附录8 吸光度及分光光度计的使用

物质的吸光度光度法是利用光电效应，测量透过光的强度，以测定物质含量的方法，物质吸光度的测量是用吸光光度计来完成的。吸光光度计在近紫外和可见光谱区域内对样品物质作定性和定量的分析，是理化实验室常用分析仪器之一。该仪器应安放在干燥的房间内，使用温度为5℃～35℃。使用时放置在坚固平稳的工作台上，而且避免强烈震动或持续震动。室内照明不宜太强，且避免日光直射。电风扇不宜直接吹向仪器，以免影响仪器的正常使用。尽量远离高强度的磁场、电场及发生高频波的电器设备。供给仪器的电源为220V±10%，49.5～50 Hz，并须装有良好的接地线。宜使用100W以上的稳压器，以加强仪器的抗干扰性能。避免在有硫化氢、亚硫酸氟等腐蚀性气体的场所使用。

下面介绍722型分光光度计的原理、结构及使用与维护。

一、仪器的工作原理

分光光度计的基本原理是溶液中的物质在光的照射激发下，产生了对光吸收的效应，物质对光的吸收是具有选择性的，各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱，因此当某单色光通过溶液时，其能量就会被吸收而减弱，光能量减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关系，也即符合于比色原理——比耳定律。

其中：T透射比；I0入射光强度；I透射光强度；A吸光度；K吸收系数；l溶液的光径长度；c溶液的浓度。

从以上的公式可以看出，当入射光、吸收系数和溶液的光径长度不变时，透过光是根据溶液的浓度而变化的，分光光度计的基本原理是根据上述之物理光学现象而设计的。

二、722型仪器的光学系统

722型光栅分光光度计采用光栅自准式色散系统和单光束结构光路。钨灯发出的连续辐射经滤色片选择聚光镜聚光后投向单色器进狭缝，此狭缝正好处于聚光镜及单色器内准直镜的焦平面上，因此进入单色器的复合光通过平面反射镜反射及准直镜准直变成平行光射向色散元件光栅，光栅将入射的复合光通过衍射作用形成按照一定顺序均匀排列的连续单色光谱，此单色光谱重新回到准直镜上，由于仪器出射狭缝设置在准直镜的焦平面上，这样，从光栅色散出来的光谱经准直镜后利用聚光原理成像在出射狭缝上，出射狭缝选出指定带宽的单色光通过聚光镜落在试样室被测样品中心，样品吸收后透射的光经光门射向光电管阴极面。

三、仪器的结构

722型分光光度计由光源室、单色器、试样室、光电管暗盒、电子系统及数字显示器等部件组成。光源为钨卤素灯，波长范围为330～800 nm。

1. 光源室部件：氢灯灯架，钨灯灯架，聚光镜架，截止滤光片组架及氢灯接线架等各通过两个螺丝固定在灯室部件底座上。氢灯及钨灯灯架上装有氢灯与钨灯，分别作为紫外和可见区域的能量辐射源。氢灯、钨灯的装卸更换请参阅光源灯的更换章节。聚光镜安装在聚光镜架上通过镜架边缘两个定位螺丝及后背部的拉紧弹簧，角度校正顶针使其定值。当需要改变聚焦光斑在单色器入射狭缝上下位置，可通过角度校正顶针进行调整。聚光镜下有一定位梢，旋转镜架可改变光斑在单色器入射狭缝左、右位置。为了消除光栅光谱中存在着级次之间的光谱重叠问题及当在紫外区域使紫外辐射能量进入单色器，在灯室内安置了截止滤光片组。截止滤光片组通过柱头螺丝固定在一联动轴上，改变滤光片组的前后位置可改变紫外能量辐射传输在聚光镜上的方位。轴的另一端装有一齿轮，用以齿合单色器部件波长传动机构大滑轮上的齿轮，使截止滤光片组的选择与波长值同步。

2. 单色器部件：单色器是仪器的心脏部分，布置在光源与试样室之间，用三个螺丝固定在灯室部件上。单色器部板内装有狭缝部件，反光镜组件、准直镜部件，光栅部件波长线性传动机构等。

狭缝部件：仪器入射、出射狭缝均采用宽度为0.9mm的等宽度双刀片狭缝，通过狭缝固定螺丝固定在狭缝部件架上，狭缝部件是用两个螺丝安装在单色器架上。安装狭缝时注意狭缝双刀片斜面必须向着光线传播方向，否则会增加仪器的杂散光。反光镜组件安装在入射狭缝部件架上，反光镜采用一块方形小反光镜，通过组件架上的调节螺钉可改变入射光的反射角度，使光斑打在准直镜上。

