第一章 化脓性细菌

第一节 葡萄球菌的微生物学检查法

病原性葡萄球菌（金葡菌）可引起皮肤黏膜、各种组织器官的化脓性炎症、败血症，还可产生肠毒素引起食物中毒。

一、标本直接涂片染色镜检

（一）材料

1．标本

依据感染部位及不同病情采取标本。

（1）化脓性病灶的脓汁。

（2）败血症采取血液。

（3）脑膜炎患者采取脑脊液。

（4）食物中毒者则分别采取剩余食物，病人的呕吐物和粪便。

2．实验材料

革兰氏染色液一套，载玻片、香柏油、接种环、酒精灯、光学显微镜。

（二）方法 制作标本片，革兰氏染色、油镜观察。

（三）结果 光镜下可见葡萄球菌呈球形或略呈椭圆形，直径0.5～1.5μm，平均1μm，典型者排列呈葡萄串状，革兰氏染色阳性，要注意的是，当衰老、死亡、在陈旧培养物中或被中性粒细胞吞噬后的菌体常转为革兰氏染色阴性。

二、分离培养

（一）材料

1．标本（同标本直接涂片染色镜检）

2．实验材料 血琼脂平板、温箱、接种环、酒精灯。

（二）方法 无菌操作，将标本接种于血琼脂平板上（分离划线技术），接种完毕后，将血琼脂平板置37℃温箱培养24h后观察结果。

（三）结果 对比血琼脂平板上金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的异同，注意菌落的大小、形态、颜色和有无溶血环。

三、血浆凝固酶试验（方法略）

四、耐热核酸酶试验

（一）原理 耐热核酸酶是由致病性葡萄球菌产生的，此酶耐热，100 ℃ 15min或60℃2h不被破坏，此酶能降解DNA或RNA，从而使DNA或RNA长链水解成寡核苷酸链。根据DNA长链可被酸沉淀，寡核苷酸链可溶于酸的特点，来判断是否有核酸酶将DNA、RNA降解。临床上常将耐热核酸酶作为测定葡萄球菌有无致病性的重要指标之一。

（二）材料与方法 实验材料

1．甲苯胺蓝核酸琼脂；

2．金黄色葡萄球菌及表皮葡萄球菌培养物；

3．载玻片、37℃孵育箱、干燥热力灭菌器等。

（三）方法

1．玻片法：取溶化好的甲苯胺蓝核酸琼脂3ml铺于洁净载玻片上，凝固后打上4～8个直径为2 mm的孔，每孔滴加经沸水浴细菌培养物1滴，置37 ℃孵育3 h，观察粉红色圈的大小，应用时设对照。

2．平板法：在分离金黄色葡萄球菌的琼脂平板上挑选所需的菌落并做标记，置60℃干燥热力灭菌器2h，取出后每个平板倾注10ml预先溶化好的甲苯胺蓝核酸琼脂，经37℃ 3h观察结果。

（四）结果 产生耐热核酸酶的金黄色葡萄球菌菌落周围呈粉红色圈为阳性，表皮葡萄球菌为阴性。

五、药敏试验（方法略）

六、葡萄球菌肠毒素检查

（一）原理

某些金黄色葡萄球菌可产生耐热肠毒素，引起人类毒素性食物中毒。将食物中毒病人的呕吐物或剩余物培养后，经加热、离心，取上清液，给实验动物注射，可判断其中是否有耐热的肠毒素。

（二）材料

标本、NaCl高盐肉汤培养基，体重500g左右的幼猫（6～8周龄）、离心机、沉淀管、注射器等。

（三）方法

1．将食物中毒病人的呕吐物或剩余物接种于高盐肉汤管中，经37℃ 24h培养后，再分离纯菌种，培养48h。

2．将高盐肉汤煮沸30min，杀死细菌及破坏其他毒素，将煮沸液3000 r/min离心1h。

3．取上清液2ml注入幼猫腹腔或静脉。

4．于4h内观察结果。

（四）结果

观察幼猫有无呕吐、腹泻、体温升高、死亡等现象。若有这些现象出现。提示有肠毒素存在。

（袁杰）

第二节 链球菌的微生物学检查法

链球菌（A群）引起人类多种疾病，主要有三种类型：①皮肤及皮下组织感染和呼吸道感染；②猩红热；③风湿热和急性肾小球肾炎。

一、标本直接涂片染色镜检

（一）材料

标本：

依据不同疾病，采取有关标本。

①创伤感染取脓液；②咽喉、鼻腔等病灶的棉拭；③败血症取血液。

（二）方法 制片；革兰氏染色；光学显微镜油镜观察。

（三）结果 描述镜下所见细菌的形态、排列和染色性，光镜下可见链球菌呈球形或椭圆形，直径0.6～1.07μm，呈链状排列，从4～8个至20～30个细菌组成，革兰氏染色阳性，注意的是，若培养日久的老龄菌或被中性粒细胞吞噬后可被染成革兰氏阴性，链的长短与菌种和生长环境有关，在液体培养基中形成的链状排列常比取材于固体培养基者长。

