第二章　中药常用仪器分析方法

第一节　分光光度法

一、紫外-可见分光光度法

紫外-可见分光光度法（Vis-UV spectrophotometry，VUV）是利用物质分子对紫外-可见光谱区（一般认为是200～800nm）辐射的吸收进行分析测定的一种仪器分析方法。VUV具有灵敏度高、相对误差小等特点，目前被广泛用于医药、卫生、环保、化工等领域无机和有机物质的定性和定量分析。

（一）工作原理

物质的吸收光谱实质上就是物质中的分子或原子吸收了入射光中某些特定波长的光能量，产生分子振动能级跃迁和电子能级跃迁的结果。由于每种物质具有各自不同的分子、原子和不同的分子空间结构，其吸收光的能量也不同。因此，每种物质都有其特有的、固定的吸收光谱曲线，可根据吸收光谱上某些特征波长处吸光度的高低来鉴定或测定该物质的含量。紫外-可见分光光度法的定量分析基础是朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律，即物质在一定波长的吸光度与吸收介质的厚度和吸光物质的浓度成正比。

Lambert-Beer定律：

A=εbc

式中，A为吸光度；b为液层厚度（cm）；c为物质的量浓度（mol/L）；ε为摩尔吸光系数［L/（mol·cm）］。其中ε、b为常数。

（二）紫外-可见分光光度计的组成

紫外-可见分光光度计主要由光源、单色器、样品室、检测器、显示器等五部分组成。

1.光源

理想光源的条件是：a.能提供连续的辐射；b.光强度足够大；c.在整个光谱区内光谱强度不随波长变化而有明显变化；d.光谱范围宽；e.使用寿命长，价格低。

用于可见光和近红外光区的光源是钨灯，最常用的是卤钨灯，即石英钨灯泡中充以卤素，以提高钨灯的寿命。适用波长范围是320～1100nm。用于紫外光区的有氢灯和氘灯，适用波长范围是190～400nm，氘灯比氢灯光强度大，且使用寿命长2～3倍，故较为常用。

2.单色器

单色器一般由入射狭缝、出射狭缝、透镜系统和色散元件（棱镜或光栅）等几部分组成，是用来产生高纯度单色光束的装置，其功能是将光源产生的复合光分解为单色光和分出所需的单色光束。单色器的性能直接影响入射光的单色性，从而影响测定的灵敏度、选择性及校准曲线的线性关系等。起分光作用的色散元件主要是棱镜和光栅。

棱镜有玻璃和石英两种材料。其原理是依据不同波长光通过棱镜时有不同的折射率而将不同波长的光分开。由于玻璃可吸收紫外光，所以玻璃棱镜只能用于350～3200nm的波长范围，只能用于可见光域。石英棱镜可使用的波长范围较宽（185～4000nm），可用于紫外、可见和近红外三个光域。

光栅是利用光的衍射与干涉作用制成的，它可用于紫外、可见及红外光域，而且在整个波长区内具有良好的、较为均匀一致的分辨能力。

狭缝的大小直接影响单色光纯度，但过小的狭缝又会减弱光强。

3.样品池

样品池由池架、吸收池（即比色杯）及各种可更换的附件组成。池架有普通池架和恒温池架，恒温池架包括水恒温池架和电恒温池架。吸收池分为石英池和玻璃池两种。因为普通光学玻璃吸收紫外光，因此玻璃池只能用于可见光，适用波长范围为400～2000nm。石英池可透过紫外光、可见光和红外光，是最为常用的吸收池，适用波长范围为180～3000nm。

4.检测器

检测器又称光电转换器。常用的检测器有光电管、光电倍增管和光电二极管三种。

①光电管：751型分光光度计使用光电管检测器。

②光电倍增管：它是检测弱光的最灵敏最常用的光电元件，其灵敏度比光电管高200多倍。

③光电二极管：其原理是硅二极管受紫外-近红外辐射照射时，其导电性增强的比例与光强成正比。

近年，使用光电二极管作检测器的分光光度计的数量在增加，虽然其灵敏度赶不上光电倍增管，但由于稳定性更好，使用寿命更长，价格便宜，因而，许多高档的分光光度计都在使用。目前，新型的光电二极管阵列检测器能绘出吸光度、波长和时间的三维立体色谱图，可以方便快速地得到任一波长的吸收数据，尤其适宜用于动力学测定，成为高效液相色谱仪最理想的检测器。

