第二章 肠道感染细菌

第一节 大肠埃希菌的微生物学检查法

多数大肠埃希菌在肠道内不致病，但如移位至肠道外的组织或器官则可引起肠道外感染以化脓性感染（如腹膜炎、阑尾炎、手术创口感染）泌尿道感染（尿道炎、膀胱炎、肾盂肾炎）最为常见，婴儿、老人或免疫力低下者可致大肠埃希菌败血症，新生儿可致大肠埃希菌性脑膜炎。

一、标本直接涂片染色镜检

（一）材料

1．标本

依据病情采取中段尿标本、脓液标本、痰液标本、脑脊液标本。

2．实验材料：革兰染色液一套、鞭毛染色液一套、载玻片、香柏油、接种环、酒精灯、光学显微镜。

（二）方法 制作标本片、革兰氏染色、油镜观察。

（三）结果 镜下可见中等大小的革兰阴性杆菌，两端钝圆，单个存在，宽为0.4～1μm，长为0.7～3μm，动力观察（压滴法），运动活跃。

鞭毛染色，光镜下观察，多数菌株有周身鞭毛。

二、分离培养与鉴定：

（一）目的 熟悉大肠埃希菌的培养特性及生化反应等。

（二）材料

1．标本

2．实验材料

培养基：SS-琼脂，克氏双糖铁（KIA）培养基，蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水、枸橼酸盐琼脂、普通半固体培养基。

（三）方法 无菌操作将标本接种于上述培养基中，置37℃,24h孵育后观察结果。

（四）结果 培养特性及生化反应

（李红橙）

第二节 志贺菌的微生物学检查法

志贺菌引起细菌性痢疾，痢疾志贺菌感染患者病情较重，宋内志贺菌多引起轻型感染，福氏志贺菌感染易转变为慢性，病程迁延，我国多见后两种。

一、标本直接涂片染色镜检

（一）材料

1．标本

临床标本：采取粪便或肛拭。

2．实验材料：革兰染色液一套、载玻片、香柏油、接种环、酒精灯、光学显微镜。

（二）方法

制作标本片，革兰氏染色，油镜观察。

（三）结果

光镜下可见宽0.5～2μm，长0.7～3μm革兰阴性的短小杆菌，无鞭毛（鞭毛染色）此点可与大肠埃希菌相区别。需要说明的是，肠道内粪便中有多种革兰阴性杆菌，仅靠革兰染色镜检，是难以作出诊断的。

二、分离培养与鉴定

（一）材料

1．标本（同直接涂片染色镜检）。

2．实验材料，普通琼脂平板，SS琼脂平板，克氏双糖铁、五糖管（葡、乳、麦、甘、蔗）、蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水、枸橼酸盐培养基、普通半固体培养基、尿素培养基）。

（二）方法

无菌操作，将标本接种于上述各种培养基中，置37℃温箱孵育24h后观察结果。

（三）结果

三、血清学试验（玻片）凝集反应

（一）目的 对志贺菌进行定群定型或亚型。

凡生化反应符合志贺菌属者，均需作血清学鉴定。

（二）材料

（1）标本：待检细菌培养物。

（2）实验材料：志贺菌诊断血清一套，无菌生理盐水、载玻片、接种环、酒精灯等。

（三）方法 在清洁玻片上放一接种环志贺菌多价诊断血清，（A群1、2型，B群1-6型、C群1-6型及D群），再用接种环蘸取待检菌少许并与血清混匀，摇动玻片于2min后观察结果。

（四）结果 若凝集成颗粒状为阳性，反之为阴性，多价诊断血清作玻片凝集可定其群，然后以单价血清定型与亚型。

四、毒力试验（Sereny试验）

（一）目的 测定志贺菌的侵袭力。

（二）材料

1．标本

受试菌（经鉴定的志贺菌）,18～24h的固体培养物。

大肠埃希菌18～24h的固体培养物。

2．实验动物，健康豚鼠一只。

3．其他材料，无菌注射器二支，无菌生理盐水，比浊管。

（三）方法 取受试菌18～24h的固体培养物，以无菌生理盐水制成9×109/ml细菌悬液（比浊法），接种于豚鼠一侧眼结膜囊内，另一侧用大肠埃希菌作对照，48h后观察结果。