二、分离培养

（一）材料

1．标本（同标本直接涂片染色镜检）。

2．实验材料：血琼脂平板、温箱、接种环、酒精灯。

（二）方法 无菌操作 将标本接种于血琼脂平板上（分离划线技术），接种完毕后将血琼脂平板置37℃温箱培养24h后观察结果。

（三）结果 对比血琼脂平板上甲型溶血性链球菌和乙型溶血性链球菌菌落的区别，注意菌落周围溶血环的大小、颜色、透明度。

三、血清学试验：抗链球菌溶血素“O”试验

（一）原理 链球菌在感染者体内产生溶血素“O”，它有很强的抗原性，可刺激机体产生抗溶血素“O”抗体（抗“O”抗体，ASO），导致血清中ASO滴度增高。测定血清中抗“O”抗体，可用于链球菌感染的诊断。血清中ASO的测定方法有多种，在这里仅介绍快速乳胶法。

抗链球菌溶素血素“O”试验（antistreptolysin“O”test）的快速乳胶法是将羧化聚苯乙烯胶乳与溶血素“O”共价交联制成ASO胶乳试剂。ASO高滴度的病人血清被适量的溶血素中和掉正常水平的抗体后，还有ASO多余，这些多余的抗体即与ASO乳胶试剂反应，出现清晰均匀的乳胶颗粒。

（二）材料

1．溶血素“O”溶液，用时摇匀。

2. ASO胶乳试剂，用时摇匀。

3．阳性控制血清和阴性控制血清各1瓶（已经稀释灭活，可直接使用）。

（三）方法

1．血清标本用生理盐水1∶15稀释（0.1ml血清+1.4ml生理盐水）,56℃灭活30min。

2．在反应板（为黑色背底）各格子上分别滴加稀释灭菌血清1滴（约50μl）以及阳性和阴性控制血清1滴，各再滴加溶血素“O”溶液1滴，轻轻摇动1min，使其充分混匀，均匀分布于方格内。

3．滴加ASO胶乳试剂1滴，轻轻摇动3min（室温为18～20℃），将反应板平放在实验桌上。

（四）结果

有清晰凝集者为阳性，不出现清晰凝集者为阴性，阴性者的ASO≤250 IU/ml。

阳性者的1∶15稀释血清，进一步稀释为1∶30,1∶60，再重复步骤2和3，出现凝集的血清稀释度和ASO滴度间的关系大致如下：

稀释度ASO（IU/ml）

1∶15400

1∶30800

1∶601600

（五）注意事项

1. ASO胶乳加入后，轻轻摇动到指定的时间应立即记录结果，超过规定时间后再出现的凝集不判为阳性，阳性控制血清应在指定时间内出现清晰凝集，但不能将阳性控制血清出现凝集的时间视为判断结果的时间界限。

2．室温降低10℃，在胶乳试剂加入后应延长反应时间1min，室温升高10 ℃，应缩短反应时间1min。

3．对所有阳性血清应进行半定量测定，才能对临床医生的判断有更大帮助。

（袁杰）

第三节 肺炎链球菌的微生物学检查法

肺炎链球菌主要引起人类大叶性肺炎、支气管炎、脑膜炎，也可引起中耳炎、乳突炎、副鼻窦炎和败血症等。

一、标本直接涂片染色镜检

（一）材料

标本

临床标本：根据病种采取痰液标本、脓液标本、血液标本、脑脊液标本。

（二）方法 将肺炎链球菌培养物或临床标本沉淀物，涂片进行革兰氏染色镜检。

（三）结果 革兰氏阳性球菌、菌体呈矛头状、多成双排列、宽端相对、尖端向外、菌体周围有透明环此即荚膜位置所在、荚膜需用特殊染色才可见（见荚膜染色法）。

二、分离培养

（一）材料

1．标本（同标本直接涂片染色镜检）。

2．实验材料：血琼脂平板、温箱、接种环、酒精灯。

（二）方法 无菌操作，将标本接种于血琼脂平板上（分离划线技术）。接种完毕后，将血琼脂平板置37℃温箱培养24～48h后，观察结果。

（三）结果 肺炎链球菌在血平板上菌落细小，灰白色，圆形略扁，半透明，有草绿色α溶血环（与甲型溶血性链球菌很相似），若卵育时间大于48h，肺炎链球菌产生足量的自溶酶，菌体渐溶解，菌落中央下陷呈脐状。

