第二章 工业酶的发现、发展和生产

第一节 酶性质的改造

一、概述

随着世界面临的挑战越来越大，对生物科技的发展要求越来越高，希望有更多更好的新型酶制剂出现。酶性质的改变，从应用的角度不外乎是活性、专一性和稳定性的改变，表现在反应条件上是更温和、适应条件更广泛和更容易使用；表现在产品中是纯度提高、副产物减少、生产成本降低和对环境造成的影响减少等。酶性能的变化对反应条件和产品的影响如图2-1所示。

本章从酶的发现开始，利用自然的生物多样性，包括从自然的传统分离筛选到新的应用反向基因学的分子筛选，到对不可培养微生物使用的环境基因的筛选和基因组筛选；然后讨论酶的改造和发展，其中包括使用直接进化方法来人工快速创造生物多样性或者采用基于对蛋白质结构了解而进行的理性设计等方式结合生物信息学的进步和大通量筛选而得到高性能酶分子的方法。最后讨论酶制剂生产的一些策略和方法。

二、酶的发现（酶的筛选，利用自然界的生物多样性）

1．传统的自然分离筛分

尽管生物技术发展较快，但利用自然界长久积累的生物多样性仍然是寻找特殊酶的非常重要的手段，而且是其他发展方法不能简单代替的。在火山、温泉、深海、高浓度盐湖和极地等地方分离到具有独特性质的极端酶，可在高pH、低pH或高温下仍起催化作用。从自然界的极端嗜热菌分离纯化的酶的基因，直接或在此基础上进行进一步改造，然后在其他生产菌系统中表达而进行工业化生产。实际成功的例子包括洗涤剂使用的蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶等。

2．分子筛选

如果已经确定某一物种产生某种酶，就可从相关的物种中寻找同源酶。这个过程要应用反向基因学。酶是氨基酸以一定序列结合的聚合物，而这个序列可以用N-端序列分析来得到。因为基因码是通用的，因此可以从一定基因码中核苷酸碱基的顺序来推断某种酶。用这些信息可以作为探针构建15～20个核苷酸（引物对）。通过应用引物对相关有机体中的染色体DNA进行PCR处理，同源基因就被放大和转移到宿主中，从而表达了同源体酶，打开了进化中隐藏的基因。这种方法可以得到具有功能性相同但氨基酸序列大大不同的酶。因此在实际应用中，这些酶的性质如温度、pH的稳定性可能很不同。通过这种方法可以完成相关的全部物种的筛选。这种方法的缺点是只能和已经存在的数据进行比较。但实际上，自然中只有少于1%的微生物被分离出来，被表征和描述的更是少之又少。

3．环境基因组筛选技术

由于从环境中得到的微生物只有低于25%的可以在实验室培养，此法利用环境基因组技术可从环境样品中提取DNA，直接回收16S rDNA序列，根据其序列来分析样品中是否包含新的细菌，也包括古细菌。对于真菌，则测定18S rDNA序列。这对于那些（实验室）不可培养微生物中的酶种发现有着重要意义。

4．基因组筛选技术

宏基因组技术的发展极大地扩展了微生物资源的利用空间，提高了获得新酶或新基因的效率。一些特殊或极端环境宏基因组文库已经构建，大部分文库为公共资源，对许多公用数据库如Gene Bank和Swissport等进行搜索，是获取基因序列、基因功能和各类酶的结构和功能信息的最重要手段之一。文库的构建结合特定的筛选方法可以高效批量地获得新编码基因。

关于各种筛选方法的详细介绍和综述可参照相关文献。

三、酶性质的改造（人工创造多样性）

虽然人们从自然界已经成功地筛选得到很多各种各样的酶，但这些酶还是很有限制性，这些酶还是不能满足工业上要求的一些极端操作条件，如更高的热稳定性、pH和其他化学品的耐受性等。进一步提高酶的性能的方法主要分成两个方向，直接进化和理性设计，创造出（更确切地说是制造出，因为有可能在自然界已经存在，只是我们不知道）更多的、我们可以把握的多样性。

在讨论对自然界的酶进行进一步改造之前，首先让我们来看一下酶分子的组成。酶是20种氨基酸组成的线性分子，一般的酶分子由300个以上氨基酸组成，因此组合的可能性是无限的。氨基酸链形成不同的空间构型如螺旋和折叠等，如图2-2所示。不同的氨基酸和氨基酸残基都会对结构和功能有不同程度的影响。

下面介绍酶分子性能改造的两种方法，直接进化和理性设计。

1．直接进化

自从20世纪90年代初，美国科学家Arnold发明了在试管内对目的酶基因进行随机突变的快速改造的方法。在接下来的20年间，定向进化技术在基因突变文库的建立和突变体筛选方法方面均获得了很大的发展。在实验室中模拟自然选择过程来进化人工环境中的酶，使其在自然界需要几百万年才能完成的进化过程缩短到几年、几个月甚至更短，加速了选择所需性能的酶的进化过程。这种方法通常不需要事先了解酶的空间结构和催化机制，理论上适用于任何蛋白质分子。该法是迄今为止最为有效的改造和获得新酶的方法。具体做法：通过从随机突变产生的大量突变体中筛选出理想的突变体。

基因突变文库容量大小及突变质量等是蛋白质定向进化的基础，高效筛选方法的确立，如高灵敏度、低筛选成本、相对较少工作量等是定向进化成功与否的关键。

2．理性设计（蛋白质工程）

理性设计需要对酶蛋白分子的三维空间结构和催化机理有非常充分的了解，通过改变个别氨基酸而对酶的结构进行精确的调控，从而获得具有所需催化活性的新酶。与“定向进化”相比，理性设计目的性更强，更为高效和快捷。