5.显示器

低档分光光度计采用数字显示，有的连有打印机。现代高性能分光光度计采用计算机控制，集图谱、数据显示、操作条件控制和数据处理于一体。

（三）紫外-可见分光光度计的类型

紫外-可见分光光度计可分为单光束分光光度计、双光束分光光度计和双波长分光光度计三种类型。

1.单光束分光光度计

经单色器分光后的一束平行光，轮流通过参比溶液和样品溶液进行吸光度的测定。此种分光光度计结构简单，操作方便，维修容易，适用于常规分析。

2.双光束分光光度计

经单色器分光后经反射镜分解为强度相等的两束光，一束通过参比池，一束通过样品池。光度计能自动比较两束光的强度，此比值即为试样的透射比，经对数变换将它转换成吸光度并作为波长的函数记录下来。同时，由于两束光同时分别通过参比池和样品池，还能自动消除光源强度变化所引起的误差。

3.双波长分光光度计

由同一光源发出的光被分成两束，分别经过两个单色器，得到两束不同波长（λ1和λ2）的单色光，利用切光器使两束光以一定的频率交替照射同一吸收池，然后经过光电倍增管和电子控制系统，最后由显示器显示出两个波长处的吸光度差值ΔA（ΔA=Aλ1-Aλ2）。对于多组分混合物、混浊试样及存在背景干扰或共存组分吸收干扰等样品的分析，采用双波长分光光度计分析能提高方法的灵敏度和选择性。

（四）紫外-可见分光光度计的应用

VUV法是一种常用的定量分析方法，也是对物质进行定性分析和结构分析的一种手段，同时还可以测定某些化合物的物理化学参数，例如摩尔质量、配合物的配合比和稳定常数及酸、碱的离解常数等。此种方法主要适用于不饱和有机化合物，尤其是共轭体系的鉴定，以此推断未知物的骨架结构。此外，它还可配合红外光谱法、核磁共振波谱法和质谱法等结构分析法进行定量鉴定和结构分析。

附　TU1810型紫外-可见分光光度计操作程序

①打开分光光度计，预热10min。

②打开计算机，进入软件，进入“光谱扫描”界面。

③设定扫描波长范围。

④将盛有标准溶液的比色皿插入样品室，在设定波长范围内扫描，确定最大吸收波长。

⑤进入“定量测定”界面设定检测波长，将盛有空白溶液的比色皿插入样品室，调零。

⑥插入盛有不同浓度对照品溶液的比色皿，测定吸光度，制备标准曲线。

⑦插入盛有样品溶液的比色皿，测定样品溶液的吸光度。

⑧退出系统，关闭仪器，关闭电脑。

⑨登记使用记录。

（俞　浩）

二、红外分光光度法

红外分光光度法（infrared spectrophotometry，IR）是利用物质对红外光区电磁辐射选择性吸收的特性来进行结构分析、定性和定量分析的方法，又称红外吸收光谱法。主要用于化合物结构鉴定，亦可用于定量分析。

（一）工作原理

1.红外吸收的产生条件

①辐射光子的能量应与振动能级跃迁所需能量相等。

②辐射与物质之间有相互耦合作用。

对称分子：没有偶极矩，辐射不能引起共振，无红外活性。如：N2、O2、Cl2等。

非对称分子：有偶极矩，具有红外活性。

2.分子振动与红外吸收

在分子发生振动能级跃迁的同时，必然伴随着转动能级的跃迁，由此而产生的红外吸收光谱又称为振动-转动光谱。分子在振动过程中必须有瞬间偶极矩的改变，才能在红外光谱中出现相对应的吸收峰，这种振动称为具有红外活性的振动。根据量子理论，红外吸收峰的强度与分子振动时偶极矩变化的平方成正比。因此，振动时偶极矩变化越大，吸收强度越强。