三、胆汁溶菌试验

（一）原理

肺炎链球菌可产生自溶酶，可使细菌本身发生溶解。自溶酶可被胆汁、胆盐或其他表面活性物质激活而进一步活化，加速菌体的自溶，促使细菌在短期内溶解。

（二）材料

1．肺炎链球菌菌液及血琼脂平板培养物，甲型溶血性链球菌菌液及血琼脂平板培养物。

2.10%去氧胆酸钠溶液（去氧胆酸钠10g,95%酒精10ml，蒸馏水90ml，将胆盐先溶解于酒精内，加蒸馏水至100ml即成），或猪胆汁，生理盐水。

3．水浴箱、试管、吸管等。

（三）方法

1．试管法 按表排列试管并按要求加入各材料，摇匀，置37℃水浴箱中15～30min观察结果。

2．平板法 各加1滴10%去氧胆酸钠溶液（或猪胆汁）于肺炎链球菌血琼脂平板培养物及甲型溶血性链球菌血琼脂平板培养物上，37℃孵育30min后观察结果。

（四）结果

1．试管法 如细菌悬液仍为混浊状，视为阴性，细菌悬液由混浊变为透明状，则为胆汁溶菌试验阳性。

2．平板法 菌落消失者为阳性，菌落不消失者为阴性。

（五）注意事项

做此试验时注意菌液的pH值以7.6为宜，故一般菌液中加入胆汁后到一定时间仍不溶菌时，最好加1滴稀释的NaOH，然后再进行观察。

四、葡糖发酵试验

（一）原理 肺炎链球菌发酵菊糖产酸，使培养基中指示剂改变颜色。

（二）材料 肺炎链球菌，甲型链球菌，菊糖发酵管，接种环，酒精灯等。

（三）方法 取菊糖发酵管2支，分别接种肺炎链球菌及甲型溶血性链球菌，置37℃温箱孵育18～24h后观察结果。

（四）结果 培养基由紫色变为黄色为阳性，不变色为阴性，肺炎链球菌为阳性，甲型溶血性链球菌为阴性。

五、奥普托率（Optochin）敏感试验

（一）原理

Optochin即乙基氢化羟基奎宁（化学分子式为C2HO5·C9H5N·CHOH）·C7H11N· C2H5），水溶液比较稳定，可冷藏数周，也可高压蒸汽灭菌。几乎所有肺炎链球菌都对Op-tochin敏感，故该试验可鉴别肺炎链球菌和甲型溶血性链球菌。尤其是某些肺炎链球菌菌株胆汁溶菌试验结果不明显，但都对Optochin敏感，因此该试验更可靠。

（二）材料与方法

1．菌种，肺炎链球菌18～24h培养菌液，甲型溶血性链球菌18～24h培养菌液。

2．培养基，血琼脂平板2个。

3. Optochin滤纸片（5μg/片）或6mm滤纸片及1∶4000的Optochin水溶液。

4．镊子，无菌棉签。

（三）方法

1．将肺炎链球菌和甲型溶血性链球菌分别涂布于血琼脂平板各1个。

2．把直径6mm的滤纸片放于1∶4000 Optochin水溶液中，浸湿后分别贴于涂有细菌的平板上。或直接用Optochin滤纸片。

3．置37℃培养18h后观察结果。

（四）结果

肺炎链球菌平板上滤纸片周围可见直径大于20mm的抑菌圈，甲型溶血性链球菌则无或仅有直径小于10mm的抑菌圈。

六、动物毒力试验

（一）原理

在肺炎链球菌中，有少数不产生荚膜，故无致病力，具有荚膜的肺炎链球菌因荚膜具有抵抗吞噬细胞的吞噬致病力最强。可致动物死亡，小白鼠对肺炎链球菌很敏感，故可用来作肺炎链球菌的毒力鉴定，同时可纯化肺炎链球菌。

（二）材料

1．菌种 肺炎链球菌18～24 h培养菌液。

2．动物20g左右健康小白鼠。

3．培养基、血平板、无菌注射、碘酒、酒精等。

4．解剖刀剪、镊子等。

5．荚膜染色液一套、光学显微镜、香柏油、接种环、生理盐水。

（三）方法

1．取20g左右重的健康小白鼠1只，腹腔或皮下注射肺炎链球菌菌液0.2ml，饲养观察。

2．待濒临死亡时，及时解剖，取心血接种血平板做细菌培养。

3．取其腹腔液涂片，做荚膜染色镜检。

（四）结果

1．有荚膜的肺炎链球菌，能使小白鼠在12～36h濒临死亡。

2．血培养可获肺炎球菌纯培养物。

3．有毒力的肺炎链球菌，荚膜染色镜检，可见有明显荚膜。

（五）注意事项

在试验中要特别注意无菌操作，并用无毒力（无荚膜）的肺炎链球菌做对照试验。

（袁杰）

第四节 脑膜炎奈瑟菌的微生物学检查法

脑膜炎球菌是流行性脑脊髓膜炎的病原体，目前我国流行的血清群95%以上是A群。

一、标本直接涂片染色镜检

（一）材料

1．临床标本：依据病情采取以下标本

病人的脑脊液培养。

病人的血液。

病人的淤斑、淤点刺破后的渗出物

带菌者检查可采用鼻咽拭子。

2．实验材料：革兰氏染色液一套，载玻片、香柏油、接种环、酒精灯、光学显微镜。

（二）方法

制作标本片；脑脊液需离心沉淀后，取沉淀物涂片；出血瘀斑，需经碘酊、乙醇消毒病变皮肤后，用无菌针头挑破出血斑，挤出少量血液或组织液，制成印片。革兰氏染色，用光学显微镜油镜观察。