理性设计的方法真正始于20世纪80年代，杰能科科学家Estell等1985年在生物化学杂志（J. Biol. Chem.）上发表了文章Engineering an enzyme by site-direct-ed mutagenesis to be resistant to chemical oxidation。该文章被业界公认为蛋白质工程用于酶制剂改造的真正开始。文章在以前蛋白质结构研究的基础上启示关键氨基酸残基蛋氨酸222对于枯草杆菌蛋白酶的氧化失活有主要作用，作者采用通过定点突变的方法，用其他19种氨基酸代替蛋氨酸，来改变关键的氨基酸残基从而达到抗氧化的作用。特别是用丝氨酸、丙氨酸和亮氨酸代替蛋氨酸的情况下，枯草杆菌蛋白酶可耐1 mol/L双氧水而不失活。典型的成功例子还有：耐高温的、低pH的α-淀粉酶。α-淀粉酶的改造以提高其热稳定性和低pH稳定性的努力最引人注目。过去二十多年间，杰能科、诺维信不断推出性能优越的酶制剂，如SPEZYME FRED、Termamyl SUPRA（混合）、GC 358等。

理性设计最受关注的进步是α-淀粉酶的定点改造。第一个成功的例子是1998年杰能科推出的SPEZYME FRED。利用蛋白质工程、位点定向诱变及核苷酸变更，杰能科对地衣芽孢杆菌产淀粉酶（Bacillus licheniformis alpha-amylase, BLA）的研究发现代替N188S可提高该菌产的α-淀粉酶的热稳定性。同时蛋氨酸和苏氨酸残基的删除或代替，M15、W138或M197也对热稳定性有很大帮助。

图2-3中是用Molscript和Raster3D模拟的BLA的分子构象。可以带来稳定的突变位置以箭头示意出（M15, H133, H156, A181, N190, A209, M197, Q264）。R124和删除的两个氨基酸以箭头示意。

杰能科（丹尼斯克，现杜邦工业生物科技）对AmyS嗜热芽孢杆菌进行了如下改造：在242位置相对应的氨基酸位置进行替换，包含以下一项或多项变化：①一个或多个在如下位置的替换：349位置的半胱氨酸，428位置的半胱氨酸，97位置的谷氨酸，精氨酸，319位置的谷氨酸、精氨酸，358位置的谷氨酸、精氨酸，443位置的谷氨酸或精氨酸；②在与97,318,349,358,428或443氨基酸位置相对应的一个或多个氨基酸位置处的其他序列修饰；③在F178、R179、G180、I181、G182或K183位置或其成对位置处的一个或多个氨基酸的缺失；④在178、179、180、181、182或183氨基酸位置的一个或多个氨基酸的其他修饰；⑤N193F或V416G或这两者的替换；⑥在193、416或这两个位置处的其他修饰；⑦用丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸或亮氨酸残基替代在经修饰的α-淀粉酶变体的部分中存在的一个或多个脯氨酸残基；⑧用另一种天然存在的氨基酸残基替换经修饰的α-淀粉酶变体的部分中存在的一个或多个脯氨酸残基；⑨用丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或亮氨酸残基替代亲本AmyS样α-淀粉酶中存在的一个或多个半胱氨酸残基；⑩用另一种天然存在的氨基酸残基替换经修饰的α-淀粉酶变体的部分中存在的一个或多个半胱氨酸残基。其他改变细节请参考USP7541026, Alpha-amylase variants with altered properties。

使用差示扫描量热法比较几种变体和野生型酶在添加和不添加钙时的耐热性。在不另添加氯化钙的情况下，野生淀粉酶的热熔点为100.8℃，而变体S242 A、S242 E和S242 Q的 Tm分别为106.5℃、107.8℃和110.1℃，比野生淀粉酶最高提高9.3℃。在2 mmol/L氯化钙存在的情况下，野生淀粉酶的热熔点为106.8℃，而变体S242 A、S242 E和S242 Q的Tm分别为111.8℃、112.2℃和113.8℃，比野生淀粉酶最高提高7℃。两种的区别也表明钙的存在对该淀粉酶的影响相对小（表2-1）。

商业化非常成功的酶是GC358。GC358的优越性为其降黏度性质，当提及降黏度时，提及两个参数，除了最终黏度外，峰值黏度也是个非常重要的参数，峰值黏度过高，反应罐中的搅拌或喷射液化在处理高浓度物料时会造成较严重的后果，反应器或喷射停止（图2-4）。

事实上，实际应用中两种方法在新酶的发展过程中通常是互补的。酶的理性设计只有对酶分子催化机理的理解和空间结构的整体把握后才可以进行，因此虽然定向进化这样的非理性设计方法操作相对繁琐且目的性不强，但依然是获得新酶的主要方法。对直接进化结果中有益突变进行分析有利于加深对酶分子催化机理的理解，为进一步理性设计提供了条件，丰富了新酶设计的思路。相信未来理性设计方法与非理性设计方法继续相互融合与发展，会更快地得到更好的酶分子。

越来越多新酶的发展，要依靠直接进化和理性设计两种方式的结合，如图2-5所示。图中的箭头所示的这些改造通常要反复进行几轮，才有可能得到希望的性质。

酶的理性设计方法主要分为两种：基于实验结果的设计和计算机辅助设计。前者主要针对活性中心进行人为改造；近来随着计算机技术和生物信息学的发展，计算机辅助设计已经成为酶的理性设计的主要发展方向，尤其近期在酶的从头设计（de novo design）方面取得了一系列有趣的进展，但大规模、具有普遍意义的应用还有很多困难。