准直镜部件：准直镜是一块凹形玻璃球面镜，装在镜座上，后部装有三套精密的细牙调节螺钉。用来调整出射光聚焦于出射狭缝，以及出射于狭缝时光的波长与波长盘上所指示波长相对应。

光栅部件与波长传动机构：光栅在单色器中主要起色散作用，由于光栅的色散是线性的，因此光栅可采用线性的传动机构。722仪器采用扇形齿轮与波长转动轴上的齿轮相吻合，达到波长刻度盘带动光栅转动，改变仪器出射狭缝的波长值。另外在单色器由转盘大、小滑轮及尼龙绳组成了一套波长联动机构，大滑轮上的齿轮与截止滤光片转轴上的齿轮齿合，使波长值与截止滤光片组同步。光栅安装在光栅底座上，通过光栅架后的三个螺钉可改变光栅的色散角度。

3. 试样室部件：试样室部件由比色皿座架部件及光门部件组成。

比色皿座架部件：整个比色皿座连滑动座架通过底部三个定位螺丝全部装在试样室内，滑动座架下装有弹性定位装置，拉动拉杆能正确地使滑动座架带动四档比色皿正确处于光路中心位置。

光门部件：在试样室的右侧通过三个定位螺丝装有一套光门部件，其顶杆露出盒右小孔，光门挡板依靠其本身重量及弹簧作用向下垂落至定位螺母，遮住透光孔，光束被阻挡不能进入光电管阴极面，光路遮断，仪器可以进行零位调节。当关上试样室盖时，顶杆便向下压紧，此时顶住光门挡板下端。在杠杆作用下，使光门挡板上抬，打开光门，可调整100%进行测量工作。

光电管暗盒部件：整个光电管暗盒部件通过四个螺钉固定在仪器底座上。部件内装有光电管、干燥剂筒及微电流放大器电路板。光电管采用插入式G1030型端窗式光电管，其管脚共有14个，其中4、8两脚为光电阴极，1、6、10、12四脚为阳极。

四、仪器的安装使用

1. 使用仪器前，使用者应该首先了解本仪器的结构和工作原理，以及各个操作旋钮之功能。在未接通电源前，应该对于仪器的安全性进行检查，电源线接线应牢固。接地要良好，各个调节旋钮的起始位置应该正确，然后再接通电源开关。仪器在使用前先检查一下，放大器暗盒的矽胶干燥筒（在仪器的左侧），如受潮变色，应更换干燥的蓝色矽胶式或者倒出原矽胶，烘干后再用。

仪器经过运输和搬运等原因，会影响波长精度，吸光度精度，请根据仪器调校步骤进行调整，然后投入使用。

2. 将灵敏度旋钮调置“1”档（放大倍率最小）。开启电源，指示灯亮，选择开关置于“T”，波长调置测试用波长，仪器预热20分钟。

3. 打开试样室盖（光门自动关闭），调节“0”旋钮，使数字显示为“00.0”盖上试样室盖，将比色皿架处于蒸馏水校正位置，使光电管受光，调节透过率“100%”旋钮，使数字显示为“100.0”。

4. 如果显示不到“100.0”，则可适当增加微电流放大器的倍率档数，但尽可能倍率置低档使用，这样仪器将有更高的稳定性，但改变倍率后必须按③ 重新校正“0”和“100%”。

5. 预热后，按③连续几次调整“0”和“100%”，仪器即可进行测定工作。

6. 吸光度A的测量按③调整仪器“00.0”和“100%”，将选择开关置于“A”，调节吸光度调节器调零旋钮，使得使得数字显示为“.000”，然后将被测样品移入光路，显示值即为被测样品的吸光度的值。

7. 浓度c的测量：选择开关由“A”旋置“C”，将已标定浓度的样品放入光路，调节浓度旋钮，使得数字显示为标定值，将被测样品放入光路，即可读出被测样品的浓度值。

8. 如果大幅度改变测试波长时，在调整“0”和“100%”后稍等片刻，（因光能量变化急剧，光电管受光后响应缓慢，需一段光响应平衡时间），当稳定后，重新调整“0”和100%即可工作。