（四）结果 若实验侧发生角膜结膜炎，对照侧无变化，则为Sereny试验阳性，表示受试菌有侵袭力，为有毒力的志贺菌株。

五、免疫荧光菌球法

（一）目的

熟悉志贺菌免疫荧光球检查法的原理、方法及结果判断。

（二）原理

志贺菌荧光菌球检查法是一种志贺菌的快速诊断方法，6～8h即可得出结果。液体培养基中散在的细菌在温度适宜时能迅速发育繁殖并与培养基中的相应抗体结合而成为一个菌团。如在液体培养基中的抗体是用荧光素标记的抗体，则在荧光显微镜下观察到的菌团会发出荧光，称此现象为荧光菌球。与荧光抗体不对应的细菌呈均匀浑浊生长，不形成荧光菌球。

（三）材料

1．荧光素标记的志贺菌免疫血清。

2．待检菌。

3．液体培养基：蛋白胨水。

4．无菌吸管、接种环、载玻片。

5．荧光显微镜。

（四）方法

1．以无菌操作吸取1∶30～1∶100倍稀释的荧光抗体（以蛋白胨水稀释），在划有A、B两方格的玻片上，各滴加1滴。

2，然后用接种环（内径为2mm）挑取一满环被检材料（粪液或菌液），接种于A方格含荧光抗体培养基中，混匀后再从A方格挑一环接种于B方格含荧光抗体的培养液中。

3．置湿盒内37℃培养6h左右，将玻片置荧光显微镜下观察结果。

（五）结果

1．在低倍荧光显微镜下，如果形态结构清楚，亮度在+ + +以上的典型菌球有1个以上为阳性，一般急性病例判断结果时须典型菌球在数个以上。

2．在荧光显微镜下看到的志贺菌荧光菌球是发黄绿色荧光的结构，似晴空的云团，或者似边缘不规则的云雾状，大小几十微米到几百微米不等。

（李红橙）

第三节 沙门菌的微生物学检查法

人类沙门菌感染有4种类型：①肠热症包括伤寒沙门菌引起的伤寒，以及甲型副伤寒沙门菌，肖氏沙门菌、希氏沙门菌引起的副伤寒；②胃肠类；③败血症；④无症状带菌者。

一、标本直接涂片染色镜检

（一）材料

1．标本

依据病程采取临床标本：血液、骨髓、粪尿标本（直接涂片难以见到细菌）。

2．实验材料：革兰染色液一套，鞭毛染色液一套，载玻片，香柏油，接种环，酒精灯，光学显微镜。

（二）方法 制作标本片，革兰氏染色及鞭毛染色，油镜观察。

（三）结果 革兰氏阴性杆菌、大小为宽0.6～2.0μm，长1.0～4.0μm，动力观察，运动活跃，鞭毛染色，有周身鞭毛。

二、分离培养与鉴定

（一）材料

1．标本：

临床标本：血液、骨髓液、粪便或肛拭、尿液等。

2．培养基：普通琼脂平板、SS琼脂平板、克氏双糖铁、五糖管（葡、乳、麦、甘、蔗）、蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水、枸橼酸盐培养基，普通半固体培养基、尿素培养基。

（二）方法 无菌操作，将标本接种于上述各种培养基中，置37℃温箱，孵育24h后观察结果。

（三）结果 培养特性及生化反应。

三、血清学试验（玻片凝集试验）

（一）目的 对沙门菌进行定组、定型，凡培养特性及生化反应符合沙门菌者均需作血清学鉴定。

（二）材料

1．标本：临床标本培养物（待检细菌）。

2．诊断血清，沙门菌A-F多价○诊断血清，单价○诊断血清，第1相因子血清，第2相因子血清。

3．无菌生理盐水，载玻片，接种环等。

（三）方法与结果

（1）取一滴A-F组多价O诊断血清于载玻片上，再取少许试验菌与之混合，同时设有对照，若对照均匀混浊，而试验菌数分钟内出现肉眼可见的颗粒凝集物，即为阳性，可确定为沙门菌属。