关于这方面的介绍，国内外有不少很好的综述可参考，曲音波对于纤维素酶的发现和改造也有很详细的讨论，在这里不再赘述。

在改造酶的过程中，一定要与实际的过程相结合，Woodley最近提出了要把蛋白质工程和过程工程结合的思路，如图2-6所示。

实际中，到底采取什么样的策略，时间和经济性是决定因素。举例，如一个酶分子由200个氨基酸组成，如果随机改变两个点，其可能性就是7183900；如果改变3个点则实验的数字增加到9008610600。

21世纪第一个10年，酶蛋白的点突变数目通常在1～5个；2010年以后，这个数字可能增加到30～40个。如LIPTOR曾经对含254个氨基酸的酶中的35个氨基酸进行了改造。依现在最好的情况，DNA合成的成本，每对碱基0.35美元，大约1000核苷酸基因300美元。要大规模操作仍然很昂贵。因此，在完全不知道结构的情况下，用直接进化来产生多样性，不但过程本身昂贵，后续的大通量筛选工作也非常耗时耗财。折中的办法是做一些努力在一定程度上了解酶的结构或表面结构，这样下面的工作就相对有针对性了。当然要在某种程度上弄清酶的结构，也同样要花费精力和财力。因此项目的紧迫性和预算都会影响具体采取的策略。

20世纪90年代后，工业酶的发现和发展随着生物科技和计算机技术的发展和成熟，开发周期越来越短。90年代时，随着分子生物学、生物信息学和大通量筛选的进一步发展，一个新酶从研究到商业化，需要5～10年时间；进入21世纪后，这个过程缩短到2年左右；现在这个过程只需要几个月或几个星期。不论怎样，充分利用自然的多样性进行直接改造，要有更有效的筛选方法，结构与定点改造的结合应该是未来发展的有效方法。

四、大通量筛选的优缺点

不论是采用理性设计还是直接进化，大通量筛选都是最后确定高性能酶分子的检测方法。虽然随着计算机技术、生物信息学和电子器械的发展，应用机械手每天可以处理成百上千甚至几十万上百万的样品分析，这极大加快了酶的筛选过程。然而大通量筛选中的潜在问题是为了快速、短时间能处理大量样品，在分析方法上要做某些妥协以适应这种快速响应，如用人工底物代替工业上真正的底物来进行快速反应。这样的做法对于不溶性底物，如淀粉和纤维素，在筛分生料酶和纤维素酶时就产生很大的问题。如果用不溶性底物，反应的均匀性就难以控制。采用荧光方法，虽然快速，但并不总是可靠。在筛选底物的性质时通常采用A+B原则，对于负负为正的候选分子基本没办法预测。此外的问题是这种高通量筛选方法的确定是基于酶制剂的某一性质，因此就可能错失很多其他重要的信息。就像运动员的筛选一样，在短跑上达不到顶尖水平的运动员，有可能在跳远或跨栏上有成就。酶制剂也一样，在某些条件、某种底物表现不好时，可能在合适的应用条件下就是明星。要发现这样的“千里马”，更主要的要靠应用试验。

五、酶制剂的生产

1．主要生产菌株

工业酶的生产绝大部分是由微生物发酵来生产，少量酶制剂由植物或动物的分泌物来提取。微生物来源中主要有细菌和真菌。当某一具有特定用途的新酶经如前一节讨论的某种/几种方法被筛选出来后，下一步的挑战就是要在以比供体菌株产量高上千倍的指标下生产出来。产酶的真菌和细菌的改造也要根据情况使用不同方法，如某些不需要基因的删除、蛋白质分泌的优化和工程菌的稳定、全基因组的改组，以及蛋白质组学、基因组学和宏基因组学等工具的应用。

一些情况是生产菌本身产酶，但要是敲除一些不希望存在的基因，如杰能科的新型高热稳定性、宽pH范围的糖化酶，是从里氏木霉得来的，因为这种菌也产生大量的纤维素酶，因此要把这些基因敲除。现在工业上使用的大部分酶是把产某种酶的基因通过基因重组技术放到生产用菌株中。常用的生产细菌是芽孢杆菌（Bacillus）、链霉菌（Streptomyces），常用的真菌是曲霉菌（Aspergillus）和木霉菌（Tri-choderma）。图2-7给出了工业上主要的生产菌株。这些菌株不但高产，而且经过多年的工业实践也被证明具有很好的安全性。高产对于经济性很重要，而安全性则可能决定商业化的进程或成败。

2．生产过程

生产过程总是由小到大，一般是从试管的5 mL到大生产的100t，如图2-8所示，同时也示意了对发酵液的处理，从而生产出不同类别的产品，如液体酶和颗粒酶。

3．酶系的表达和调控

工业用酶，在很多情况下并不是使用单一的酶种，通常几种酶之间有可以提高性能的协同作用。因此如果开发酶生产菌时就要考虑到这些，把不同的酶共同表达在同一生产菌中，就可能使生产成本明显降低。特别是纤维素酶类，酶系统复杂，因此需统筹考虑纤维素酶系的表达调控；启动子和信号肽序列的改造；纤维素/半纤维素酶系组分的过表达；纤维素酶表达调控蛋白的修饰与改造；产酶丝状真菌分子改造的新策略，如基因敲除；提高蛋白质分泌的优化与工程菌的稳定性；应用全基因组改组提高纤维素酶产量；比较基因组学预测纤维素酶/半纤维素酶基因；利用宏基因组学和生物信息学工具发现新的纤维素酶基因等技术。

