谱柱一端，填一些石英棉用以除去某些高沸点“碎片”。

管式裂解器的优点是：①炉温可连续调节、稳定控制和测量，温度重复性较好；②适应各种状态的样品，而且样品称量、残渣称量和清除方面都很方便。但它有下列缺陷：①因加热区较长，二次反应严重；②TRT（Temperature Rise Time，即使样品达到某一裂解温度的时间）大，通常样品上升至500℃约需4s的时间，二次裂解反应因而容易发生，因此裂解重复性差；③死体积比其他种类裂解器要大，影响色谱峰形和分离效果。炉式裂解器一般用于鉴定（与相同条件下测得的标准样品裂解指纹图对照），也间或用于定量分析，但受二次反应的限制，不适于进行结构的分析。

（2）热丝裂解器：图1-36是热丝裂解器的一种。其中将铂丝或镍铬丝绕成线圈作为发热元件，线圈固定在玻璃磨口塞上，样品附着线圈上，连同线圈一起插入裂解室。通电后热丝很快被加热至所需温度，样品立即被裂解，产生的“碎片”随载气导入色谱系统（载气用四通活塞切换）。样品裂解后立即切断电源。通电时间用时间继电器控制，热丝温度用已知熔点的晶体来测定。

对于可溶性样品，用热丝沾取样品溶液，待溶剂挥发后，便能在热丝上均匀涂渍成膜；对于不溶性样品，可将样品装在一小段石英毛细管内，石英毛细管插入线圈中裂解。

热丝裂解器的优点是：结构简单，制作容易，裂解室的环境温度低，死体积小。缺点是：TRT长（数秒钟）；温度不易测定；热丝反应多次会老化，几何形状也易改变，因而影响加热的重现性；并且由于热丝直接与样品接触，对某些反应可能还有催化副作用，使结果复杂化；处理不溶样品及清除残渣较不方便。

（3）居里点裂解器：铁磁性物质处在高频交变磁场中其磁矩随磁场方向的变化而运动，磁滞损耗就变成热，因而磁铁体本身能迅速升温。当升到某一温度时，铁磁性物质便从铁磁体变成顺磁体，不再吸收磁场的能量，因此温度不再上升。这一点温度就叫做居里点温度。这种方法可使铁磁物质（发热元件）迅速发热并维持在一个恒定的温度上。这就是居里点裂解器的原理。随着铁磁物质组成不同，居里点温度也不一样，据此可以得到一系列温度。

通常将铁磁性物质制成0.5mm的丝（也有制成箔状和毛细管状的），作为发热元件，并承载样品。对于可溶性样品的涂渍和制备方法，与热丝裂解器相同。对于不溶性样品，可将合金丝敲成带状，夹注样品薄片进行裂解。裂解器的结构如图1-37所示。

居里点裂解器的最大优点是：升温速度快，升温速率视电源的功率不同，从几十毫秒到1.5s，而且平衡温度可精密控制和严格重复，使裂解结果的重复性大大提高；同时，样品受热方式是内热式，因此“碎片”与热以同一方向向冷区扩散；当裂解结束时，加热也就停止；环境温度较低；使二次反应的几率减少。因此它是最理想的裂解器，特别是在定量分析和微观结构分析研究中更显出它的长处。但它也有些不足，如分析不溶性样品时，处理比较困难，将固体样品直接夹在合金箔上裂解，使样品受热不均匀，影响实验结果。因为裂解室体积小（毛细管），毛细管壁温度低，裂解碎片往往容易凝集在管壁处。另外，裂解温度的选择受合金组成的限制，不能任意和连续调节，合金丝也可能起催化作用，使结果复杂化。

（4）激光裂解器：激光裂解在原理上和热裂解一样，不同的是样品通过激光能的照射升温裂解。激光裂解器的结构如图1-38所示。从脉冲激光器所发射出来的光束，经过透镜聚焦后，照射到样品室内样品表面，样品获得激光能而瞬间升温裂解。由于激光束具有极大的能量密度，加热样品可获得106℃/s，因此TRT仅用100～500μs，比任何裂解方式都快，是唯一能与高分子裂解速度相适应的加热方式。因为样品在这样短的时间内发生裂解，二次反应降低到最低限度，而且系统的死体积小，可得到比较简单的裂解色谱图。

图1-39是用管式炉裂解器、热丝裂解器和用CO2激光裂解器分别裂解聚苯乙烯的裂解图，可看出后者裂解图比较简单，而CO2激光裂解器裂解产物中占优势的是高聚物的单体，比较清楚地反映了母体化合物的结构特征，这对鉴定高聚物，特别是共聚物的分析有利。

4.碳骨架测定

利用反应气相色谱法测定有机分子碳骨架又称为碳骨架色谱。它的原理是：利用比较温和的催化氢化、氢解或脱氢反应，使未知样品保留基本的碳骨架，转化为已知的简单化合物，推断未知物的结构。

碳骨架色谱的反应柱装在色谱柱的前面，结构如图1-40所示。反应柱可以用硬质玻璃、石英制成，内径约4mm，长度在8～15cm之间，管头的隔膜进样口供液体样品注射进样用，侧管供固体样品进样用。固体样品可置于镍制小舟或微坩埚（约ф3mm×3mm）中，借磁铁吸引。反应柱的加热（280～350℃）可采用电烙铁芯子，载气的流速约20～60mL/min。

催化剂是1％钯/硅藻土：以PdCl2溶于5％醋酸中，再加入适量的硅藻土担体而成。有时要加入一些碳酸钠以中和释出的盐酸。干燥后，将催化剂装入柱中，加热通氢（200℃）约1h。

在分析胺类时，Na2CO3宜多加一些。对于分子量较大的物质，反应柱可适当短一些（约8cm）。一般进样量是10～30μg，最多不宜超过1mg。

碳骨架色谱的规律是：

醇　R-┆-CH2OH→RH（RCH3）

醛　R-┆-CHO→RH（RCH3）

酸　R-┆-COOH→RH（RCH3）

醚　R-┆-CH2—O-┆-CH2—R'→RH，RCH3，R'H（R'CH3）

酯　R-┆-COO-┆-CH2-┆-R'→RH，RCH3，R'H（R'CH3）

胺　R-┆-CH2-┆-NH2→RH（RCH3）

酰胺

卤化物　R—CH2-┆-X→RCH3

硫化物　R—CH2-┆-S-┆-CH2R'→RCH3，R'CH3

仲醇

仲胺

上述各类化合物得到的产物是相同碳原子或少一个碳原子的烷烃，反应温度约300℃。在350℃的反应温度下，环状化合物，如环烷烃，会脱氢而成芳香烃。

碳骨架色谱的反应产物较简单，便于利用保留值来鉴定，对于有机物结构的测定能提供有用的信息。它曾成功地应用于鉴定残留在生物物质中的杀虫剂、鉴定甾体、倍半萜以及石油中的含硫物质等。

反应柱中所用催化剂，不仅可以用Pd，也可以用Pt、Rh（铼）、Ru（钌）、Ni等。在用Ni（1％～3％）为催化剂时，不发生氢解反应，仅是氢化，这对于鉴定不饱和化合物很有用。