（二）红外光区的划分

红外线为波长在0.76～500μm范围内的电磁波。通常划分为三个区：近红外区，波长范围0.76～2.5μm；中红外区，波长范围2.5～25μm；远红外区，波长范围25～500μm。大多数有机物和无机离子的化学键基频吸收都出现在中红外区。通常说的红外光谱主要指中红外光谱区。

（三）红外光谱仪的组成

红外光谱仪主要由光源、吸收池、单色器和检测器四部分组成。

1.光源

常用的有能斯特灯和硅碳棒。能斯特灯是由氧化锆、氧化钇和氧化钍烧结制成的中空或实心圆棒，直径1～3mm，长20～50mm，特点是发光强度大，使用寿命0.5～1年。硅碳棒两端粗，中间细，直径5mm，长20～50mm，使用时不需预热。

2.吸收池

因玻璃、石英等材料不能透过红外光，故红外吸收池只用能透过红外光的Na Cl、KBr等材料制成窗片，需注意防潮。固体试样常与纯KBr混匀压片，然后直接进行测定。

3.单色器

单色器由色散元件、准直镜和狭缝构成。色散元件常用闪耀光栅，由于闪耀光栅存在次级光谱的干扰，因此，需要将光栅和用来分离次级光谱的滤光器或前置棱镜结合起来使用。

4.检测器

常用的红外检测器有热检测器、热电检测器和光电导检测器三种。

（四）红外光谱仪的类型

红外光谱仪主要有色散型红外吸收光谱仪和Fourier变换红外光谱仪两种类型。Fourier变换红外光谱仪具有扫描速度快、分辨率高、灵敏度高等优点。

（五）红外吸收光谱中常用的术语

1.基频峰与泛频峰

常温下，由于分子大部分都位于基态（V=0）振动，因而分子吸收红外光后主要发生由基态到第一激发态（V=1）的跃迁，由此产生的吸收峰称为基频峰。基频峰的峰位等于分子的振动频率。基频峰强度大，是红外光的主要吸收峰。

泛频峰包括倍频峰和组频峰。倍频峰是当分子吸收一定的红外光后，分子的振动能级从基态跃迁至第二振动激发态、第三振动激发态等高能态时所产生的吸收峰（即V=0→V=2，3，…产生的峰）。组频峰又包括合频峰和差频峰。虽然泛频峰强度较弱，难辨认，但增加了光谱的特征性。

2.特征峰与相关峰

凡是能鉴定某官能团的存在，又容易辨认的吸收峰称为特征峰。

由一个基团产生的一组相互依存而又相互佐证的特征峰称为相关峰。相关峰的数目与基团的活性振动及光谱的波数范围有关。用一组相关峰确定一个官能团的存在是光谱解析的一条重要原则。

3.特征区与指纹区

特征区（特征频谱区）指4000～1250cm-1的高频区。包含H的各种单键、双键和三键的伸缩振动及面内弯曲振动。特征区吸收峰稀疏、较强，易辨认。特征峰常出现在特征区。

指纹区指1250～400cm-1的低频区。包含C—X（X：O，H，N）单键的伸缩振动及各种面内弯曲振动。指纹区吸收峰密集、难辨认。相关峰常出现在指纹区。

（六）影响吸收峰位的因素

分子中各基团的振动要受到分子中其他部分特别是邻近基团的影响，这种影响可分为内部因素和外部因素。

1.内部因素

（1）诱导效应　一般是指“吸电子基团”的诱导效应。由于取代基具有不同的电负性，通过静电诱导作用，引起分子中电子排布的变化，从而引起化学键力常数的变化，改变了基团的特征频率，这种效应通常称为诱导效应。吸电子基团使吸收峰向高频方向移动，又称蓝移。