以水解生物质的纤维素酶为例，经过十几年的努力，杰能科纤维素酶的生产成本降低到最初的20%，如图2-9所示。除了各种酶的特性提高而使效率提高从而减少添加量外，由于把几个活力共同表达到一个生产菌株中，从而节省了酶发酵的成本也是其中的重要原因之一。

六、工业常用酶生产菌

工业常用酶生产菌如表2-2所示。

第二节 酶制剂发酵生产技术

一、固态发酵

起源于我国古代酿酒生产时，利用木盘生产酿酒曲，以麸皮为原料，加入稻壳等辅料生产麸曲，经过不断改进和摸索，又发展为帘子曲和通风制曲。此方法设备简单，操作主要依靠人工，投资少，适合于规模不大、自产自用的酿酒厂，也可以生产酶制剂，至今在我国还有为数不多的工厂生产粗酶制剂，品种主要有糖化酶、蛋白酶和纤维素酶等。

（一）固态发酵法的特点

（1）培养基为固体，没有游离水，活性不可能大幅提高。

（2）固态配料下生长处于不均匀状态，因而产品活力不均匀。

（3）固态通风阻力小，能源消耗小，成本低。

（4）设备简单，操作简便，但劳动强度大。

（5）提取工艺简单，生产品种受到制约。

（6）适合饲料酶制剂应用。

（二）固态发酵工艺

（三）固态发酵设备

固态发酵设备众多，一般多可满足物料的灭菌、冷却接种、发酵、通风、保温、拌料、补水干燥等操作。采用固态发酵设备，设备投资费用小，设备简单，无需复杂的附属设备，操作简便、效率高，适于中小工厂生产通常的固体酶。

1．浅盘式反应器

在一个培养箱或培养室内放置多层架子，浅盘分层叠放在架子上，浅盘之间有一定的间隔。浅盘一般由木制、铝制、不锈钢制造，浅盘上面敞口，底部开孔（有些木制的不开孔）。有些木盘中间仅有几个横挡，用竹帘、布条或者柳条编制的盘底，以利于通风。通过培养箱或培养室来控制温度和湿度。

操作需要大量劳动力，劳动强度比较大，产量也小，在一些小型工厂会采用此法操作。

2．填料床式反应器

填料床式反应器是一个圆筒式反应器，反应器内置一块或者几块筛孔板，板上堆积需发酵的物料，采用强制通风的方式，使罐内有一定的压力。空气从底部流入，通过物料层，从顶部排出。用空气来保持反应器内的温度和湿度，进行固体发酵。采用这种反应器，产量增大，操作简便，被中小厂所采用。

3．转鼓式反应器

这种反应器是外转鼓转动，反应器可设冷却水夹套，通过恒温水来控制物料温度。转鼓内可安置补水装置，补充培养过程所需水分。空气不是直接进入物料层，而是从轴心进入顶空层，空气入口的位置对于反应器内空气的流动性有很大的影响。该设备的特点是没有搅拌的部件，故设计、制造和操作都很简单，压力低，费用也低，培养基灭菌、接种和通风培养均可在反应器中进行。

4．连续翻料强制通风型生物反应器

连续翻料强制通风型生物反应器是采用机械搅拌方式，主要依靠进口温度、湿度、流量、搅拌强度来控制发酵的进行。

气-固流化床式反应器：物料处于固定床静止状态和气流输送状态之间的流化状态。该方法是以向上流动的气流使颗粒或粉粒物料维持悬浮状态形成流化床而培养微生物的方法。气体从设备底部分布回流，其流速和流量应保证固体颗粒流态化，气体从设备顶部流出。流化床反应器是最能保证物料处于均匀状态的固态发酵设备。

5．厚层通风发酵池

这是固态发酵常用设备，在酿酒和食醋上都采用这种常见设备。该设备具有“实用性、广泛性、经济性”，因此被固体发酵工厂广泛使用。

6．最新固体发酵设备

固体发酵罐广泛应用于医药、食品、酿造、生物肥料、生物饲料等各种发酵领域，多为卧式罐。无锡健一机械装备有限公司在固体发酵设备上取得了不错的成绩，其设备已销往台湾。生物固体发酵罐由传动系统、外夹套、内筒体、加热、灭菌、冷却系统、喷淋装置等部分组成。

机械传动系统：可根据实际情况，任意选择搅拌转速。加热、灭菌、冷却系统：加热冷却可通过外夹套、罐内的外螺旋片、空心搅拌轴进行冷却加热，且冷却加热效果好，冷却降温时间短，高温灭菌过程中加热蒸汽不直接接触发酵载体，从而使发酵物料在罐内保持合理的湿度，在罐体中部装有温湿度计，可随时掌握罐内发酵的温度和湿度情况。罐体下部两侧装有无菌空气进口，空气经过螺旋片纵向、径向运动轨迹，可均匀分布于罐底部，达到物料与无菌空气充分接触、充分混合的目的。罐顶装有喷淋接种装置，既可接种，也可在发酵过程中及时调节固体物料湿度。

固体发酵罐的特点：①可进行固体发酵；②可作固体混合机使用；③可进行高温灭菌；④可作高低温烘干机用；⑤管路上接真空泵可作真空干燥机使用（图2-10）。

二、液态发酵

液态发酵是利用液体作为培养基，经过空气接触进行的发酵过程。液体发酵有两种类型：一是液体表面发酵法；二是液体深层发酵法。目前酶制剂厂都是采用深层发酵法来生产酶制剂，这是因为液体深层发酵法有其特点，表面发酵法基本不用。

（一）液体深层发酵的特点

液体深层发酵法其产量大。发酵罐在1995年以前一般采用20m3的发酵罐；到2000年，大多数新增的设备为60m3发酵罐；自2000年以来，新建厂特别是外资企业在国内都采用100m3以上的发酵罐。从发酵罐容积来看，容积越来越大，数量也越来越多，产量越来越高。