（2）继续将试验菌与沙门菌单价因子O血清作凝集试验，确定试验菌属于哪一组。

（3）再进一步鉴定其鞭毛抗原，选用第1相因子血清（a, b, c, d, …）检查第1相H抗原，若发生凝集，再选用第2相H抗原，以确定试验菌是哪一型沙门菌。

（4）若生化反应典型，而与A-F多价O诊断血清不凝集者，应考虑是否有Vi抗原存在，可在玻璃试管内用生理盐水将细菌制成浓菌液，放入沸水中15～30min，冷却后再次做凝集试验，因Vi抗原能阻断O凝集反应，而煮沸处理能破坏菌体表面的Vi抗原。

四、肥达（Widal）试验

（一）目的：熟悉肥达试验的原理、方法及结果判断。

（二）原理

肥达（widal）反应是用已知的伤寒沙门菌O、H抗原和甲型副伤寒沙门菌、肖氏沙门菌的H抗原，与病人血清做定量凝集试验，以测定患者血清中有无相应抗体存在，作为伤寒、副伤寒临床诊断的参考。一般应间隔5～7d重复采血检查，如抗体随病程进展上升，即有诊断价值。

（三）材料

伤寒沙门菌O、H菌液，甲型副伤寒沙门菌、肖氏沙门菌H菌液，生理盐水和病人血清，1ml吸管，试管架，52℃水浴箱等。

（四）方法

1．取洁净小试管28支，分成4排，每排7支，依次编号。

2．于小试管内各注入生理盐水0.5ml。

3．在每一排第1管各加病人血清0.5ml，用1ml吸管吸3次混匀，取出0.5ml注入每排第2管做倍比稀释……依次稀释至第6管，弃去0.5ml，第7管做对照（也可用中试管先将血清作倍比稀释，再分别注入各排管内）。

4．从第7管开始，从后向前，于第1排各管内注入伤寒沙门菌H菌液0.5ml，于第2排各管内注入伤寒沙门菌O菌液0.5ml，于第3排各管内注入甲型副伤寒沙门菌H菌液0.5ml，于第4排各管内注入肖氏沙门菌H菌液0.5ml。