（三）结果

光镜下可见，膜脑炎奈瑟菌呈肾形或豆形，革兰阴性双球菌，两个细菌的接触面较平坦或略向内陷，直径0.6～0.8μm，在患者脑脊液中，多位于中性粒细胞内，形态典型。

要注意的是：人工培养后可形成卵圆形或球状，排列较不规划，单个、成双或4个相联等，在孵育24h后的培养物中，常呈现衰退形态，菌体大小不一致，着色亦深浅不匀。

二、分离培养

（一）材料

1．标本（同标本直接镜检）。

2．实验材料：血清肉汤培养基，血琼脂平板，巧克力色琼脂平板，CO2培养箱，接种环，酒精灯等。

（二）方法

无菌操作，血液或脑脊液标本先接种至血清肉汤增菌后（24 h培养），再在巧克力琼脂平板上划线分离，完毕后，将巧克力琼脂平板置于含5% CO2的环境中37℃孵育24h，观察脑膜炎奈瑟菌在巧克力琼脂平板上的生长情况，菌落特点。

（三）结果

37℃孵育24 h后，形成直径1.0～1.5 mm的无色、圆形、光滑、透明，似露滴状的菌落，在血琼脂平板上不溶血，在血清肉汤中呈混浊生长。

三、动物毒力试验

（一）原理

脑膜炎奈瑟菌的主要致病物质是内毒素，与其他革兰阴性菌内毒素的致病作用一样，也可引起发热、血管舒缩功能紊乱、弥漫性血管内凝血和Shwartzman现象等病理反应。而脑膜炎奈瑟菌内毒素还更容易引起皮肤出血性紫癜和肾上腺出血坏死。动物实验可观察到上述病理反应。

（二）材料

1．脑膜炎奈瑟菌18～24 h培养菌液。

2．动物20g左右重的健康小白鼠。

3．注射器、酒精。

4．解剖刀、剪、盘等。

（三）方法

1．取20g左右重的健康小白鼠1只，将其固定，暴露尾巴，用酒精反复揩擦，使尾部血管充血。

2．取18～24 h培养的脑膜炎奈瑟菌菌液，60℃加热5～10min杀死细菌成为粗制内毒素。

3．取上述处理的菌液1ml，注入小白鼠尾脉静。

4．约5h后，用颈椎脱位法杀死（或已死）小白鼠，解剖观察。

（四）结果 可见皮下弥漫性紫癜，肝脏淤血水肿，肾脏及肾上腺充血，肠系膜及腹壁血管明显充血。

四、玻片凝集试验（血清学分群鉴定）

（一）原理

抗原抗体结合后，在玻片上发生肉眼可见的凝集现象，用已知抗体检测未知抗原，对新分离的脑膜炎奈瑟菌进行分群鉴定。

（二）材料

1．脑膜炎奈瑟菌诊断血清（抗体）

多价Ⅰ（包括A、B、C、D四群）。

多价Ⅱ（包括1889、1890、1892、319群）。

多价Ⅲ（包括1916、1486、1811群）。

2．脑膜炎奈瑟菌培养物（抗原）。

3．实验材料、清洁载玻片、接种环、酒精灯等。

（三）方法

在一清洁玻片上按顺序分放一接种环多价Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ诊断血清，再用接种环蘸取待检菌少许，分别与上述三种多价血清混匀，摇动玻片，于2min后观察结果。

（四）结果

凝集者为颗粒状，不凝集者仍为混悬状，如果与某一多价血清凝集者后（多价Ⅰ）与其他两者不凝集者（多价Ⅱ、Ⅲ）说明待检菌为A、B、C、D四群中之一，可进一步用群血清定群，如待检菌与A群血清发生凝集者，说明待检菌为A群，这在流行病学调查中及预防方面有着重要意义。

五、快速诊断法一：ELISA双抗体夹心法

（一）试剂

（1）流脑A群多糖抗体 可从生物制品所购置抗血清，经50%饱和硫酸铵盐析得γ-球蛋白组分，再通过SPA-Sepharose 4B免疫吸附柱，获得IgG，用作包被与酶标记抗体。