从发酵罐控制自动化的普及程度来看，对溶氧、pH、搅拌和温度可以实现全部自动控制。工艺参数稳定，发酵的酶制剂质量和活力稳定。由于对菌种、原辅料工艺参数可以做科学合理的变动，容易将科研成果及时转化为生产力，使酶制剂的生产水平大幅度提高。深层发酵染菌概率大为减少，全过程实现自动化控制，消除了死角，染菌机会极少。不少工厂已实现全年无倒罐，安全生产，从而使成本大幅下降。

深层发酵特别适合新品种酶的试制。在新的酶菌种试制过程中，应尽量排除各种干扰因素，使其在稳定的工艺环境中试制。一般采用“正交优选法”，可以正确设定工艺参数，最后确定最优工艺条件。放大生产基本条件不变，可试验出更优良的酶制剂。

深层发酵所利用的搅拌方式不断改革，可以达到比较理想的结果。空气净化系统的改革，使无菌空气质量更高，通过新型设备的改造，使通风效果不断提高，空气净度不断提高。通风量的减少既满足了酶制剂生产菌种好氧的需要，减少染菌概率，又降低了成本，这是固态发酵无法做到的（表2-3）。

（二）液体深层发酵工艺

液体深层发酵的工艺流程如下：

工艺影响发酵的主要因素如下。

（1）底物浓度 合适的浓度对发酵十分有利，浓度过大，则渗透压大，对酶菌种的通风和发酵起到阻止作用；浓度太低，则酶制剂活力含量会影响后道超滤浓缩负荷。对于不同菌种，有着不同的配方浓度。

（2）温度 不同酶菌种都有最适的生长温度，α-淀粉酶芽孢杆菌为37℃，米曲霉UV-11糖化酶培养温度为30～32℃。由于细胞内酶系统的不同，生长最适温度不等于积累代谢产物最多的温度，如青霉素生产菌的最适生长温度为30℃，但生产青霉素的最适温度为20～25℃。在发酵前期可以将其控制在较高的温度下，以利于菌体快速生长，而在发酵后期，则应将温度降低，以促进产物的生成。因此，对于生产菌种要掌握不同阶段的温度调整，才能提高产率和缩短发酵周期。

（3）pH大多数细菌的最适pH在7左右，霉菌偏向于微酸性。例如，生产α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌BF-7658，其pH为6.5～7.0，黑曲霉UV糖化酶菌种pH为4.0～4.5。生长最适pH和产物形成的最适pH可能并不一样，pH不同，有可能同一菌种产生不同的产品。

在培养液中逐渐积累酸性代谢产物使pH下降，就有可能抑制发酵甚至达到不适宜继续积累代谢产物的程度，这就必须调节pH。一般缓缓加入氨水，以保证代谢产物生成，也就是保证酶活性不断提高。

（4）通风 各种微生物对氧的要求是不同的，有好氧菌、厌氧菌、兼性厌氧菌三类，多数的真菌、细菌、霉菌都是好氧菌。好氧菌在不同的生长阶段需氧量是不同的，黑曲霉发酵生产柠檬酸在生长菌丝的发酵前期通风量最小，在后期需要加大通风量以提高产酸速度。

（5）其他 营养微生物生长过程中需要能源、碳源、氮源、生长因子以及一些金属元素，各种微生物要求也是各不相同。营养物质不是越丰富越好，有时会适得其反。黑曲霉在生产柠檬酸时，需要较高浓度的碳源，而氮、磷等处于半饥饿状态，特别是铁、锰等重金属元素不得超过一定的限度，否则只长菌丝而少产酸。

（三）工艺空气系统

空气处理系统是深层液体发酵的基础和必要条件。空气经过一系列的优化和无菌处理，才能作为发酵罐的气源，再经过2～3道无菌处理工序，才能达到无菌空气要求。因此，空气处理系统是影响发酵的前提（图2-11）。

空气首先经粗过滤器1滤去较粗大的颗粒后被吸入空气压缩机2，压缩后空气温度升高，故采用列管式冷却器3（一级冷却）予以冷却，此时空气中含有的大部分水分很快被冷凝下来，通过气液分离器4后进入储气罐5，在储气罐中空气被减压并维持所需压力，在进入总过滤器8以前，一般还要经过第二级冷却器6和去雾器7以除去更多的水分。有时还采用加热器，将经二级冷却后的空气加热至发酵温度，并可使空气干燥，从而保证过滤介质的过滤效率。

空气在常压下水分含量较低，如在南方地区T=30℃时，相对湿度70%，若经压缩至0.4MPa，空压机出口温度约144℃，此时相对湿度0.083%，经过一级冷却器冷却至49℃，相对湿度即达到100%，同时放出冷凝水，将冷凝水分离后空气的相对湿度仍然是100%，如果经过管道进入过滤器，那么温度会再降低很快达到露点又会析出冷凝水使过滤介质受潮。因此，单单采用一级冷却器并不能完全保证空气干燥，必须进行再冷却，使空气温度降低到室温以下，相对湿度降低到60%左右，再将其加热到发酵温度后进入过滤器，这样才能确保过滤器中的空气不致再析出冷凝水。因为这个缘故，所以很多工厂都设有二级冷却器和加热器。

空气处理的流程和采用的设备随发酵无菌度的要求与所选用的空压机、过滤器的型式不同而有所不同。以上介绍的流程通常用于无菌度要求较高的场合，如谷氨酸、抗生素的生产，如果无菌度要求不高也可不用二级冷却器和加热器。另外如采用无油润滑的压缩机和防水性能好的过滤介质时，由于没有润滑油的污染问题以及过滤器稍微受潮影响也不太大，在这种情况下油水分离的要求就可以降低一些。