（2）共轭效应　共轭效应使振动频率移向低波数区。主要包括氢键（分子内氢键、分子间氢键）效应、空间效应和振动耦合。

2.外部因素

外部因素主要指溶剂效应和仪器色散元件性能对峰位的影响。通常情况下，溶剂极性增加，极性基团的伸缩振动频率下降。色散元件性能优劣影响相邻峰的分辨率。

（俞　浩）

三、原子吸收分光光度法

原子吸收分光光度法又称原子吸收光谱法（atomic absorption spectrophotometry，AAS），简称为原子吸收法。原子吸收光谱法作为一种新型的仪器分析方法，是利用待测元素所产生的气态基态原子对其特征谱线的吸收程度来进行定量分析的方法。1955年，瓦尔西（Wals）正式提出原子吸收理论，并在近几十年得到迅速发展。原子吸收分光光度法具有灵敏度高、准确性高、重现性好（<0.5％）、用途广、检测样品用量少及选择性好等优点。

（一）工作原理

原子是由带有一定数目正电荷的原子核和相同数目的核外电子组成，核外电子以一定的规律在不同的轨道中运动，每一轨道都具有确定的能量，称为原子能级。当核外电子排布在最低能级时，原子的能量状态叫基态，基态是最稳定的状态。

当原子受外界能量激发时，外层电子可跃迁到不同能级上，通常把电子从基态跃迁到第一激发态所产生的吸收谱线称为共振吸收线。不同元素其原子结构和外层电子排布不同，其共振吸收线的频率也不相同。因此，共振吸收线是与元素的原子结构相关的特征谱线。共振吸收能量最低，最容易发生，一般原子吸收分光光度分析法就是利用元素的共振吸收来进行分析的。原子吸收分析关系符合Lambert-Beer定律：

A=logI0/IV=KVcL

式中，A为吸光度，I0为光源发出的待测元素的共振吸收线的强度，IV为被待测元素原子蒸气吸收后透射光的强度，KV为原子吸收系数，c为物质的量浓度；L为火焰宽度。其中L为定值。

上式表明在一定工作条件下，当吸收厚度一定时，吸收测量的吸光度与被测元素的含量呈线性关系，这是原于吸收光谱定量分析法的基础。

（二）原子吸收分光光度计的组成

原子吸收分光光度计由光源、原子化器、分光系统和检测系统构成。

1.光源

光源有空心阴极灯、无极放电灯和蒸气放电灯三种。光源的作用是辐射待测元素的特征光谱，以供吸收测量之用。光源要符合以下要求：a.能辐射待测元素的共振线，并且具有足够的强度；b.能辐射锐线，即发射线的半宽度比吸收线的半宽度窄得多；c.辐射的光强必须稳定且背景小；d.使用寿命长。

2.原子化器

原子化器通常有火焰原子化器、无火焰原子化器、冷原子化器、氢化物原子化器四种。其作用是将待测元素转化为吸收特征辐射线的基态原子。其性能直接影响测定的灵敏度和重现性。原子化器要符合以下要求：a.原子化效率要高；b.准确度要好且记忆效应要小，背景发射等的影响要尽可能小；c.稳定性好，数据重现性好，噪声低；d.安全、耐用、操作方便。

3.分光系统（单色器）

分光系统是由色散元件（光栅、棱镜）、凹面镜和狭缝组成。在原子吸收分光光度计中，光源发射的光谱除含待测元素的共振线外，还有其他一些谱线，如待测原子的其他谱线（非共振线）、惰性气体谱线、杂质谱线、分子光谱等，这些谱线照射到检测系统上，会对测定造成干扰。因此，单色器的作用就是将待测元素的共振线和其他谱线分开。

4.检测系统

检测系统主要由检测器、放大器、显示记录装置组成。

检测器的作用是将单色器分出的光信号转换成电信号。在原子吸收分光光度法中常用光电倍增管作检测器，既具有光电转换作用，又有放大作用。需要注意的是如果使用太强的光照射，会引起光电倍增管的“疲劳效应”，使灵敏度降低。通常工作电压选择在最高工作电压的1/3～2/3范围内。

放大器是将光电倍增管输出的较弱信号，经电子线路进一步放大。主要采用同步检波放大器即相敏放大器，这种放大器的选频效果好，信噪比高，因为与光源同步，可以减少光源信号频率漂移造成的影响。