（2）HRP-抗体结合物（辣根过氧化物酶-抗体结合物），用改良过碘酸钠法制备。

（3）流脑多糖抗原 可自生物制品所购置，用作阳性对照。

（4）正常人血清56℃30min灭活作阴性对照。

（5）待测流脑患者血清、脑脊液56℃30min灭活。

（6）其他试剂 同ELISA常法。

（二）方法

（1）将抗体用包被液稀释至20μg/ml，每孔加0.1ml,4℃过夜后洗3次。

（2）待检标本用稀释液1∶10稀释后每孔加0.1ml,4℃过夜或37℃2h，洗3次。

（3）加HRP-抗体结合物：用稀释液稀释成工作浓度（经事先预试），每孔加0.1ml, 37℃2h后洗3次。

（4）每孔加底物0.1ml,37℃20min，然后用2mol/L H2SO4终止反应，测492nm吸光度（A）值。

（三）结果观察

用健康人血清标本按上述ELISA试验测A值，以大于此A值95%可信限上限（x-+2SD）为阳性。

（四）注意事项

此法敏感性高，可检出抗原浓度为0.365 ng/ml，但待检标本应56 ℃ 30min灭活，否则会出现假阳性。缺点是ELISA法试剂要求高，酶结合物浓度要求严格，保存较久的需先测定一下最适稀释倍数。另外，包被抗体一定要纯，否则影响特异性，可将从生物制品所购置的抗体用盐析法粗提，再用Sepharose-SPA亲和层析柱提纯。本法与细菌学检查及CIE合用可大大提高检出率。

六、快速诊断法二：SPA-协同凝集试验

（一）试剂

（1）含A蛋白葡萄球菌悬液：可由生物制品所购置，也可自制。

（2）高效价A群流脑免疫血清：可从生物制品所购置，也可以患者脑脊液中分离的A群流脑菌株，按一般方法免疫家兔制成，效价需＞1∶2560。

（3）抗体致敏含A蛋白葡萄球菌，取1ml 10% SPA菌悬液加入0.1ml A群流脑高效价免疫血清，混匀后37℃水浴30min，经常摇动。以4000 r/min离心20min，弃上清，沉淀物用PBS洗2次，配成1%悬液。

（二）方法

（1）取10% SPA菌悬液4000 r/min离心20min，弃上清液，在沉淀的菌体中加入0.3ml脑脊液或血清，混匀，置室温5min后离心沉淀，取上清液待用。

（2）加1滴吸收过的血清或脑脊液于洁净玻片上，再加1滴抗体标记的SPA菌悬液，混匀，摇动5min，肉眼观察凝集情况。

（三）结果观察

4+：菌体凝集成大颗粒，液体透明。

3+：菌体凝集成较大颗粒，液体透明。

2+：菌体凝集成较小颗粒，液体较透明。

1+：部分菌体凝集成较小颗粒，液体混浊。

-：无颗粒出现，液体呈均匀混浊或延长至5min后出现细小颗粒。

以“2+”以上凝集为阳性。

对照试验用已吸收过的脑脊液对未标记的1% SPA菌悬液和PBS标记的SPA菌悬液，均应为阴性。

（袁杰）

第五节 淋病奈瑟菌的微生物学检查法

淋球菌是人类淋病的病原菌，主要引起人类泌尿生殖系统黏膜的急性或慢性化脓性感染

一、标本直接涂片染色镜检

（一）目的 观察淋病奈瑟菌的形态、大小、排列和染色特性

（二）材料

1．标本

临床标本：泌尿生殖道脓性分泌物棉拭子。

子宫颈表面分泌物棉拭子。

2．实验材料：革兰氏染色液一套，载玻片、香柏油、接种环、酒精灯、光学显微镜。

（三）方法 制作标本片、革兰氏染色，用光学显微镜油镜观察。

（四）结果 光镜下可见形态与脑膜炎奈瑟菌相似，革兰氏染色呈阴性，直径0.6～0.8μm，常成双排列，两菌接种面平坦，似一对咖啡豆，脓汁标本中，大多数淋病奈瑟菌常位于中性粒细胞内，但慢性淋病病人的淋病奈瑟菌多分布在中性粒细胞外。

二、分离培养

（一）材料

1．标本（同标本直接涂片镜检）。

2．实验材料：巧克力（色）血琼脂平板，Thayer-Martin（T-M）培养基。

接种环，酒精灯，温箱。

（二）方法

无菌操作，将标本接种于巧克力（色）血琼脂平板和T-M培养基，置5% CO2条件下，35～36℃孵育48h后观察结果。

（三）结果

孵育48h后可见凸起圆形灰白色，直径0.5～1.0 mm的光滑型菌落。

三、氧化酶试验

（一）原理

淋病奈瑟菌具有氧化酶，它在生长过程中，在氧的存在下使细胞色素C氧化成氧化型细胞色素C，此型酶能够氧化氧化酶试剂，出现颜色反应，在培养基上生长了18～24 h的淋病奈瑟菌菌落上滴加氧化酶试剂，则菌落的颜色可变成红色，并逐渐变成黑色。

（二）材料

1．淋病奈瑟菌巧克力血琼脂平板培养物（菌落）。

2．氧化酶试剂（0.5% ～1%）新配制的盐酸四甲基对苯二胺或盐酸二甲基对苯二胺水溶液。

3．吸管

（三）方法

将氧化酶试剂用蒸馏水配成0.5% ～1%水溶液，将溶液滴加于可疑菌落上，如菌落颜色变红，则为氧化酶试验阳性。也可先将试剂滴在一张滤纸片上，然后挑取可疑菌落与之接触，或先将菌落涂在滤纸片上再滴加试剂，观看有无红色出现。