防止染菌是酶制剂厂的一项重要工作内容，尤其是无菌程度要求高的液态深层培养。从日本和我国有关酶制剂厂统计的染菌概率，大致相同，其中总过滤系统染菌所占比例20%左右。如何消除这个隐患，在生化设备上已做了大量的工作。

目前工业上空气除菌均采用过滤法，其流程大多数工厂为：空气吸气口 粗滤器 空压机 储罐 冷却器 油水分离器 加热器 总过滤器 分过滤器 种子罐或发酵罐。

如果采用以纤维状或颗粒状介质层为过滤床的过滤器，由于介质层中的空隙一般要大于50μm，远大于微生物个体，因此在这样介质层中除菌其实并不是真正的“过滤”，而是靠静电、扩散、惯性及拦截等作用除菌。起过滤作用的是微孔滤膜，空隙一般小于0.5 μm，空气中的微生物才能真正被滤除掉。但人们采用介质净化空气的过程，均习惯地称之为“过滤”。

迄今为止，总过滤器的过滤介质大多为棉花和活性炭或玻璃纤维。填充纤维介质的过滤器又称厚层过滤器。常用厚层过滤器的空气流速通常取棉花0.05～0.15m/s，棉花活性炭0.05～0.3m/s，玻璃纤维0.05～0.5m/s。据有关资料报道，华北制药厂以控制空气流速在0.2m/s左右来设计总空气过滤器的直径大小，过滤介质层的厚度按经验采用3～4m。上海第三制药厂设计的空气过滤器其流速较高，体积也较小，它所采用的空气流速在0.3～0.6m/s，过滤介质填充密度较大，过滤介质层较薄，总厚度小于1m，其中纤维介质层占1 /4～1 /3厚度。采用棉花纤维时，应用未经脱脂（脱脂棉花易于吸水而使体积变小）、压缩后仍有弹性、纤维长度适中（2～3cm）的棉花。通常过滤介质分为三层，上下两层敷设棉花，中间敷设棒状活性炭[3mm×（10～15 mm）]。加入活性炭的目的是为了减小过滤层的阻力（活性炭阻力约为棉花阻力的1 /12），还可吸附空气中的有害物质。采用玻璃纤维时，因其阻力较小，不需要用活性炭。棉花的填充密度为150～200kg/m3，活性炭为400～450kg/m3，玻璃纤维为200～260kg/m3。由于过滤器一般都比较庞大，敷设的方法应引起重视，敷设不匀，密的部分阻力大，松的部分阻力小，就会使较多的空气沿着阻力小的部分流出，形成短路，走短路的那部分空气没有经过充分过滤而带菌，将导致发酵染菌。纤维层装得太松，对过滤不利；太紧同样也会影响过滤效率。同时，在过滤介质用蒸汽灭菌时，太紧则蒸汽穿透力差，使灭菌效果不佳。所以用过分压实纤维层的办法试图达到增加过滤效率的目的，实际上适得其反。

采用棉花活性炭作过滤介质时，还要注意活性炭有可能受到气流的冲击，互相碰撞摩擦而破碎并逐渐灰化，最终引起由于体积减小过滤层倾斜甚至发生翻身的现象。这一问题如果发生，将造成严重的染菌事故。有经验的发酵工作者，在用蒸汽灭菌时，检查排出蒸汽情况可以判断过滤层是否存在问题，排出蒸汽均匀并呈青色、有力表示情况良好，排出蒸汽呈雾状、无力表明压得太紧。而当排出蒸汽连续不均匀以及进出口两侧的压力过小时则有可能是过滤层发生位移现象。还有一点须提及的，过滤器壁必须保持光滑。如器壁腐蚀生成氧化层（氧化铁是一种多孔物质），空气会在其中穿过而得不到过滤，使空气带菌造成染菌。

上述纤维状过滤介质，因玻璃纤维比棉花纤维阻力小，所以玻璃纤维是一种优于棉花的过滤介质。但玻璃纤维具有脆性，在温度变化时不耐蒸汽和气流的冲击，易破碎成粉状而失效。所以要选用性能好的材料制造玻璃纤维。人工装填时，还应采取防护措施，以防刺激皮肤和呼吸道黏膜，若能预先组成圆筒形的填料，填装时可减少或避免这种有害影响，并且应增加强度。

需要指出的是，采用这种厚层过滤器，存在不少缺点，诸如设备庞大，介质耗量大，阻力大，更换拆装不方便，劳动强度大等。因此，新的过滤介质的研究颇为活跃，而且，有的已在工业生产中应用或者试用，取得良好的效果。引人注目的有以下几种：超细玻璃纤维纸过滤器；维尼纶纤维空气过滤器（PVAF）；管式金属过滤器。

（四）发酵罐

通用发酵罐是目前大多数发酵工厂最常用的型式，所以称它为“通用式”。其容积可自20L至200m3，有的甚至可达500m3。

1．罐体各部的比例尺寸

目前，发酵罐普遍装有两组搅拌器，两组搅拌器的间距S为搅拌器直径Di的3倍。对于大型发酵罐以及液体深度HL较高时，为了使发酵液的各部均匀混合，就需要安装三组或三组以上的搅拌器，其间距可通过计算或试验决定。