现在的原子吸收分光光度计采用原子吸收计算机工作站，使原子吸收分光光度法的自动化程度大大提高。

（三）原子吸收分光光度计的类型

按入射光束可分为单光束原子吸收分光光度计与双光束原子吸收分光光度计；按调制电源方式可分为直流调制分光光度计和交流调制分光光度计；按通道可分为单道原子吸收分光光度计、双道原子吸收分光光度计与多道原子吸收分光光度计。下面简单介绍单道单光束原子吸收分光光度计与单道双光束原子吸收分光光度计的特点。

1.单道单光束分光光度计

优点是结构简单，光能集中，辐射损失少，灵敏度较高，能满足一般分析要求。缺点是不能消除光源波动引起的基线漂移。

2.单道双光束分光光度计

光源发射出的元素共振线光束被旋转切光器分解成强度相等的两束光，两光束交替进入单色器和检测器，检测器输出的信号是两光束的强度比或吸光度之差。单道双光束原子吸收分光光度计可以消除光源和检测器不稳定引起的基线漂移，但它仍不能消除原子化不稳定和背景产生的影响。

（四）测定条件的选择

1.分析线

每种元素都有几条可供选择使用的吸收线，通常选择元素的共振吸收线作为分析线，可以得到更好的灵敏度。

2.狭缝宽度

狭缝宽度的选择以排除光谱干扰和具有一定透光强度为原则。对于谱线比较简单的元素（如碱金属、碱土金属）狭缝宽度可以大些，以提高信噪比和测量精密度，降低检出限；对于谱线复杂的元素（如过渡金属、稀土金属）要求用较小的狭缝宽度，以提高仪器的分辨率，改善线性范围，提高灵敏度。

3.灯电流

原则是在保证空心阴极灯有稳定辐射和足够的入射光条件下，尽量使用低的灯电流。

4.原子化条件的选择

在火焰原子吸收法中，调整喷雾器至最佳雾化状态，改变助燃气体比，选择最佳火焰类型和状态。对于低温、中温火焰中易原子化的元素，可使用乙炔-空气火焰；对于在火焰中易生成难解离的化合物及难熔氧化物的元素，宜使用乙炔-一氧化二氮高温火焰；分析线在220nm以下的元素，可选用氢气-空气火焰。调节燃烧器的高度，使入射光束通过基态原子密度最大区域，可以提高分析的灵敏度。

在石墨炉原子吸收法中，原子化程序要经过干燥、灰化、原子化和除残4个阶段，要通过试验选择各阶段的温度及维持时间。

（五）原子吸收光谱法的应用

1.间接测定法

（1）利用化学反应进行测定　使被测物质与某一定量可测元素形成化合物。经过分离后，或者测定生成化合物中的可测元素，或者测定尚未反应的元素，都可换算出被测物质的含量。

（2）利用干扰效应进行测定　有些元素或化合物对某些元素或物质有增感或降感效应，且影响程度与这些元素或化合物的浓度在一定范围成比例，则可用来间接测定这些元素或化合物。

2.萃取原子吸收光谱法

所谓萃取原子吸收光谱法，就是将萃取分离与原子吸收光谱法结合起来的一种方法。即用溶剂萃取分离和富集试样中的待测元素，然后使萃取后的有机相直接进入原子吸收光谱仪的火焰中进行测定。

（俞　浩）

四、荧光分光光度法

荧光分光光度法（fluorospectrophotometry，FLT）是目前较为常用的一种仪器分析方法。通常情况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态，处于激发态的分子在返回基态的过程中将一部分能量以光的形式释放出来，从而产生荧光。荧光光谱法具有灵敏度高、选择性强、用样量少、方法简便、线形范围宽等优点，被广泛应用于生命科学、医学、药学、化学等领域。

（一）工作原理

某些具有高度共轭体系结构的分子，吸收一定波长的可见光或紫外光后，其共轭体系中的电子发生跃迁，从基态跃为激发态，然后将这部分能量以光子形式发射出来，使处于激发态的电子又回到基态。直接从激发态返回基态所发射的光即为荧光。不同物质由于分子结构不同，其激发态能级的分布具有各自不同的特征。因此，各种物质都有其特征性的荧光激发光谱和发射光谱，根据物质荧光激发光谱和发射光谱的不同能够对物质进行鉴定和含量测定。