5．加完菌液，震荡试管架混匀，至52℃水浴2～4h，取出后室温过夜，次日观察结果。

（五）结果

1．凝集程度：不要摇动试管，观察各管底部细菌凝集情况。凝集程度，以“+”多少表示。

+ + + +——最强，上液澄清，细菌全部凝集沉积于管底。

+ + +——强，上液轻度浑浊，细菌大部分凝集沉积于管底。

+ +——中强，上液半浑浊，细菌部分凝集。

+——弱，上液浑浊，细菌少部分凝集。

-——不凝集，液体呈乳状与对照管相同。

2．效价判定：对照管不发生凝集时，依次观察各实验管。以使凝集呈“+ +”反应的血清最高稀释度为其凝集效价。

3．结果判断：根据4排试管的凝集效价，结合正常值和临床综合判断结果。

（李红橙）

第四节 霍乱弧菌的微生物学检查法

霍乱弧菌分为古典生物型和EL-Tor生物型，所引起的霍乱我国规定为法定甲类传染病，故实验过程中应严格遵守操作规程，采取严格的防护措施。

一、标本直接涂片染色镜检

（一）材料

1．标本

临床标本：采取病人粪及肛拭子。

2．实验材料：革兰氏染液一套、鞭毛染色液一套、载玻片、香柏油，接种环、酒精灯、光学显微镜。

（二）方法

1．制作标本片，革兰氏染色，鞭毛染色，油镜观察。

2．悬滴法观察动力：取病人米泔水样粪便或培养物作悬滴观察。

（三）结果

1．光镜观察可见霍乱弧菌菌体大小为宽0.5～1.5μm，长0.8～3μm，典型形态呈弧型或逗点状，革兰氏染色阴性，鞭毛染色，在菌体一端有一根单鞭毛。

2．悬滴观察，细菌运动非常活泼，呈穿梭样或流星状。

二、分离培养与鉴定

（一）材料

1．标本（同标本直接涂片镜检）

2．实验材料

培养基：碱性蛋白胨水，碱性琼脂平板，TCBS琼脂，血平板，双洗琼脂，供生化试验使用的各种培养基及试剂。

（二）方法

无菌操作，将标本接种于上述各种培养基中，置37℃温箱，孵育18～24h后观察结果。

（三）结果

1．霍乱弧菌的培养特性与临床标本检查结果对照表（见下表）。

2．霍乱弧菌的主要生化反应与临床标本检查结果对照表（见下表）。

3．作生化试验进行生物分型，确定是古典生物型还是EL-Tor生物型。

4．霍乱红反应

（1）原理：当霍乱弧菌培养在含硝酸盐和色氨酸的培养基中，产生的吲哚与亚硝酸盐在浓硫酸存在时成红色化合物，称霍乱红反应阳性。

（2）材料

1）霍乱弧菌碱性蛋白胨水。

2）试剂浓硫酸。

3）滴管。

（3）方法：取霍乱弧菌碱性蛋白胨水加入浓硫酸数滴观察有无红色反应。

（4）结果：红色者为霍乱红反应阳性，反之为阴性。

三、制动试验

（一）原理

霍乱弧菌在液体培养基中可见有流星似的运动，若在培养液内加入霍乱免疫血清，则霍乱弧菌凝集，运动停止，此即为制动试验。用于霍乱弧菌的快速早期诊断。

（二）材料

1．病人水样便6h蛋白胨水培养液；

2．霍乱免疫血清；

3．无菌生理盐水、吸管；

4．培养箱：光学显微镜。

（三）方法

1．取病人水样便6h蛋白胨水培养液0.25ml，加适量稀释的霍乱免疫血清0.25ml，混匀。

2．取上述检材0.25ml，加0.25ml生理盐水混匀，作为对照。

3．置37℃5min，观察结果。

（四）结果，镜下观察，凡凝成小块，动力消失者为阳性，反之为阴性。

四、荧光菌球试验

（一）原理

相应抗体加在霍乱弧菌的培养液中，呈相互结合，但弧菌不被杀死，在适宜温度下仍能生长，形成霍乱弧菌微小菌团，如抗体事先标记荧光，则形成霍乱弧菌荧光菌球。

（二）材料

1．标记有荧光素的霍乱弧菌抗体。

2．霍乱弧菌培养物。

3．碱性蛋白胨水。

4．接种环载玻片、盖玻片、酒精灯。

5．荧光显微镜、培养箱。

（三）方法

1．将霍乱弧菌接种于含有荧光抗体的碱性蛋白胨水中，37℃经6～8h增菌。

2．挑取上述培养物1接种环于清洁玻片上，放上盖玻片，在荧光显微镜下观察。

（四）结果

荧光菌球大而发亮呈圆球状，结构疏松，周围近似卷发状，随孵育时间增长，菌球结构致密，周围较圆，整齐，菌球周围有刺毛，有的如银丝状缠绕，孵育时间短时，菌球往往呈多形性。