最下面一组搅拌器通常与风管出口较接近为好，与罐底的距离C一般等于搅拌器直径Di，但也不宜小于0.8Di，否则将影响液体的循环。

中小型发酵罐的结构见图2-12（1），大型发酵罐的结构见图2-12（2）。

高径比：H0∶D=（2.5～4）∶1

封头高度：h=ha+hb

挡板宽度：W=0.1D

下组搅拌器与罐底：C=D

二组搅拌器间距离：S=3D

全容积：

式中 D——罐的内径

H0——圆柱部分高度

hb——椭圆形封头的直径高度

V1——圆柱部分容积

V2——封头容积

2．搅拌器功率

（1）不通风搅拌功率的设计

式中 Np——桨叶形式系数；发酵罐中发酵液都处于湍流状态，对于六直叶涡轮桨，Np=6.2，对于六弯叶涡轮桨，Np=4.8，对于六箭叶涡轮桨，Np=3.9

D——罐体直径，m

Di——搅拌器直径，m

n——转速，r/s

ρ——发酵液密度

P——功率，kg·m/s

（2）不通风多组搅拌器功率计算

对于两组搅拌器

对于三组搅拌器

式中 P1、P2、P3——一组、二组和三组搅拌器的搅拌功率

S——搅拌器间距，m

HL——液面高度，m

α, β——常数，实验求得α=0.3, β=0.86

（3）通风情况下搅拌器功率 通风情况下的搅拌功率也可用经验公式计算，称为密氏（Michel）公式。

式中 P——不通风情况下的搅拌功率，kW

n——搅拌器转数，r/min

Di——搅拌器直径，m

Q——通风量，m3/min

式中的常数K，随搅拌器的型式不同而有不同的值，通常可在试验时测定P和Pg后，用上式计算得到。根据资料介绍，认为对于通用的涡轮搅拌器可采用0.156。

3．搅拌形式

常用搅拌器主要有直叶形、弯叶形、箭尾形。圆盘直叶形搅拌效果是三种形式中比较好的，发酵醪混合均匀，湍流程度高，空气气泡小，溶氧高，但消耗功率大。圆盘弯叶形搅拌器溶氧度、发酵液湍流效果较直叶差，比箭尾形好一些，发酵醪混合效果比直叶好，在相同转速下，功率比直叶小。圆盘箭尾形搅拌器，除造成发酵液径向流动外，轴向流动也较剧烈，搅拌功率最小。

推进式搅拌器，将罐内液体向前或向后推进，使流体形成螺旋状运动的圆柱流，它的混合效果较好，对液体的剪切作用较小。

最近几年我国搅拌形式多种多样，各有利弊。但是一个好的搅拌形式，不仅要求新颖科学，同时加工精密度和平衡十分重要，同样形式的搅拌器，由于其加工精度不同，其动力消耗大不相同，动力消耗相差10%～20%。无锡江大益中生物工程有限公司对搅拌器进行了一定的深入对比研究，见表2-4。

（五）酶制剂提取和精制

1．发酵液的预处理

发酵液通过预处理可以降低黏度，使悬浮物絮凝沉淀下来，才可用压滤或者离心法进行有效分离。要使胶体粒子沉降，必须使粒子增大并中和电荷，有效办法是向发酵液中添加无毒性的无机或高分子聚凝剂。常用的聚凝剂电解质如Al2（SO4）3·18H2O（明矾）、AlCl3·6H2O、FeCl3、ZnSO4、MgCO3等在水溶液中可生成各种氢氧化物凝胶，具有很大的表面积，可吸附菌体、微粒色素和酶。羟基具有很强的电中和能力，在pH4～6时，电荷最大，中和能力最强，在pH6.6时效果最好。用凝胶方法预处理的成本最低。

目前最常用的聚凝剂是人工合成的高分子聚合物。有机合成的聚丙烯酰胺类和聚乙烯亚胺衍生物，具有用量少、聚凝体粗大、分离效果好、聚凝速度快等优点，适用范围广。商品聚丙烯酰胺（PAM）是非离子型，可转型成离子型状态。

近年来，聚凝剂的发展主要有：无机高分子聚合物（聚合铝盐、聚合铁盐），天然有机高分子聚凝剂（如壳聚糖、葡聚糖、明胶、骨胶、海藻酸钠等），微生物聚凝剂（糖蛋白、黏多糖、纤维素及核酸等）。天然絮凝剂和微生物聚凝剂最大的优点是安全、无毒和不污染环境。

在一般的工厂中大多使用廉价的无机盐进行处理，用CaCl2和Na2HPO4作聚凝剂，把菌体和其他不溶性粒子吸附并包埋在其中，可以大大改善过滤效果。

对酶液给予适当的温度并加入适当的护酶剂CaCl2、NaCl、Na2HPO4等对稳定酶活性和凝聚酶液中的杂蛋白有相当好的作用。发酵液是黏稠状溶液，黏度很大，含有大量的杂菌、有机物及钙、镁等无机离子，为此升高温度和添加护酶剂，可以降低发酵液黏度，起到保护酶活性的效果。各种酶对温度等要求不一样。BF-7658淀粉酶热力处理是在搅拌情况下加入无水CaCl20.8%，升温到50～55℃，热处理半小时，冷却到35～38℃，调节pH至6.7～6.8，则可盐析。而As1.398蛋白酶可在搅拌的情况下加入无水CaCl20.4%，升温至40℃，热处理半小时，冷却到30℃，调pH为6.5左右，便可盐析。

2．过滤

过滤设备很多，如板框压滤机、连续真空转鼓过滤机等，主要用于分离酵母、霉菌、培养基残渣及其他大颗粒固形物。发酵液经过预处理后可以改善过滤介质上的固体滤饼性质，提高过滤速率。