（四）结果

菌落在接触氧化酶试剂10～15 s内出现红色并能保持30 s以上者为氧化酶试验阳性。

（五）注意事项

（1）淋病奈瑟菌氧化酶试验为阳性，但氧化酶阳性的不仅仅是淋球菌。氧化酶阴性一般可排除淋病奈瑟菌。

（2）为了保证有良好的反应，所有氧化酶试剂不应是过分陈旧的。正常的氧化酶试验（盐酸二甲基对苯二胺）应为粉红色。如果试剂已成灰色或黑色，说明已失效而不应再使用。

（3）试剂配好后应放在棕色玻璃瓶内，避光保存并尽快用完。

（4）氧化酶试剂遇铁也会出现红色而造成假阳性。所以操作用的白金耳应避免用旧铁丝和电炉丝等制成。最好用铂丝，或用节育环的合金丝制成。并在每次试验之前先检查是否未挑取菌的接种环就有红色出现。

（5）挑取菌落转种应在菌落变黑之前进行，一旦菌落变黑，多数菌即死亡。为了保存活菌，可仅滴加部分菌落。

（6）氧化酶试剂盐酸四甲基对苯二胺和盐酸二甲基对苯二胺性状基本相同，但前者反应更灵敏，显色反应的时间比后者快。

现有商品性氧化酶试验纸片出售，是由氧化酶试剂和α-奈胺的混合物制成的。用时将菌落少许涂于纸片上，在20～60 s之内颜色变蓝或变黑者为阳性。纸片可干燥保存，使用方便。

（六）临床意义

在混有杂菌的淋球菌分离平皿上，对菌落形态相像而滴加氧化酶试剂后变色的菌落即有可能是淋病奈瑟菌。氧化酶试验对快速鉴定淋病奈瑟菌有一定意义。氧化酶试验、菌体形态和菌落形态是初步鉴定淋病奈瑟菌的三个标准。

四、糖发酵试验

（一）原理

淋病奈瑟菌具有分解某些糖类如葡萄糖的能力，产酸不产气，使培养基的pH值下降，指示剂颜色发生改变，但淋病奈瑟菌不能利用某些糖如麦芽糖，因而该培养液颜色不变。

（二）材料

1．淋病奈瑟菌巧克力血琼脂培养物。

2．缓冲平衡盐指示溶液（BSS）。每升BSS中含磷酸氢二钾0.4g、磷酸二氢钾0.1g、氯化钾8g、酚红0.6g。pH值为7.1～7.2。经过滤灭菌后贮存于4℃冰箱备用。

3.20%过滤灭菌的葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖溶液。

4．无菌试管五支（70mm×10mm），无菌吸管、试管架等。

（三）方法

（1）用无选择性的巧克力琼脂平皿转种受检菌株，以获得纯菌。挑取培养24h的纯菌2满环混悬于0.3～0.4ml缓冲平衡盐指示溶液（BSS）中，制成浓厚菌悬液。

（2）用5支试管（70mm×10mm），在第1～4管中分别加入20%的过滤灭菌的葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和乳糖溶液各0.05ml，第5管不加糖作为对照。

（3）每管加0.1ml BSS。

（4）每管加0.05ml细菌悬液，充分混匀，在37℃水浴箱中孵育4h，观察结果。

（四）结果

淋病奈瑟菌发酵葡萄糖，不发酵其他糖。因此，只有葡萄糖管的pH值下降，颜色由红变黄，其他糖管颜色不变。

（五）注意事项

（1）用于糖发酵试验的糖的纯度要高。如果麦芽糖或其他糖类中混进了葡萄糖，则可能产生使人误解的结果。

（2）用作试验的菌要纯。如混有杂菌，则会使结果杂乱无章。

（3）应使用18～24h的淋病奈瑟菌培养物。如使用培养24h以上的培养物，可能产生假阴性的结果。

（4）由于淋病奈瑟菌在普通营养琼脂中生长得不好，所以如果使用固体培养基作糖发酵试验，则在培养基中应加入少许血清等动物蛋白。

（5）如使用胱氨酸胰酶琼脂（CTA）作糖发酵试验，可用接种针将菌种入培养管的上1/3。如将琼脂量由1%增加到1.5%，糖含量由1%增加到2%，则糖发酵的时间可缩短到4h。如将糖发酵管放于37℃水浴中，则看结果的时间可再缩短。

（六）临床意义

糖发酵试验在淋病的实验室诊断中主要用来作菌株的进一步鉴定。当从某人的咽部分离出在菌形、菌落和氧化酶都与淋奈瑟菌一样的菌时，到底应鉴定为淋病奈瑟菌还是脑膜炎奈球菌，糖发酵试验尤其是对麦芽糖的发酵与否对鉴别有决定性意义。