五、血清学试验（玻片凝集试验）

（一）目的：生化反应符合霍乱弧菌需作玻片凝集试验进行定群、定型。

（二）材料

1．临床标本培养物（TCBS平板）。

2．实验材料：霍乱弧菌多价O1群血清及ABC因子血清。载玻片，接种环，生理盐水。

（三）方法与结果

取TCBS平板上可疑菌落与霍乱多价O1群血清作凝集试验定群，再用霍乱因子血清定型。

（李红橙）

第五节 副溶血性弧菌的微生物学检查法

副溶血性弧菌主要引起食物中毒，经烹饪不当的海产品引起，该菌还可引起浅表创伤感染，败血症等。

一、标本直接涂片染色镜检

（一）材料

1．标本：标本采取患者粪便，肛拭子，可疑食物。

2．实验材料：革兰染色液一套、鞭毛染色液一套、载玻片、香柏油、接种环、生理盐水，酒精灯、光学显微镜。

（二）方法

1．制作标本片、革兰氏染色、鞭毛染色、油镜观察。

2．悬浊法观察动力，运动活泼。

（三）结果

1．光镜下可见革兰氏阴性，呈弧状，杆状、线状等多形性，鞭毛染色可见菌体一端有单鞭毛。

2．悬滴法观察动力。

二、分离培养与鉴定

（一）材料

1．标本（同标本直接涂片镜检）。

2．实验材料

（1）培养基TCBS琼脂，无盐肉汤蛋白胨水3.5% NaCl肉汤（蛋白胨水）,6% NaCl肉汤（蛋白胨水），各种供生化试验培养基及试剂。

（2）生理盐水，2% NaCl。

（3）超净工作台或接种箱、接种环、酒精灯。

（二）方法 无菌操作，将标本接种于上述各种培养基中，置37℃温箱孵育24h后观察结果。

（三）结果 培养特性及生化反应。

三、毒力试验

（一）目的：判断副溶血性弧菌株毒力的强弱。

（二）材料

1．副溶血性弧菌TCBC琼脂培养物。

2．比浊管。

3．体重15～18g的健康小白鼠9只。

4．无菌注射器。

5．碘酒、酒精、无菌棉签。

6．解剖刀、镊子、剪刀等。

（三）方法

1．用生理盐水将细菌培养物稀释成10亿/ml的菌液，备用。

2．取小白鼠9只（体重15～18g/只），分为3组，编号。

3．第1组每只小白鼠腹腔注射0.05ml菌液，第2组每只小白鼠腹腔注射0.1ml菌液，第3组每只小白鼠腹腔注射0.2ml菌液。注射后，分别于4,8,12,24h各观察结果1次，若小白鼠死亡，则及时进行解剖，取心血进行培养，并根据小白鼠死亡情况判断结果。

（四）结果

1．强毒菌株：凡注射0.05ml组死亡2只或2只以上者。

2．中等强毒菌株：凡注射0.1ml组死亡2只或2只以上者。

3．弱毒菌株：凡注射0.2ml死亡2只或2只以上者。

四、血清学试验（玻片凝集反应）

（一）目的：生化反应符合副溶血性弧菌，需进行定群、定型，多用于流行病学调查。

（二）材料

1．临床标本培养物（待定菌）。

2．副溶血性弧菌K多价血清，单因子血清及K抗原相对应的O群血清。

3．生理盐水：2% NaCl溶液，3% NaCl普通琼脂斜面。

4．离心机。

（三）方法与结果

将生化反应证实为副溶血性弧菌的菌株转种于3% NaCl普通琼脂斜面37℃18h，再用2% NaCl溶液制成厚菌悬液，先以K多价血清与细菌悬液进行玻片凝集反应，在15min内观察结果，阳性者再以K多价血清中的单因子血清进行分型，O抗原凝集反应，则将洗下的细菌悬液在121℃灭菌1h，离心去上清液，再以2% NaCl溶液两次配成浓厚菌悬液，从已知K抗原相对应的O群血清进行玻片凝集试验。

（李红橙）

第六节 幽门螺杆菌的微生物学检查法

幽门螺杆菌在人群中的感染非常普遍，在胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡患者的胃黏膜中，本菌的检出率可高达80% ～100%。