影响过滤速度的因素很多，介绍如下。

（1）微生物种类对过滤速度的影响 酵母菌、细菌、霉菌、放线菌等不同的微生物种类，它们的形态特征各不相同，导致它们的发酵液过滤特性大不相同，因此，过滤速度大不一样。

（2）发酵周期的影响 发酵阶段或发酵水平不同造成过滤速度不同，染菌的发酵液过滤就比较困难，过滤速度也较慢。

（3）培养基配方的影响 发酵液的过滤速度受到培养基中固体粒子的大小、形态、浓度、工艺和操作等的影响。固形物浓度越高，过滤越困难；发酵液黏度越高过滤难度随之升高；发酵液中产物含量不同，其过滤速度差异很大，发酵液中酶活性低，则过滤速度较慢。

（4）pH对过滤速度的影响pH与发酵液的性质关系较大，适当的pH会导致发酵液黏度下降，有利于提高过滤速度。

（5）温度对过滤速度的影响 一般适当升高料温可降低黏度，提高过滤速度。但温度不宜过高，过高会影响酶的活力。

（6）添加适当的助滤剂 可明显改善发酵液的过滤速度，但过多的话，助滤剂会对酶有吸附作用，降低了酶的收率。

（7）操作压力的影响 控制合适的操作压力有利于滤层的形成。操作压力增大过滤速度越快；但压力过高，会导致滤饼紧密，从而降低了过滤速度；压力太低，单位时间内过滤的量就减少。

（8）工艺操作的影响 正确的工艺操作有利于提高过滤速度。实际生产中，常采用自流再自行升压的工艺操作，以便形成良好的滤层，获得较好的过滤效果。

（9）板框压滤机 最常用的过滤设备。其操作简单，过滤面积大，动力消耗小，适用范围广，过滤和洗涤质量好。但设备较笨重，间歇操作，劳动强度大，占地面积多且生产效率低。

3．浓缩

通过浓缩可以提高浓度，缩小面积。合适的浓缩方法可以提高回收率，又可以提高酶的稳定性，减少沉淀所用的中性盐或有机溶剂的量。工业上常用的浓缩方法有超滤、真空蒸发、盐析或溶液沉淀法、离子交换树脂法等。采用蒸发浓缩时，发酵液中所有可溶性物质都保留在酶液中，有利于酶的稳定性，但杂质较多，不利于干燥酶的制备。超滤在常温下进行，可避免变性，小分子物质被滤去，因此酶液较净，黏度也低，适合液体酶的生产。

4．酶的提取

（1）中性盐沉淀法（盐析法）沉淀酶的中性盐有（NH4）2SO4、MgSO4、NH4Cl、Na2SO4、NaCl等，它们能破坏酶蛋白的胶体性质，促使酶蛋白沉淀。因（NH4）2SO4沉淀能力强，水溶性好，作用稳定，对酶无明显破坏作用，来源方便，可以回收，废液又可以作为肥料，因此，大多数生产固体酶的企业都采用。生产可先把酶浓缩后再盐析，减少了（NH4）2SO4的用量，节省了成本。

盐析时加（NH4）2SO4的速度以能及时溶解为宜，防止过多而积聚罐底，造成不完全溶解或者局部盐浓度过高，而使酶失活。不断搅拌有利于硫酸铵的溶解和与酶的接触，加速胶体溶液的破坏，加快酶的沉淀。一般采用50～80r/min为宜。转速过慢不利于相互接触，妨碍收率；转速过快，酶蛋白形成颗粒，不利于过滤。

（2）有机溶剂沉淀法 在低温下，用乙醇、丙酮、甲醇等有机溶剂能达到分离、提纯酶的目的。有机溶剂破坏了蛋白质分子的水化层，使蛋白质分子凝聚而沉淀析出。有机溶剂的主要作用是降低溶液的介电常数，由于分子间的静电引力和溶剂的介电常数成反比，有机溶剂的加入使蛋白质分子间引力增加，溶解度降低，易于凝聚。

在一定的条件下，使酶蛋白在有机溶剂中沉淀下来，较易达到提纯的目的，因此有机溶剂沉淀法所得到的酶纯度较高，多用于医药和食品行业。由于有机溶剂往往能使蛋白变性，所以所有的操作过程都在低温下进行，以减少酶活力损失，搅拌要均匀，防止局部浓度过高，沉淀时间不宜过长，以减少酶的变性。

根据酶制剂的特性，选择有机溶剂，大多数采用酒精。在操作过程中，温度是主要因素。操作应在0℃以下进行，沉淀析出后应尽快在低温下离心分离，pH应选择靠近酶的等电点，适当地添加某些中性盐，如5%～10%的硫酸铵，往往有利于提高分离效果。

5．干燥

（1）喷雾干燥 喷雾干燥有三种形式：喷雾离心干燥、压力喷雾、气流喷雾。国内酶制剂厂大多采用喷雾离心干燥。喷雾干燥是用雾化器将料液滴分散于热气流中，使水分迅速蒸发而成为粉粒干燥制品。喷雾离心干燥是料液通过高速的离心盘而变成雾状，与高温蒸汽进行热交换，而短时间达到干燥成品的目的。

（2）气流干燥 气流干燥是常用的干燥方法，它把含水的物料，通过适当的方法，使之分散到热气流中，在与热气流并流输送的同时进行干燥而获得颗粒状干燥制品。

（3）沸腾干燥 沸腾干燥又称流化床干燥，固体颗粒或者粉末被热气流吹起，在悬浮状态下与热气接触而得到成品。

沸腾干燥器形式很多，常用的为卧式多室沸腾干燥器，它具备出料方便，成品含水均匀，物料顺序前进，水分由多变少，设备结构简单等特点。作为常用设备，一般与其他干燥设备联合使用。

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