（二）荧光分光光度计的组成

荧光分光光度计主要由光源、单色器、样品池、检测器和记录显示装置5部分组成。与紫外分光光度计相比不同的是：a.荧光分光光度计具有两个单色器，一个用于选择激发光的波长，另一个用于分析发射光波长；b.荧光分光光度计检测器与激发光束成一定角度，一般为90°，以排除穿过样品的透射光干扰，检测器大都位于激发光束的右方。

1.光源

常用的光源主要有氙弧灯和高压汞灯。其中氙弧灯是荧光分光光度计中应用最广的光源，它是一种短弧气体放电灯，在200～800nm范围内是连续的光源。但氙灯灯内气压高，启动时电压也高（20～40kV），使用时要注意安全。

2.单色器

荧光分光光度计中应用最多的单色器为光栅单色器。光栅有两块，第一块为激发单色器，用于选择激发光的波长；第二块为发射单色器，用于选择荧光发射光的波长。一般后者的光栅闪耀波长比前者长一些。荧光分光光度计的激发波长扫描范围一般是190～650nm，发射波长扫描范围是200～800nm。

3.样品池

荧光检测器的样品池通常由石英材料制成。与紫外分光光度计的比色皿不同，荧光样品池的四面均为磨光透明面，测量液体样品时，光源与检测器成90°角安排。

4.检测器

一般用光电管或光电倍增管作检测器，可将光信号放大并转为电信号。较高级的有光电二极管阵列检测器，它具有检测效率高、线性响应好、坚固耐用、寿命长、扫描速度快、可同时记录下完整的荧光光谱等优点，有利于光敏性荧光体和复杂样品的分析。

5.记录、显示装置

现代荧光分光光度计都采用计算机进行自动控制和显示荧光光谱及各种参数。

（三）荧光分光光度计的类型

常见的荧光分光光度计按单色器不同可分为三类，即滤光片荧光分光光度计、滤光片-光栅荧光分光光度计和双光栅荧光分光光度计。滤光片荧光分光光度计只适于做定量分析，滤光片-光栅荧光分光光度计和双光栅荧光分光光度计可用于定性或定量分析，但滤光片-光栅荧光分光光度计不能测定激发光谱，且激发波长的选择受到限制。

（四）荧光分光光度计的影响因素

1.温度

温度对物质分子的荧光强度有影响，一般温度低时荧光强度高，温度升高时荧光强度降低。因此，精确的测定要配备恒温装置。

2.pH值

大多数物质只有在一定pH值时才能产生稳定的荧光。因此，采用荧光分析法初次测定某种化合物时，需进行不同pH值分析的预试验，选择能产生稳定荧光的pH值进行测定。

3.溶剂及杂质干扰

由于溶剂的吸光性质和其中的杂质均会干扰样品的荧光强度，所以尽可能选用纯度高的有机溶剂，确定溶质测定波长时应尽可能排除溶剂吸收的干扰。为防止荧光分析中的污染影响测定结果，盛放样品的器皿必须清洗干净。

另外，许多物质的荧光在光照或空气中放置的情况下会逐渐消退，故此类样品要在配成溶液后立即测定，最好绘制荧光-时间曲线，找出荧光强度达到最高峰而又比较恒定的时间。

附　荧光分光光度计操作程序

①开机：接通电源，启动计算机，打开主机开关，预热30min。

②荧光激发光谱测定：设置仪器参数，确定扫描激发波长，找到最大λex。

③荧光发射光谱测定：设置仪器参数，确定扫描发射波长，找到最大λem。

④定量测定：配制一系列已知浓度的标准溶液，在一定的测定条件下，设置λex、λem，测定系列标准溶液的荧光强度，绘制荧光强度-浓度工作曲线。

⑤样品荧光强度测定：不改变仪器参数，测定未知溶液的荧光强度，由工作曲线即可求出未知溶液的浓度。

⑥退出系统，关闭荧光分光光度计电源，关闭计算机。

（俞　浩）