一、标本直接涂片染色镜检

（一）材料

1．标本：临床标本：胃镜取胃黏膜活体组织。

2．实验材料：革兰氏染色液一套、载玻片、香柏油、接种环、生理盐水、酒精灯、光学显微镜、暗视野显微镜。

（二）方法

1．制作标本片，革兰染色，油镜观察。

2．悬滴观察形态和动力：将活检组织加微量生理盐水研碎，悬滴置暗视野显微镜下观察。

（三）结果

1．光镜下可见革兰氏染色阴性，菌体大小约0.5～1.0μm弯曲成弧形，S形或海鸥状。

2．悬滴暗视野显微镜下观察，HP形态典型，运动活泼（因菌体一端或两端有多根带鞘鞭毛）。

二、HP快速诊断试验：尿素酶试验

（一）材料

1．标本：

（1）胃活检组织标本。

（2）HP培养物（菌落）。

2．尿素酶试剂盒：由尿素、基质（琼脂或缓冲液），酚红指示剂（pH值6.8～8.0黄～红）等组成。

3．无菌镊子、接种环、酒精灯等。

（二）方法：将胃活检组织或一满接种环HP菌落放入含尿素酶试剂的试剂盒内，置37℃培养几分钟至24h，观察结果。

（三）结果：若试剂由正常的黄色变为红色即为阳性，表示有HP感染。反之，为阴性，无感染。因HP可产生高活性的尿素酶能分解试剂中的尿素。产生氨，使其变碱、使指示剂酚红由黄变红。

三、分离培养与鉴定

（一）材料

1．标本（同标本直接涂片镜检）。

2．实验材料：培养基：Skirrow弯曲菌培养基，1%甘氨酸培养基，3.5% NaCl培养基。

厌氧培养箱、无菌盐水、氧化酶试纸。

（二）方法：无菌操作，将标本接种于上述培养基中，立即置微需氧环境（或烛缸培养法）经37℃及42℃培养3～5d，注意保持湿度。

（三）结果：培养特性及生化反应。

（李红橙）

第七节 弯曲菌的微生物学检查法

对人致病的弯曲菌主要为空肠弯曲菌，该菌常通过污染饮食，牛奶、水源等被食入，主要引起胃肠炎和败血症。

一、标本直接涂片染色镜检

（一）材料

1．标本：临床标本：采取患者的粪便或血液。

2．实验材料：革兰染液一套、载玻片、香柏油、接种环、生理盐水、酒精灯、光学显微镜。

（二）方法

1．制作标本片、革兰染色、油镜观察。

2．悬滴检查（动力检查），取标本（空肠弯曲菌或粪便）加少许生理盐水混合制片，镜下观察动力。

（三）结果

1．革兰染色镜检可见革兰氏阴性，弯曲菌呈S形，短弧形或海鸥状。

2．悬滴法观察可见鱼群样运动或螺旋式运动。

二、分离培养与鉴定

（一）材料

1．标本（同标本直接镜检）。

2．实验材料

1）培养基：Skirrow弯曲菌琼脂平板，1%甘氨酸培养基，3.5% NaCl肉汤。

2）试剂：3% H2O2,1%马尿酸水溶液，氧化酶试纸。

3）其他厌氧箱（微需氧环境85% N2,5% O2,10% CO2）。

（二）方法 无菌操作，将标本接种于上述培养基中，置5% O2,85% N2,10% CO2等微氧环境，置37℃、42℃、25℃温箱培养24～48h观察菌落生长特性及进行生化反应。

（三）结果 培养特性及生化反应。

（李红橙）

第八节 常用的培养肠道细菌的培养基

1．甘油-盐水缓冲液：

（1）成分：NaCl 4.2g

K2HPO4（无水）3.1g

KH2PO4（无水）1.0g

甘油300ml

蒸馏水700ml

（2）制备：将上列成分加水溶解后矫正pH值至8.0加入0.2%酚红溶液0.5至1.0ml，使溶液呈粉红色，分装试管103.43 kPa（15磅）20min灭菌备用，如酚红红色消退，则变质不宜使用。