五、直接荧光抗体染色

（一）原理

将淋病奈瑟菌抗血清（Ab）用荧光素标记，当遇到待检标本中有淋病奈瑟菌（Ag）时，抗体与抗原结合，在荧光显微镜下可见到发荧光的菌体。

（二）材料

（1）荧光素标记的淋病奈瑟抗血清（Ab）。

（2）淋病奈瑟菌巧克力血琼脂培养物。

（3）待检患者标本。

（4）磷酸缓冲液、接种环、载玻片、盖玻片。

（5）荧光显微镜。

（三）方法

（1）将可疑菌制成菌悬液。

（2）用接种环取1环菌液于载玻片的圆圈内，同时再涂1张涂片作革兰染色，以作对比用。

（3）涂片置空气中干燥，加热固定。

（4）把荧光纱标记的淋病奈瑟菌抗血清铺到涂膜上，放于一个湿盒中，置室温5min。

（5）用磷酸缓冲液轻轻淋洗，充分洗去未结合的血清。

（6）再将涂片放在空气中干燥。

（7）在涂膜中央加1滴甘油封固液，盖上盖玻片，盖时防止产生气泡。

（8）在荧光显微镜下观察结果。

（四）结果

阳性标本可在荧光显微镜下见到发苹果绿色荧光的双球菌（淋病奈瑟菌）。

（五）注意事项

（1）本法为直接荧光抗体染色法，标本制成后即可进行染色和观察，只有抗原抗体两种因子参加反应，所以方法简便、快速，且死菌也可用作试验。

（2）市售的某些抗淋球菌荧光抗体也可和脑膜炎球菌及其他奈瑟氏菌起交叉反应。此外，还发现有些淋球菌菌株不与所用血清起反应。因此，在判断结果时应综合所有材料，全面分析。

（3）血清工作液的稀释度应在试剂配成后立即加以测定，应比能出现+ + + +的最高稀释度浓1倍。如1∶32以内血清均能出现+ + + +，则工作液稀释度应为1∶18。

（4）抗原抗体结合的条件为室温（20℃）5min。提高温度和延长时间可加速结合过程，有人主张将温度提高到37℃或40℃，可使反应更迅速，结合更牢固。

（5）反应的环境应保持一定湿度，否则，干燥的荧光抗体附着玻片上会造成非特异荧光。

（6）封固剂中甘油的纯度要高，否则甘油产生的自发荧光会影响对结果的正确判断。

（7）试验应设置阳性和阴性对照，只有对照符合要求，试验的结果才能成立。

（六）临床意义

本试验和糖发酵试验一起用作淋病奈瑟菌的进一步鉴定。待检菌株如菌体形态、菌落形态和氧化酶试验符合淋病奈瑟菌标准，则加上荧光抗体试验和糖发酵试验可作出最后诊断。

（袁杰）

第六节 铜绿假单胞菌的微生物学检查法

铜绿假单菌为条件致病菌，经常引起手术切口、烧伤组织感染，表现为局部化脓性炎症，也引起中耳炎、尿道炎。

一、标本直接涂片染色镜检

（一）材料

1．临床标本：烧伤组织感染的化脓性病灶的标本。

2．实验材料：革兰氏染色液一套、鞭毛染色液一套载玻片、香柏油、接种环、酒精灯、光学显微镜。

（二）方法 制作标本片，革兰氏染色，鞭毛染色，用光学显微镜油镜观察。

（三）结果 光镜可见革兰氏阴性杆菌，菌体长短不一，约为0.5～1.0μm×1.5～3.0μm大小的直或微弯杆菌。

动力观察（压滴法）运动活跃。

鞭毛染色可见菌体一端有1～3根鞭毛。

二、分离培养与鉴定

（一）材料

1．标本（同标本直接涂片镜检）。

2．实验材料，普通平板，血琼脂平板，SS平板，MCK平板及其他生化培养基，各种相关生化试剂。

（二）方法 无菌操作，将标本接种于上述培养基中，置35℃及42℃和孵育箱中孵育24～48h，最适生长温度为35℃，在4℃不生长而在42℃可生长是铜绿假单胞菌的一个特点。

（三）结果

1．在普通平板上形成圆形，大小不一，边缘不整齐、扁平、光滑湿润而常呈融合状态的菌落，由于该菌产生水溶性的绿色色素，琼脂被染成蓝绿色或黄绿色。

2．在血平板上形成大而扁平，湿润，有金属光泽，有生姜味的灰绿色或蓝绿色菌落，并形成透明溶血环。

3．在MCK平板上可形成微小、半透明菌落，48h后菌落中心常呈棕绿色。

4．在SS平板上形成类似沙门氏菌的乳糖不发酵菌落，稍后菌落中央也呈综绿色。

5．生化反应结果为：

动力（鞭毛）+，葡萄糖+，麦芽糖-，木糖+，在枸橼酸盐培养基上生长+，氧化酶+，赖氨酸脱羧酶-，精氨酸双水解酶+，乌氨酸脱羧酶-, H2S-，在42℃生长（脑心浸汤内）+。