9. 每台仪器所配套的变色皿，不能与其他仪器上的比色皿单个调换。

五、仪器的维护

1. 为确保仪器稳定工作在电压波动较小的地方，220V电源预先稳压，宜备220V稳压器一只（磁饱和式或电子稳压式）。

2. 当仪器工作不正常时，如数字表无亮光，光源灯不亮，开关指示灯无信号，应检查仪器后盖保险丝是否损坏，然后查电源线是否接通，再查电路。

3. 仪器要接地良好。

4. 仪器左侧下角有一只干燥筒，应保持其干燥性，发现变色立即更新或加以烘干再用。

5. 另外有二包硅胶放在样品室内，当仪器停止使用后，也应该定期更新烘干。

6. 当仪器停止工作时，切断电源，电源开关同时切断。

7. 为了避免仪器积灰和沾污，在停止工作时间内，用塑料套子罩住整个仪器，在套子内应放数袋防潮硅胶，以免灯室受潮、反射镜镜面发霉点或沾污，影响仪器能量。

8. 仪器工作数月或搬动后，要检查波长精度和吸光度A精度等方面，以确保仪器的正常使用和测定精度。

六、仪器的调校和故障修理

仪器使用较长时间后，与同类型的其他仪器一样，可能发生一些故障，或者仪器的性能指标有所变化，需要进行调校或修理，现分别简单介绍如下，以供使用维护者参考。

1. 仪器的调整。

（1）钨灯的更换和调整：光源灯是易损件，当损件更换或由于仪器搬运后均可能偏离正常位置，为了使仪器有足够的灵敏度，如何正确地调整光源灯的位置则显得更为重要，用户在更换光源灯时应戴上手套，以防沾污灯壳而影响发光能量。722仪器的光源灯采用12V 30W插入式钨卤素灯，更换钨灯时应先切断电源，然后用附件中的扳手旋松钨灯架上的两个紧固螺丝，取出损坏的钨灯，换上钨灯后，将波长选择在550mm左右，开启主机电源开关，移动钨灯上、下、左、右位置，直到成像在入射狭缝上。选择适当的灵敏度开关，观察数字表读数，经过调整至数字表读数为最高即可。最后将二紧固螺丝旋紧。注意：二紧固螺丝为钨灯稳压电源的输出电压，当钨灯点亮时，千万不能短路，否则会损坏钨灯稳压电源电路元件。

（2）波长精度检验与校正：采用镨钕滤色片529纳米及808纳米二个特征吸收峰，通过逐点测试法来进行波长检定与校正。本仪器的分光系统采用光栅作为色散元件，其色散是线性的，因此波长分度的刻度也是线性的。当通过逐点测试法记录下的刻度波长与镨钕滤色片特征吸收. 波长值超出误差，则可卸下波长手轮，旋松波长刻度盘上的三个定位螺丝，将刻度指示置特征吸收波长值，误差范围（≤± 2 nm），旋紧三个定位螺丝即可。

（3）吸光度精度的调整：选择开关置于“T”，调节透过率“00.0”和“100.0”后，再将选择开关置于“A”，旋动“吸光度调零”旋钮，使得显示值为“.000”。将0.5 A左右的滤光片（仪器附）置于光路，测的其吸光度值。选择开关置于“T”，测的其透过率值，根据A=lg1/T计算出其吸光度值。如果实测值与计算值有误差，则可调节“吸光度斜率电位器”，将实测值调整至计算值，两者允许误差为±0.004 A。

2. 故障分析：

（1）初步检查：当仪器一旦出现故障，首先关主机电源开关然后按下列步骤逐步检查。

当开启仪器电源，钨灯是否亮。

波长盘读数指示是否在仪器允许波长范围内。

仪器灵敏度开关是否选择适当。

“TAC”开关是否选择在相应的状态。

试样室盖是否关紧。仪器调零及调100%时是否选择在相应的旋钮调节。

（2）初步判断：仪器的机械系统、光学系统及电子系统为一整体，工作过程中互有牵制，为了缩小范围及早发现故障所在，按下列试验可以原则上区分故障性质。

①光学系统试验：a. 灯电源开关按下，点亮钨灯。b. 仪器波长刻度选择在580 nm，打开试样室盖以白纸插入光路聚焦位置，应见到一较亮、完整的长方形光斑。c. 手调波长向长波，白纸上应见到光斑由紫逐渐变红；手调波长向短波，白纸上应见到光斑由红逐渐变紫。d. 波长在330～800 nm范围，改变相应的灵敏度档调节100%钮，观察数字表读数显示能达到100.0值。上述试验通过，光学系统原则上正常。

②机械系统试验：a. 手调波长钮330～800 nm往返手感平滑无明显卡住。b. 检查各按钮、旋钮、开关及比色皿选择拉杆手感是否灵活。上述试验通过，机械系统原则上正常。

③电子系统试验：a. 灯电源按钮按下，应点亮钨灯；b. 打开试样室盖，调节调零旋钮观察数字显示读数应为00.0左右可调。c. 选择波长580，灵敏度开关选择“T”档，关上试样室盖，此时调节100 %旋钮观察数字显示读数应为100.0左右可调。d.“T”“A”“C”转换开关选择“T”档，试样室空白，当完成仪器调零及调100%后选择“A”档，调节消光零旋钮观察数字显示读数应.000左右可调。上述试验通过，电子系统原则上正常。