2．革兰氏阴性杆菌增菌液

（1）成分：胰蛋白胨20g

枸橼酸钠5g

去氧胆酸钠0.5g

磷酸二氢钾（无水）1.5g

磷酸氢二钾（无水）4g

氯化钠5g

葡萄糖1g

甘露醇2g

蒸馏水1000ml

（2）制备

1）上述各种成分混合后加热溶解，矫正pH值至7.0用滤纸过滤，并分装于试管内，每管约5ml。

2）高压灭菌68.95 kPa（10磅）15min，存于冰箱中备用。

3．中国蓝琼脂平板

（1）成分：2%肉膏液琼脂（pH 7.4）1000ml

乳糖10g

1%中国蓝水溶液10ml

1%蔷薇酸乙醇溶液10ml

（2）制备

制法：将乳糖加入已灭菌的肉膏溶液中，然后加热熔化。等冷至50℃左右，加入中国蓝，蔷薇酸溶液摇匀，倾注平皿。凝固后冷藏备用。

说明：

1）中国蓝为指示剂，其水溶液实行煮沸灭菌后备用。蔷薇酸是乙醇溶液，无需灭菌，但加入培养基时应避开火焰，以免燃烧。

2）中国蓝在酸性环境中呈蓝色，此培养基制成后，pH值约为7.4，呈淡紫色，过碱呈鲜红色，过酸呈蓝色都不适用。接种大肠埃希菌后，因分解乳糖产酸，故菌落呈蓝色。伤寒沙门菌、痢疾志贺菌等不发酵乳糖者，菌落无色或淡红色。蔷薇酸（玫瑰红酸）能抑制革兰氏阳性菌的生长。

4. S·S琼脂（沙门氏，志贺氏菌属琼脂）

（1）成分：肉膏液琼脂1000ml

乳糖10g

枸橼酸钠8.5g

硫代硫酸钠8.5g

10%枸橼酸铁溶液10ml

1%中性红水溶液2.5ml

1%煌绿水溶液0.33ml

胆盐8.5g

（2）制备：加热熔化已灭菌的肉膏液琼脂，再加入乳糖，枸橼酸钠，硫代硫酸钠，枸橼酸铁，使其趁热全部溶解，矫正pH值至7.0～7.2过滤，并补足失去的水份，继续煮沸10min后，加入煌绿，中性红溶液，摇匀，倾注于灭菌平皿中。

注：说明：

1）S·S琼脂配方较多，仅选择上述一例配方按通常方法制备。使用国产琼脂粉较方便，质量亦好。

2）中性红为指示剂，在酸性时呈红色，在碱性时呈淡黄色，一般肠道致病菌不分解乳糖，但分解蛋白胨。产生碱性物质，故菌落呈淡黄色。大肠埃希菌分解乳糖，产酸使指示剂变红，并使胆酸沉淀，故菌落呈红色。中性红可被光线破坏，应将培养基保存于暗处。

3）枸橼酸钠和煌绿能抑制大肠埃希菌的生长，枸橼酸钠不抑制肠道致病菌。煌绿和中性红对细菌都有一定的毒性。胆盐与枸橼酸钠、硫代硫酸钠合用时，能加强对大肠埃希菌的抑制作用，而胆盐又能促进沙门氏菌的生长。硫代硫酸钠能缓和胆盐对肠道致病菌的有害作用，并能中和中性红、煌绿的毒性，且能使大肠埃希菌的红色菌落颜色鲜明，枸橼酸铁也能中和中性红、煌绿的毒性作用。