（袁杰）

第七节 培养化脓性细菌常用的培养基

1．甲苯胺蓝核酸琼脂

（1）成分：营养琼脂100ml, DNA0.2g,80g/l氯化钙溶液1ml。

（2）制备：调pH值至7.2，先将DNA溶于2ml,0.1mol/l NaOH溶液中，将其加入到营养琼脂中，于加入氯化钙，将甲苯胺蓝0按0.1g/l加入，68.95 kPa（10磅）灭菌20min，取出冷至50℃左右，倾注平板后备用。

2. NaCl高盐肉汤培养基

（1）成分：示蛋白胨10g，牛肉膏1g, NaCl 25g蒸馏水1000ml。

（2）制备：溶解后矫正pH值至7.4，分装于试管，高压灭菌103.4 kPa（15磅）20min后备用。

3．菊糖发酵管

（1）成分：蛋白胨0.5g，菊糖1.0g，牛或兔血清20ml,1% ～6%溴甲酚紫乙醇溶液0.1ml，蒸馏水80ml。

（2）制备：将蛋白胨溶解于蒸馏水中，加入血清混合后矫正pH值至7.4～7.6，然后加入菊糖及溴甲酚紫指示剂，分装于小试管，采用间歇灭菌法，将试管置于流通蒸气灭菌器内（或蒸笼）100℃加热15～30min，取出后放入37℃孵育过夜，次日再蒸一次，如此连续三次后备用。

4．血琼脂平板和巧克力琼脂的配制。

（1）成分：肉浸液（或肉膏液）琼脂（pH值7.2～7.4）1000ml。

无菌脱纤维羊血（或兔血）80～100ml。

（2）制备：将琼脂高压灭菌，待冷至50℃时加入无菌脱纤维羊血（血液在临用前置37℃水浴预热），轻摇后倾注于干燥平皿中。凝固后抽样于37℃培养18～24 h，无菌生长者冷藏备用。为抑菌杂菌，可于冷却到45℃左右时加入多黏菌素B25 U/ml（和/或万古霉素3.3μg/ml）。

巧克力琼脂的成分同上，当培养基冷却到50℃左右时加入脱纤维羊血，摇匀后再置水浴中，徐徐加热到85～90℃5～10min，再冷却到50℃左右，轻轻摇匀后注入灭菌平皿中。

5. Thayer-Martin（T-M）培养基配制法

（1）GC基础培养基：国外有成品。成分为蛋白胨1.5g，玉米粉0.1g, K2HPO40.4g, KH2 PO40.1g, NaCl 0.5g，琼脂1.2g。

（2）V -C -N抑菌剂：1ml溶液中万古霉素（Vancomycin）300μg，黏菌素（Colistin）750μg，制霉菌素（Nystatin）1250U。改良T-M培养基尚加入磺胺增效剂500μg。

平时贮藏于-20℃ ～ -8℃，溶解后应立即用完，或贮存-20℃以下，2周内用完。上述1ml V-C-N抑菌剂可配100ml培养基。

（3）Iso Vitalex增菌剂：

每升蒸馏水中加入：

维生素B12（Vitamin B12）0.01g

L-谷酰胺（L-Glutamine）10.0g

P-氨基苯甲酸（P-Aminobonzoic acid）0.012g

腺嘌呤（Adenine）1.0g

鸟嘌呤（Guanine HCL）0.03g

二磷酸吡啶核苷酸（Diphosphopyridine Nucleotide Oxidzed, Coenxymel）0.25g

硫胺焦磷酸（Cocarboxylase）0.100g

硝酸铁（Ferric Nitrate）0.020g

硫胺（Thiamine HCL）0.003g

L-半胱氨酸（L-Cysteine HCL）25.900g

L-胱氨酸（L-Cystine）1.100g

葡萄糖（Dextrose）100.000g

现已有成品出售并附有稀释液。

配法：

（1）制取双倍浓度的基础培养基：将GC基础培养粉7.2g溶于100ml蒸馏水中（用500ml烧瓶），充分混匀，边加热边搅动，直至煮沸1min，使完全溶解。

（2）将2g血红蛋白粉加到100ml水中制成2%溶液。混合时，2g血红蛋白粉先加水2～3ml，研成糊状，再逐步加入蒸馏水，使整个溶液成匀浆状。也可用成品2%血红蛋白溶液。

（3）将上述二液分别高压灭菌103.4kPa（15磅）121℃15min后冷却到50℃左右备用。2%血红蛋白溶液成品，不必高压，只需在临用前稍加热即可。

（4）配制增菌液：每安瓶增菌液加入附来的稀释液2ml，使溶解。

（5）配制抑菌液：每安瓶抑菌液以无菌操作加入蒸馏水2ml，摇动，使充分溶解。

（6）以无菌操作将100ml,2%的血红蛋白溶液、2ml增菌液、2ml抑菌液和100ml GC培养基混合。总体积算作200ml（实际应为204ml），可倒70mm平皿20个。

（7）缓缓摇匀后倒平皿，4℃冰箱保存待用。

（袁杰）