5．伊红美蓝琼脂平板

（1）成分：肉膏汤琼脂（pH 7.4）100ml

2% 伊红水溶液2ml

乳糖1g

0.5%美蓝水溶液（灭菌）1ml

（2）制备：

1）加热融化琼脂（并加入乳糖1g）

2）待冷至50℃左右，加入伊红及美蓝溶液，混匀倾注平板，凝固后备用。

6．碱性蛋白胨水

（1）成分：蛋白胨20g

氯化钠8.5g

蒸馏水1000ml

（2）制备：

1）将上述成分混合，加热溶解，再加入15%的氢氧化钠溶液约10ml，矫正至pH值8.8～9.0。

2）煮沸过滤分装，经103.43 kPa（15磅）高压蒸汽灭菌15min备用。

3）用途：专供培养霍乱弧菌用。

4）说明

a．本培养基pH值较高，故能抑制杂菌生长，有利于霍乱弧菌生长。

b．本培养基中所用的蛋白胨，要有增菌作用才选用。

7．碱性胆盐琼平板

（1）成分：蛋白胨20g

牛肉膏5g

氯化钠5g

胆盐2.5g

琼脂20g

蒸馏水1000ml

（2）制法

1）将上述成分混合（琼脂除外），加热熔化，矫正至pH值至8.2～8.4，再加入琼脂。

2）经103.43 kPa（15磅）高压蒸汽灭菌20min取出，让其冷却至55℃左右。

3）倾注无菌空平板，冷却后即成。

（3）用途 供分离霍乱弧菌及E1-Tor弧菌菌用。

（4）说明

1）胆盐有抑制革兰阳性菌生长的作用。

2）高pH值能抑制其他肠菌的生长，却有利于霍乱弧菌及E1-Tor弧菌的繁殖。

3）在本培养基上，霍乱弧菌菌落透明而扁平，易与其他菌菌落区别。

8．双氢链霉素洗衣粉培养基

（1）成分：蛋白胨20g

氯化钠5g

洗衣粉2.5g

双氢链霉素500U

酵母浸膏5g

无水碳酸钠1g

1%亚碲酸钾溶液0.5ml

20%甘露醇10ml

琼脂20g

蒸馏水1000ml

（2）制备

1）将蛋白胨、酵母浸膏、氯化钠、无水碳酸钠、洗衣粉和蒸馏水混合加热溶解，调至pH值至8.4再加入琼脂，高压蒸气灭菌103.43 kPa（15磅）灭菌20min。

2）冷却至50℃时，再加入1%亚碲酸钾溶液和双氢链霉素及甘露醇，混匀，倾注无菌平板，存4℃冰箱备用。

（3）用途：作分离培养霍乱弧菌用。

（4）说明：此培养基双氢链霉素不能抑制霍乱弧菌，但能抑制其他革兰阴性杆菌生长，洗衣粉（十二烷基磺酸钠）可促使霍乱弧菌生长，又能抑制革兰阳性菌生长和抑制变形杆菌生长，所以，此培养是选择性培养基。

9．硫代硫酸盐-枸橼酸盐-胆盐-蔗糖（TCBS）琼脂

（1）成分：蛋白胨10g

枸橼酸铁10g

酵母膏粉5g

溴麝香草酚蓝0.04g

硫代硫酸钠10g

枸橼酸钠10g

琼脂14g

牛胆盐8g

蔗糖20g

蒸馏水1000ml

（2）制备：除指示剂和琼脂外，将各成分加热溶解于蒸馏水中，矫正pH值至8.6，加入指示剂和琼脂，煮沸至完全溶解，并倾注平板备用。

（3）用途：用于霍乱弧菌和副溶血性弧菌的分离培养。

10．我萋（Wagatsuma）血琼脂平板

（1）成分：酵母浸膏5g

氯化钠70g

蛋白胨10g

结晶紫溶液1ml

甘露醇5g

琼脂15g

K2HPO4 5g

蒸馏水1000ml

（2）制备：结晶紫除外，将上述成分加热溶解，矫正pH值至7.6装瓶，每瓶100ml,68.95 kPa（10磅）高压灭菌10min，待冷至50℃，每瓶加脱纤维羊血5ml混匀，倒入已凝固的营养琼脂平皿内，制成重层平板供当天用。

（3）用途：用于神奈川（Kanagawa）现象，鉴定副溶血性弧菌。

11. Skirrow's弯曲菌培养基

（1）成分：Ⅰ．蛋白胨15g

胰蛋白胨2.5g

酵母浸出粉5g

氯化钠5g

琼脂粉15g

蒸馏水1000ml

Ⅱ．甲氧苄胺嘧啶5mg

（TMP）10mg

万古霉素2500U

多黏菌素B 70ml

冻溶马血

（2）制备：

1）将成分Ⅰ混合，加热溶解，分装（每瓶100ml）,121℃高压灭菌15min后备用。成分Ⅰ实际上是Oxoid血琼脂基础，实验室有此干粉即可直接配制。本培养基用于分离弯曲菌。

2）临用前，加热熔解成分Ⅰ，冷至60℃加入TMP、万古霉素、多黏霉素B混合液和冻溶马血，混匀后倾注平板。

（李红橙）